宋 雪，趙 格，王 娟，黃秀梅，蓋文燕，趙建梅，曲志娜，李月華，張林波，王君瑋

豬肉中常見致病菌的多重直接PCR法的建立與應用

宋 雪1,2，趙 格1，王 娟1，黃秀梅1，蓋文燕1，趙建梅1，曲志娜1，李月華1，張林波2，王君瑋1

目的建立檢測大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌和小腸耶爾森氏菌5種致病菌的多重直接PCR方法。方法根據(jù)大腸桿菌phoA、沙門氏菌invA、金黃色葡萄球菌nuc、李斯特菌hly、小腸耶爾森氏菌ail的基因序列，設計多重直接PCR引物，建立并優(yōu)化多重直接PCR反應條件，檢測引物的擴增特異性和靈敏性，并將所建立的方法應用于實際采集豬肉樣本的檢測，與金標培養(yǎng)法相比較，計算多重直接PCR檢測法的敏感性、準確性以及陽性預測值。結果所設計的多重直接PCR引物對5種菌都有特異擴增，最低檢出限量大腸桿菌為10 CFU，金黃色葡萄球菌敏感性為100 CFU，沙門氏菌、李斯特菌、小腸耶爾森氏菌敏感性可達1 CFU。60份豬肉樣本中檢出大腸桿菌15份、沙門氏菌6份、金黃色葡萄球菌21份、李斯特菌20份、小腸耶爾森氏菌35份，陽性檢出率均高于金標培養(yǎng)法，總體檢測敏感性為100%，準確性為94%，陽性預測值為81.44%。結論多重直接PCR法實現(xiàn)了同時對各食源性致病菌敏感特異的檢測，并且省去了提取模板的步驟，將檢測時間縮短至3 h左右，便于食品安全風險監(jiān)測中常見食源性致病菌的通量檢測。

多重直接PCR；豬肉；食源性致病菌

食源性疾病大部分是由食品中污染的致病菌引起的[1]。大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌和小腸耶爾森氏菌都是食品污染的常見致病菌，可導致細菌性食物中毒，引發(fā)多種疾病，甚至死亡。有文獻顯示，在我國致病菌引起的食物中毒事件中，70%～80%是由沙門氏菌引起的[2]。全球每年大約9 380萬胃腸炎病例為沙門氏菌感染引起[3-4]。大腸桿菌分為致病性大腸桿菌和非致病性大腸桿菌。在致病性大腸桿菌中O157∶H7以其高致病性引起了國內(nèi)外的廣泛關注。根據(jù)前人的研究統(tǒng)計，O157∶H7在畜禽類產(chǎn)品中的污染率最高可達到43.8%，并且在豬肉、雞肉、牛肉、羊肉、雞蛋中均分離得到了O157∶H7[5]。李斯特菌在自然界分布極其廣泛。李斯特菌雖然發(fā)病率不高，但是死亡率可達到30%左右[6]。美國每年約有2 600人感染單增李斯特菌，其中約1 500人罹患李斯特菌病住院治療，約260人死亡。在我國李斯特菌在畜禽產(chǎn)品中的檢出率為1.5%～21.1%，屠宰環(huán)節(jié)豬胴體中的檢出率高達40%[7-8]。我國相關調(diào)查顯示在生鮮肉中金黃色葡萄球菌的污染率為7.7%～32.9%[9]，在生鮮奶中其污染率高達11.5%～40.9%[10-11]。小腸耶爾森氏菌是少數(shù)幾種可以在冷藏溫度下繼續(xù)生長的致病菌之一。近幾年來，國內(nèi)外均有報道人類感染小腸耶爾森氏菌死亡的事件。近年來越來越多的人關注食品安全問題，特別是關于動物產(chǎn)品質(zhì)量安全的檢測。所以如何快速靈敏的檢測出這些食源性致病菌的存在已經(jīng)成為了越來越多的人關心的話題。

目前，對這些致病微生物的檢測，更多的是用細菌分離培養(yǎng)方法，即從樣品中先進行細菌的分離培養(yǎng)，再用生化方法鑒定。但細菌培養(yǎng)法存在了很多弊端，檢測周期長，一般需要4～7 d；操作繁瑣；靈敏度低；一次只能檢測一種病原菌等[12]。因此，建立一種方便快速、靈敏度高、特異性強的檢測方法刻不容緩，這對預防和控制食源性疾病的發(fā)生和流行至關重要。由于PCR方法特異性強、靈敏度高、操作簡單，所以采用在常規(guī)PCR基礎上改進并發(fā)展起來的多重直接PCR技術，利用一種特殊的聚合酶開發(fā)的直接PCR反應酶，在同一反應體系中加入多對引物進行擴增，可以擴增出多個目的條帶，這一技術建立一種不經(jīng)過細菌培養(yǎng)、DNA提取的快速準確檢測大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、小腸耶爾森氏菌方法，并成功應用于實際樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 大腸埃希菌標準株、腸炎沙門氏菌標準株、金黃色葡萄球菌標準株、單增李斯特氏菌、小腸耶爾森氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲桿菌、腸球菌保存于中國動物衛(wèi)生與流行病學實驗室。60份豬肉樣本采集于A市各大超市。

1.1.2 主要試劑與儀器 生物安全柜(萬心順昌科技有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海愛朗儀器有限公司)、快速渦勻器(中外合資深圳天南海北有限責任公司)、PCR儀(美國BIO-RAD公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)、Gel Doc XR凝膠成像分析儀(美國BIO-RAD公司)。

胰蛋白大豆棟、細菌瓊脂粉購于北京陸橋技術有限公司。DNA Marker DL2000、GoTaq○RGreen Master Mix、MightyAmp○RDNA Polymerase Ver.2購于TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成 分別下載20個GenBank收錄的不同分離株的大腸桿菌phoA、沙門氏菌invA、金黃色葡萄球菌nuc、李斯特菌hly、小腸耶爾森氏菌ail的基因序列，利用DNAman軟件進行同源性分析，選取同源性較高的區(qū)域，利用PrimerPlex 2軟件設計多重直接PCR引物(表1)。

1.2.2 多重直接PCR條件反應優(yōu)化 對實驗菌株進行DNA提取，設置不同的退火溫度和模板濃度，PCR反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，尋找最適的反應條件。然后確定多重直接PCR反應條件。

1.2.3 特異性擴增檢測 根據(jù)1.2.2的反應體系及優(yōu)化的反應條件，分別以大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、小腸耶爾森氏菌、志賀氏菌、空彎菌和腸球菌為模板進行多重直接PCR驗證。對引物進行特異性擴增。

表1 多重直接PCR引物序列和擴增長度Tab.1 Sequences and amplification length of multi-plex direct PCR primers

1.2.4 最低檢出限量檢測 將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌和小腸耶爾森氏菌分別調(diào)至108CFU，依次十倍稀釋至103、102、101、100CFU。分別以103、102、101、100CFU菌液為模板，進行多重直接PCR擴增，對引物進行最低檢出限量檢測。

1.2.5 多重直接PCR應用于臨床采集豬肉樣本檢測 在A市10個超市采集60份豬肉樣本，用勻漿機破碎，取破碎組織液5 μL為模板，利用直接PCR試劑盒進行直接PCR方法的臨床檢測。同時利用細菌培養(yǎng)法對5種食源性致病菌進行分離鑒定，并與多重直接PCR檢測方法結果相比較。計算檢測的敏感性、準確性，以及陽性預測值(敏感性=真陽性值/(真陽性值+假陰性值)×100%；準確性=(真陽性值+真陰性值)/總數(shù)×100%；陽性預測值=真陽性值/(真陽性值+假陽性值)×100%)。

1.2.6 細菌分離培養(yǎng)法

1)大腸桿菌：將樣品按照GB 4789.3-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗》進行分離鑒定。

2)沙門氏菌：將樣品按照GB 4789.4-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗》進行分離鑒定。

3)金黃色葡萄球菌：將樣品按照GB 4789.10-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗》進行分離鑒定。

4)單增李斯特氏菌：將樣品按照GB 4789.30-2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗》進行分離鑒定。

5)小腸結腸炎耶爾森菌：將樣品按照 GB/T 4789.8-2008《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗》進行分離鑒定。

2 結 果

2.1 多重直接PCR反應條件的優(yōu)化 多重直接PCR反應體系：Buffer：12.5 μL；模板DNA：5 μL；25 μmol/L上、下游引物5 μL(5對引物各1 μL)；MightyAmp○RDNA Polymerase Ver.2酶1 μL；用無菌超純水補充至體積為25 μL。

多重直接PCR反應條件：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后68 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2.2 特異性擴增檢測 分別以大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、小腸耶爾森氏菌、志賀氏菌、空彎菌和腸球菌為模板用混合的多重引物與其進行多重直接PCR擴增，觀察各對引物的特異性。電泳結果顯示在大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、小腸耶爾森氏菌為模板的甬道處出現(xiàn)明顯的目的條帶，且與其目的基因片段大小一致，而在志賀氏菌、空彎菌、腸球菌泳道處沒有出現(xiàn)任何條帶，說明特異性的擴增出了目的基因(圖1)。根據(jù)摸索出最佳的多重直接PCR反應條件，進行驗證，電泳結果顯示出在泳道內(nèi)出現(xiàn)5條明亮且單一的條帶，片段大小與目的基因片段大小一致(圖2)。

M：Marker DL2000；1：大腸桿菌；2：沙門氏菌；3：金黃色葡萄球菌；4：李斯特菌；5：小腸耶爾森氏菌；6：陰性對照；7：志賀菌模板；8：空彎菌模板：9：腸球菌M: Marker DL 2000; 1: E.coli; 2: Salmonella; 3: Staphylococcus aureus; 4: Listeria；5: Yersinia enterocolits; 6: negative control; 7: Shigella; 8: Campylobacter jejuni: 9: Enterococcus圖1 多重直接PCR擴增常見食源性致病菌的特異性檢測Fig.1 The specificity of multi-plex direct PCR for amplification of common food-borne pathogens

M：Marker DL2000；1：大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、小腸耶爾森氏菌混合模板M: Marker DL 2000; 1: Mixing template for 5 kinds of bacteria圖2 多重直接PCR同時檢測5種食源性致病菌的擴增結果Fig.2 Simultaneous detection of five food-borne pathogens using multi-plex direct PCR

2.3 最低檢出限量檢測 分別以5種病原菌的103、102、101、100CFU菌液為模板，用引物與其進行多重直接PCR擴增，測定最低檢出限量。電泳結果顯示出，大腸桿菌的最低檢出限量為10 CFU，金黃色葡萄球菌的最低檢出限量為100 CFU，沙門氏菌、李斯特菌、小腸耶爾森氏菌的最低檢出限量可達1 CFU(圖3)。

M：Marker 2000；A：大腸桿菌；B：沙門氏菌；C：金黃色葡萄球菌；D：李斯特菌；E：小腸耶爾森氏菌103 cfu、102 cfu、101 cfu、100 cfu多重直接PCR結果M: Marker DL 2000; A～E: Multiple PCR results of five bacteria圖3 多重直接PCR對5種食源性致病菌最低檢出限量檢測Fig.3 Minimal detectable limit of multi-plex direct PCR for five food-borne pathogens

2.4 多重直接PCR應用于臨床采集豬肉樣本檢測

采集的60份臨床豬肉樣本，同時進行細菌分離培養(yǎng)方法和多重直接PCR方法檢測，并以細菌分離培養(yǎng)方法結果為標準(圖4)。根據(jù)2種方法的檢測結果進行統(tǒng)計學分析，計算出多重直接PCR方法對5種病原菌檢測的敏感性、準確性，以及陽性預測值(表2)。并對結果進行分析。

圖4 多重直接PCR法、細菌培養(yǎng)法對豬肉樣品的檢測結果Fig.4 Results of multi-plex direct PCR and culture method for detection of pathogens in swine products

3 討 論

大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌和小腸耶爾森氏菌均是引起食物污染、導致食物中毒的重要病原菌[13]。近年來人們對食品質(zhì)量安全的關注度逐漸升高，其中肉類食用產(chǎn)品的安全尤為重要。由于肉類產(chǎn)品飼養(yǎng)環(huán)境較開放，易受到外界污染；生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)較復雜、小廠房作業(yè)較多，所以食品質(zhì)量難以保障。而且肉類產(chǎn)品食用范圍較廣，一旦引起食品安全事件，危害范圍大、易引起民眾恐慌、危害國家和人民切身利益和安全。所以如何快速準確的檢測食品中存在的各種致病菌成為了越來越多人研究的重點。

目前，對于食源性病原菌的檢測有多種方法，包括傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫膠體金法等[14-15]。這些方法優(yōu)點各異，但大部分方法都存在以下幾個問題：1)操作繁瑣、復雜，所需周期較長；2)每次只能檢測一種致病菌，對臨床上混合污染的情況不能通量快速檢測；3)靈敏度一般，對于感染初期的食品陽性檢出率差?；谝陨?點，建立一種快速簡便、特異性強、靈敏度高的可靠檢測方法，對食品中常見致病原的臨床快速診斷，具有重要意義。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，PCR方法由于其特異、快速、敏感的特點已經(jīng)成為了臨床上鑒定病原微生物、基因分型的重要方法[16]。但普通的PCR方法需要先用細菌培養(yǎng)方法特異性的培養(yǎng)目的菌，并對樣本模板進行DNA提取后進行PCR檢測。

表2 多重直接PCR法、細菌培養(yǎng)法檢測結果分析Tab.2 Analysis of the examination results of multi-plex direct PCR and culture method

這個過程耗時較長，也會造成樣本的損失。所以本實驗選用了在普通PCR技術基礎上改進發(fā)展起來的多重直接PCR技術。與其他檢測方法相比，多重直接PCR方法有以下2個優(yōu)點：1)在同一體系中加入多對引物，擴增出多條目的基因條帶，可一次性檢出多種病原菌，與其他檢測方法相比可以減少重復性工作，大大的提高檢測效率；2)省去了樣品前處理及提取DNA的繁瑣步驟，使得檢測更加快速，可在3 h內(nèi)對原始樣品完成檢測，同時樣品前處理的簡化也降低了PCR模板的污染，降低了假陽性[17]。多重直接PCR采用 MightyAmp Buffer Ver.2獨特的緩沖裂解液體系，可以直接裂解動物組織及其中的微生物并且在短時間內(nèi)釋放基因組DNA用于PCR擴增[18]。MightyAmp DNA Polymerase能直接以待測樣品裂解液為模板，進行高效特異性擴增[19]。多重直接PCR方法不僅特異性強，又方便靈敏，節(jié)約了時間和成本，也減少了操作所帶來的污染[19]。

通過本實驗的結果可以看出，多重直接PCR方法對食品中常見的致病菌進行檢測，目的條帶明亮清晰且無雜帶。大腸桿菌敏感性可達到10 CFU，金黃色葡萄球菌敏感性可達到100 CFU，沙門氏菌、李斯特菌、小腸耶爾森氏菌敏感性均可達到1 CFU。這個結果比王慧[20]、劉繼超[21]、許一平[22]等人用的多重PCR、免疫膠體金技術等的敏感性要好。與姜侃等[23]人用三重LAMP法檢測食品中的常見致病菌的敏感性相一致。這說明多重直接PCR方法的特異性強，敏感性高，可以滿足臨床上對食源性病原菌的快速診斷。而通過多重直接PCR方法與細菌培養(yǎng)法相對比的結果可以看出，多重直接PCR法的陽性檢出率比培養(yǎng)法要高，敏感性、準確性都在80%～100%之間，在不經(jīng)過樣品前處理和提取DNA的前提下，多重直接PCR方法比培養(yǎng)法更敏感，可以檢測出樣品中含有的微量病原菌。

綜上所述，多重直接PCR法是實驗室檢測食源性致病菌的一項實用性的新技術，且具有操作簡單、耗時較短、準確性較高的優(yōu)點[21]，同時也為食品中病原菌的風險評估和流行病學調(diào)查提供了可靠方法。

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EstablishmentandapplicationofmultiplexdirectPCRforrapiddetectionofcommonfoodbornepathogensinswineproducts

SONG Xue1,2, ZHAO Ge1, WANG Juan1, HUANG Xiu-mei1, GAI Wen-yan1, ZHAO Jian-mei1, QU Zhi-na1, LI Yue-hua1, ZHANG Lin-bo2, WANG Jun-wei1

(1.DepartmentforSafetySupervisionofAnimalProducts,ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter/LaboratoryofQualityandSafetyRiskAssessmentforLivestockandPoultryproducts(Qingdao),MinistryofAgriculture,Qingdao266032,China; 2.CollegeofLifeScience,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

We established a multiplex direct PCR for rapid detection ofE.coli,Salmonella,Staphylococcusaureus,ListeriaandYersiniaenterocoliticabacteria. Multiplex direct PCR primers were designed according to gene sequences ofphoA (E.coli),invA (Salmonella),nuc(S.aureus),hly(Listeria), andail(Y.enterocolitica). After the multiplex direct PCR were established, the specificity and sensitivity of primers were detected. Then, multiplex direct PCR was applied to examine 60 swine product samples, the detection specificity, accuracy and positive predictive value were calculated compared with the gold standard culture method. Results showed that multiplex direct PCR primers could be used for specific detection ofE.coli,Salmonella,S.aureus,ListeriaandY.enterocolitica, with the minimal detectable limit of 10, 1, 100, 1 and 1 CFU, respectively. For the examination of 60 swine product samples using multiplex direct PCR, 15 were positive forE.coli, 6 positive forSalmonella, 21 positive forS.aureus, 20 positive forListeria, and 35 positive forY.enterocolitica, with all positive detection rates higher than that of culture. The total detection sensitivity was 100%, accuracy was 94%, and positive predictive value was 81.44%. Multiplex direct PCR could be used for specific and sensitive detection of common food-borne pathogens, and the testing time was shorten to be 3 hours because of saving time for template extraction. Multiplex direct PCR might serve the detection of food-borne pathogens in food safety risk monitoring much better.

multiplex direct PCR; food-borne pathogens; rapid; sensitive

s: Wang Jun-wei, Email：yffs2000@sina.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.009

農(nóng)業(yè)部“國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估重大專項”(No.GJFP 2016007)資助、留學人員科技活動項目擇優(yōu)資助

王君瑋，Email：yffs2000@sina.com

1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心 農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(青島)，青島 266032； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，長春 130118

Supported by the Risk Assessment Major Project of National Agricultural Product Quality Safety, MOA(No.GJFP2016007) and the Technology Foundation for Selected Overseas Chinese Scholar, MOP, China

R378

：A

：1002-2694(2017)08-0710-06

2016-11-24編輯：李友松