張曉海 張洪濤 胡孝定 王曦?zé)?鐘華

柴胡皂苷D對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移抑制作用和Norrin、Livin的影響

張曉海 張洪濤 胡孝定 王曦?zé)?鐘華

目的 探討柴胡皂苷D對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移抑制作用和Norrin、Livin水平的變化。方法 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞）、低劑量組（SGC-7901細(xì)胞+5μmol/L柴胡皂苷D）、中劑量組（SGC-7901細(xì)胞+10μmol/L柴胡皂苷D）和高劑量組（SGC-7901細(xì)胞+20μmol/L柴胡皂苷D）。采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)各組細(xì)胞24、48、72h細(xì)胞增殖情況；采用TUNEL法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況；采用Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力；采用real-time PCR對(duì)各組細(xì)胞中Norrin及Livin的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Norrin、Livin、CDC25A、cyclin A2、p21和cyclin D1表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，低劑量組對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和Norrin、Livin、p21及cyclin D1的表達(dá)未產(chǎn)生明顯影響（P＞0.05），但可減低SGC-7901細(xì)胞CDC25A、cyclin A2表達(dá)（P＜0.05）；中、高劑量組SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用明顯，熒光TUNEL顯示凋亡率高于對(duì)照組（P＜0.05），Norrin及Livin mRNA表達(dá)減少（P＜0.05），CDC25A及cyclin A2表達(dá)具有抑制作用（P＜0.05），且具有劑量依賴性，對(duì)p21及cyclin D1無(wú)明顯影響（P＞0.05）。 結(jié)論 柴胡皂苷D可能通過(guò)Norrin、Livin的表達(dá)、干擾腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期、介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用，抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移能力。

胃癌柴胡皂苷D 凋亡 Norrin Livin SGC-7901細(xì)胞

胃癌在我國(guó)每年大約有50萬(wàn)例新發(fā)患者，在惡性腫瘤中發(fā)病率、死亡率均為順位第3位[1]。目前，手術(shù)及化療的治療效果并不能達(dá)到患者、醫(yī)生的期望[2]。因此，尋找治療胃癌的有效藥物不僅對(duì)患者具有一定的治療意義，而且具有重要的社會(huì)意義。柴胡皂苷是中藥柴胡的主要有效成分，研究證實(shí)柴胡皂苷D具有抗病毒、抗過(guò)敏、抗炎、抗腫瘤和抑制細(xì)胞黏附等作用[3]。Lee等[4]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷D對(duì)胃癌、乳腺癌、肝癌細(xì)胞均有較強(qiáng)的殺傷作用，其中對(duì)于胃癌細(xì)胞的殺傷作用最強(qiáng)。但目前對(duì)于柴胡皂苷D抗腫瘤機(jī)制的研究較少且不夠深入。Norrin和Livin是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)因子，與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲有密切關(guān)系[5-6]。筆者觀察應(yīng)用不同濃度柴胡皂苷D對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及對(duì)Norrin和Livin的影響，為柴胡皂苷D治療胃癌提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 柴胡皂苷D由天然產(chǎn)物化學(xué)及功能分子合成（內(nèi)蒙古自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）。SGC-7901細(xì)胞（美國(guó)ATCC公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；NO-501一氧化氮檢測(cè)儀（日本IMN公司）；WD-9405B型水平搖床（北京六一公司）；CDC25A、cyclin A2、p21、cyclin D1、β-actin內(nèi)參抗體（英國(guó)ABCAM公司）；Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒（美國(guó)SIGMA公司）；RPMI 1640（美國(guó)GIBCO公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 SGC-7901細(xì)胞加入到10%滅活FBS的MEM培養(yǎng)液中（條件：37℃；5%體積分?jǐn)?shù)CO2；飽和濕度），每2~3d傳代1次。將細(xì)胞懸濁液以6×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板，細(xì)胞融合80%~90%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞）、低劑量組（SGC-7901細(xì)胞+5μmol/L柴胡皂苷D培養(yǎng)30min）、中劑量組（SGC-7901細(xì)胞+10μmol/L柴胡皂苷D培養(yǎng)30min）和高劑量組（SGC-7901細(xì)胞+ 20μmol/L柴胡皂苷D培養(yǎng)30min）[7]。

1.3 四唑鹽比色法（MTT）檢測(cè)各組細(xì)胞抑制率 實(shí)驗(yàn)前用臺(tái)盼藍(lán)拒染法確認(rèn)SGC-7901細(xì)胞拒染率在95%以上，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4×107個(gè)/L，取200μl接種于96孔板中（每組細(xì)胞6個(gè)復(fù)孔），設(shè)對(duì)照組、空白對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入5g/L MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后去上清液，逐一加入DMSO 100μl后震蕩混勻，待藍(lán)色晶體完全溶解反應(yīng)后，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的吸光度值（OD值）。抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值）×100%[8]。

1.4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 在各組SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)48h后，將無(wú)血清培養(yǎng)液中的5×104個(gè)細(xì)胞置于Transwell的上層小室中，再取出1×104個(gè)細(xì)胞滴入無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，然后移至Transwell小室中層。孵化24h后，用無(wú)菌棉簽擦除小室內(nèi)細(xì)胞。用0.1%結(jié)晶紫染色20min，顯微鏡下取隨機(jī)視野經(jīng)行拍照計(jì)數(shù)，此實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)3次[9]。

1.5 TUNEL法檢測(cè)各組胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞經(jīng)過(guò)0.1%Trition X-100透化后，用PBS漂洗3次，每次漂洗5min，再滴加3%過(guò)氧化氫（H2O2）200μl，漂洗3次后，加入蛋白酶K工作液置于常溫下20min；漂洗3次后加入TUNEL反應(yīng)液（TdT+熒光素標(biāo)記的dUTP）37℃恒溫箱中避光孵育1h；PBS清洗3次后加入DAPI，再次應(yīng)用PBS漂洗3次，最后防熒光淬滅封片劑封片。隨機(jī)移動(dòng)組織切片，選取細(xì)胞分布較均勻的高倍視野計(jì)數(shù)1 000個(gè)以上，在相鄰的10個(gè)視野下，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，綠色熒光為凋亡細(xì)胞核，即陽(yáng)性細(xì)胞。凋亡指數(shù)（AI）計(jì)算：AI=各視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野所有細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi) Norrin及 Livin mRNA表達(dá) 經(jīng)過(guò)總RNA提取后進(jìn)行RNA濃度檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄后行real-time PCR檢測(cè)。每個(gè)樣品基行6個(gè)復(fù)孔平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果舍去較大誤差數(shù)值后選取剩余值平均值最為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△CT法分析數(shù)據(jù)。引物信息見表1。

表1 參照引物信息

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CDC25A、cyclin A2、p21、cyclin D1的表達(dá) 取培養(yǎng)48h細(xì)胞，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑PMSF，提取蛋白質(zhì)，測(cè)定濃度。取樣15μl以10%SDS-PAGE電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜后脫脂奶粉封閉，加一抗anti-CDC25A（1∶500）、anti-cyclin A2（1∶500）、anti-p21（1∶200）及anti-cyclin D1（1∶500）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗脫5min×3次，HRP-山羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育2h，TBST洗脫10min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯像，并讀取灰度值[10]。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參蛋白的灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞抑制率的比較 與對(duì)照組比較，低劑量組細(xì)胞的增殖未受到明顯抑制（P＞0.05），中、高劑量組與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖則受到明顯抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；高劑量組與中劑量組相比，細(xì)胞增殖受到的抑制更為明顯（P＜0.05），詳見表2。

表2 各組細(xì)胞增殖及凋亡的影響

2.2 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果提示，對(duì)照組細(xì)胞數(shù)為（190±7）個(gè)/視野，低劑量組細(xì)胞數(shù)為（114±9）個(gè)/視野，中劑量組細(xì)胞數(shù)為（87±6）個(gè)/視野，高劑量組細(xì)胞數(shù)為（38±4）個(gè)/視野。與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組視野下細(xì)胞數(shù)量均低于對(duì)照組，且隨劑量的增加而減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖1。

圖1 T r a n s w e l l檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力（a：對(duì)照組；b：低劑量組；c：中劑量組；d：高劑量組；結(jié)晶紫染色，×2 0 0）

2.3 各組細(xì)胞凋亡結(jié)果的比較 對(duì)照組僅有少量細(xì)胞凋亡（AI=4.94±1.14），與對(duì)照組相比，低劑量組細(xì)胞凋亡情況（AI=4.46±1.18）無(wú)明顯變化（P＞0.05），中、高劑量組細(xì)胞AI分別為11.76±2.85、34.34±7.74，明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與中劑量組相比，高劑量組細(xì)胞凋亡更多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 T U N E L檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡（a：對(duì)照組；b：低劑量組；c：中劑量組；d：高劑量組；T U N E L染色，×2 0 0）

2.4 各組細(xì)胞中Norrin及Livin mRNA表達(dá)的比較 經(jīng)real-time PCR檢測(cè)，與對(duì)照組相比，中、高劑量組Norrin和Livin的mRNA表達(dá)減少（P＜0.05），低劑量組中表達(dá)未見明顯改變（P＞0.05）；與低劑量組比較，中、高劑量組Norrin、Livin mRNA表達(dá)減少（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組Norrin、Livin mRNA表達(dá)減少更加明顯（P＜0.05），詳見表3。

2.5 各組細(xì)胞中Norrin和Livin的表達(dá) 與對(duì)照組比較，中、高劑量組Norrin和Livin表達(dá)減少（P＜0.05），低劑量組中表達(dá)未見明顯改變（P＞0.05）；與低劑量組比較，中、高劑量組Norrin和Livin表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組Norrin和Livin表達(dá)減少更加明顯（P＜0.05）。見圖3、表4。

表3 各組細(xì)胞中N o r r i n及L i v i n m R N A表達(dá)的比較

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.0 5；與低劑量組比較，▲P＜0.0 5；與中等劑量組比較，△P＜0.0 5

圖3 各組細(xì)胞中N o r r i n、L i v i n的表達(dá)（A:對(duì)照組;B:低劑量組;C:中劑量組;D:高劑量組）

表4 各組細(xì)胞中N o r r i n、L i v i n的表達(dá)

2.6 各組細(xì)胞中CDC25A、cyclin A2、p21、cyclin D1表達(dá)的比較 與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組CDC25A、cyclin A2表達(dá)均明顯減少，且表達(dá)量隨藥物劑量增大而減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），p21、cyclin D1表達(dá)則無(wú)明顯改變（P＞0.05）；見圖4、表5。

圖4 各組細(xì)胞中C D C 2 5 A、c y c l i n A 2、p 2 1、c y c l i n D 1的表達(dá)（A:對(duì)照組;B:低劑量組;C:中劑量組;D:高劑量組）

表5 各組細(xì)胞中C D C 2 5 A、C y c l i n A 2、p 2 1及C y c l i n D 1的表達(dá)

3 討論

我國(guó)對(duì)早期胃癌排查不及時(shí)，導(dǎo)致胃癌發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中、晚期，臨床治療以手術(shù)、化療相結(jié)合為主[11]。但化療藥物具有毒副反應(yīng)較強(qiáng)、靶向性不明確、易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中受到了諸多限制。因此，尋找高效、靶向治療胃癌的方法或藥物已成為目前的研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷D抗腫瘤作用是通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞游走能力和吞噬能力、抑制腫瘤細(xì)胞分裂并誘導(dǎo)凋亡等機(jī)制實(shí)現(xiàn)的[12]。另有研究證實(shí)，柴胡皂苷D可干擾腫瘤細(xì)胞S期DNA合成及蛋白質(zhì)代謝的作用，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖[13]。

Norrin最早被發(fā)現(xiàn)參與眼部血管生成[14]，但近期的研究中發(fā)現(xiàn)，Norrin在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，與臨床分期呈正相關(guān)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)Norrin可上調(diào)抗凋亡因子Mcl-1、Bcl-2和下調(diào)促凋亡因子Bax[5]，從多個(gè)方面促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Livin是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抗凋亡因子，目前研究認(rèn)為，Livin的表達(dá)與胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移速度及分化程度呈正相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，中、高劑量組SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞凋亡數(shù)量增加；且Transwell結(jié)果表明，中、高劑量柴胡皂苷D可明顯Transwell視野下細(xì)胞數(shù)量，說(shuō)明柴胡皂苷D可抑制SGC-7901細(xì)胞增殖及遷移能力。本研究在分子層面發(fā)現(xiàn)，中、高劑量的柴胡皂苷D可明顯下調(diào)SGC-7901細(xì)胞中Norrin和Livin的表達(dá)，且mRNA表達(dá)與蛋白結(jié)果相一致，提示柴胡皂苷D可能通過(guò)減少Norrin、Livin的表達(dá)，減少抗凋亡因子的表達(dá)，打破了原有凋亡/抗凋亡細(xì)胞因子的表達(dá)比例，導(dǎo)致SGC-7901細(xì)胞凋亡率顯著增加，降低了SGC-7901細(xì)胞增殖及遷移能力。

為了深入探究柴胡皂苷D抑制SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移作用的其他相關(guān)機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CDC25A、cyclin A2、p21和cyclin D1。CDC25A是細(xì)胞在G1/S、G2/M轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵因子，可通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2-細(xì)胞周期素E復(fù)合物和CDK2-cyclinA的去磷酸化作用，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期[16]；cyclin A2是細(xì)胞進(jìn)入分裂周期的必須因子，cyclin A2減少會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖的停止。已有證據(jù)證實(shí)CDC25A在多種腫瘤疾病中發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)，并與不良轉(zhuǎn)歸有密切關(guān)系[17]。本研究表明，低、中、高劑量柴胡皂苷D均可有效減少SGC-7901細(xì)胞CDC25A、cyclin A2的表達(dá)，而對(duì)細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶p21和具有促進(jìn)細(xì)胞增值的cyclin D1并無(wú)明顯影響[18-19]，說(shuō)明柴胡皂苷D并不能影響SGC-7901細(xì)胞所有的細(xì)胞周期，而是通過(guò)減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)CDC25A、cyclin A2的表達(dá)，導(dǎo)致SGC-7901細(xì)胞S期阻滯，從而無(wú)法合成腫瘤細(xì)胞繁殖所需的蛋白及DNA，進(jìn)而降低SGC-7901細(xì)胞增殖能力。值得注意的是，低劑量柴胡皂苷D可對(duì)胃癌細(xì)胞CDC25A、cyclin A2的表達(dá)雖產(chǎn)生一定影響，但并無(wú)明顯抑制SGC-7901細(xì)胞增殖能力，其原因可能為CDC25A、cyclin A2輕微的減少并不能對(duì)SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生明顯影響，也可能與培養(yǎng)時(shí)間較短有關(guān)。另一方面，現(xiàn)階段并無(wú)直接證據(jù)表明Norrin、Livin與細(xì)胞周期蛋白CDC25A、cyclin A2可相互影響，因而推測(cè)柴胡皂苷D通過(guò)影響細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多重作用共同降低胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及遷移能力。

綜上所述，柴胡皂苷D可能通過(guò)減少SGC-7901細(xì)胞中Norrin、Livin、CDC25A及cyclin A2的表達(dá)而起到促進(jìn)凋亡，抑制SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移作用。下一步將深入研究，證實(shí)胃癌組織中Norrin、Livin是否與CDC25A及cyclin A2具有相互影響的作用。

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Effect of saikosaponin D on proliferation and migration of human gastric cancer cell line SGC-7901

ZHANG Xiaohai,ZHANG Hongtao,HU Xiaoding,et al.Department of Internal Medicine,Zhejiang Skin Disease Prevention and Treatment Center,Huzhou 313200，China

Gastric cancer Saikosaponin D Apoptosis Norrin Livin SGC-7901 cell

2 0 1 6-0 8-1 7）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

d o i：1 0.1 2 0 5 6/j.i s s n.1 0 0 6-2 7 8 5.2 0 1 7.3 9.1 5.2 0 1 6-1 3 0 8

3 1 3 2 0 0杭州，浙江省皮膚病防治研究所內(nèi)科（張曉海、張洪濤、胡孝定、鐘華）；內(nèi)蒙古民族大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)及功能分子合成自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（王曦?zé)睿?/p>

張曉海，E-m a i l：w y l t e a m@1 6 3.c o m

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of saikosaponin D on the growth and migration of human gastric cancer cell line SGC-7901. Methods Cultured human gastric cancer SGC-7901 cells were divided into control group and low, medium,high dose groups,which were treated with 0,5,10 and 20 μmol/L saikosaponin D,respectively.The cell proliferation was determined by MTT method at 24 h,48 h and 72 h after treatment;apoptosis was detected by fluorescence TUNEL method, cell migration ability was assayed by Transwell method,the expression of Livin and Norrin mRNA was detected by Real-time PCR,the expression of Norrin,LivinCDC25A,cyclin A2,p21 and cyclin D1 proteins was detected by blot Western blotting. Results Compared to control group,the expression of CDC25A cyclin A2 in low dose group was decreased(P＜0.05),however, there were no changes in cell apoptosis and expression of Norrin,Livin,p21 and cyclin D1(P＞0.05),in medium and high dose groups,cell proliferation was significantly inhibited,apoptosis rate was increased(P＜0.05),the expression of Norrin and Livin mRNA was decreased(P＜0.05),the expression CDC25A and cyclin A2 proteins was inhibited in a dose-effective manner(P＜0.05),and there were no changed in expression of p21 and cyclin D1(P＞0.05). Conclusion Saikosaponin D can inhibit the growth and migration of human gastric cancer SGC-7901 cells,which is associated with down-regulating Livin and Norrin expression,interfering with the cell cycle and promoting cell apoptosis.