鄒丹，馮秀艷，周偉強(qiáng)

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室；2.遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110034）

乳腺癌MCF?7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)雌激素受體α的高功能結(jié)合位點(diǎn)

鄒丹1，馮秀艷2，周偉強(qiáng)2

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室；2.遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110034）

目的研究雌激素受體（ER）α募集于p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性的具體作用位點(diǎn)，明確辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）及瘦素（leptin）在調(diào)節(jié)p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子功能中的分子機(jī)制。方法將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓24 h后，分別用20 μmol/L的SAHA 0.88 μL（SAHA組）、0.625 nmol/L的leptin 10 μL（leptin組）處理24 h，對(duì)照組在完全型RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)將各組細(xì)胞裂解液與ERα抗體孵育，收集純化結(jié)合ERα抗體的DNA片段，應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)從轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)到其上游（+2～-4 000 bp）f1～f10片段的DNA相對(duì)表達(dá)量并用2-ΔΔCt法分析。結(jié)果對(duì)照組中，與ERα抗體結(jié)合的f1、f2、f8片段DNA相對(duì)表達(dá)量較f9片段高出2倍以上（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，SAHA及l(fā)eptin組f1～f10片段與ERα抗體結(jié)合能力均降低，其中SAHA組f8片段DNA相對(duì)表達(dá)量達(dá)最低值（P＜0.01），且明顯低于leptin組（P＜0.01）。SAHA組中以f8片段為對(duì)照，其他片段與ERα抗體結(jié)合能力均較其升高（P＜0.05或0.01）。leptin組中以f8片段為對(duì)照，其他片段與ERα抗體結(jié)合能力均較其降低，除f1外均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。結(jié)論乳腺癌細(xì)胞增殖過(guò)程中細(xì)胞增殖信號(hào)招募ERα至p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)，且p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)-2 800 bp～-3 200 bp區(qū)域存在與ERα高度結(jié)合的靶功能區(qū)。

乳腺癌；MCF-7細(xì)胞；p21WAF1/CIP1；雌激素受體α；辛二酰苯胺異羥肟酸；瘦素

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與多種參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移的蛋白有關(guān)。雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性的乳腺癌MCF-7細(xì)胞，其生長(zhǎng)與增殖主要受ER信號(hào)系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)，此信號(hào)系統(tǒng)亦可被瘦素（leptin）信號(hào)系統(tǒng)激活［1］。leptin是肥胖基因的表達(dá)產(chǎn)物，主要由脂肪細(xì)胞合成和分泌，通過(guò)與瘦素受體OB-Rb結(jié)合發(fā)揮作用。p21WAF1/CIP1是細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑，可使細(xì)胞周期停滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。本課題組的前期工作證實(shí)leptin處理后的乳腺癌細(xì)胞p21WAF1/CIP1mRNA及蛋白表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于leptin未處理組細(xì)胞［2］。組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）可抑制HDAC活性，通過(guò)上調(diào)p21WAF1/CIP1引起細(xì)胞周期阻滯于G1期而抑制細(xì)胞增殖［3］。本研究的目的是找出ERα募集于p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性的具體作用位點(diǎn)，明確SAHA及l(fā)eptin在調(diào)節(jié)p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子功能過(guò)程中的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7（美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)），SAHA、leptin（美國(guó)Sigma），完全型RPMI-1640培養(yǎng)液、改良型RPMI-1640培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液1×、PierceTMAgarose ChIP試劑盒、CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)（美國(guó)Thermo），ERα抗體（美國(guó)Abcam），0.25%胰酶-EDTA（美國(guó)Gibco），Power SYBR?Green PCR Master Mix、7500 RealTime PCR儀（美國(guó)Life Technologies），p21WAF1/CIP1f1～f10引物（上海生工生物工程有限公司），Biofuge 28RS低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Heraeus），倒置顯微鏡（日本Olympus），SKD1807-E搖床（美國(guó)Scilogex），恒溫混勻器（美國(guó)Eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將MCF-7細(xì)胞接種在完全型RPMI-1640培養(yǎng)液（10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素）中，37℃、5%CO2孵箱飽和濕度條件下貼壁傳代培養(yǎng)，每2～3 d換液并傳代1次。0.25%胰酶-EDTA消化。經(jīng)2～3次傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞等量分成3組，分別接種于完全型RPMI-1640培養(yǎng)液中，24 h后再將細(xì)胞置于改良型RPMI-1640培養(yǎng)液中進(jìn)行同步化處理24 h，此后將3組細(xì)胞分別定義為SAHA組（完全型RPMI-1640培養(yǎng)液10 mL+20 μmol/L的SAHA 0.88 μL）、leptin組（完全型RPMI-1640培養(yǎng)液10 mL+0.625 nmol/L的leptin 10 μL），對(duì)照組（加等量完全型RPMI-1640培養(yǎng)液）。

1.2.2 使用ERα抗體染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（chromatin-immunoprecipitation，ChIP）處理樣品：MCF-7細(xì)胞的甲醛交聯(lián)及細(xì)胞團(tuán)的分離；細(xì)胞溶解及MNase消化，每組樣品各得到50 μL的MNase消化產(chǎn)物，留取5 μL-20℃保存作為內(nèi)對(duì)照，留取45 μL進(jìn)行下一步的免疫沉淀處理，免疫沉淀過(guò)程中需向每個(gè)ChIP樣品加入ERα抗體10 μg，實(shí)驗(yàn)步驟均按操作手冊(cè)完成。最終3組MCF-7細(xì)胞均獲得ChIP得到的DNA及各自的內(nèi)對(duì)照。

1.2.3 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)各組p21WAF1/CIP1f1～f10片段的DNA表達(dá)：PCR反應(yīng)體系為25 μL，DNA 1.5 μL，上下游引物各0.75 μL，PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為50℃2 min，95℃10 min預(yù)變性，95℃15 s，60℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組DNA的相對(duì)表達(dá)量。

p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)10個(gè)片段的引物序列：f1，上游5’-TCCTCCTGGA GAGTGCCAAC-3’，下游5’-TTGGTGCGCTGGACACATTT-3’；f2，上游 5’-TTCCCGGAAGCATGTGACAA-3’，下游5’-GCACCT GGAGCACCTAGACACC-3’；f3，上游5’-CCC GTTTCCCCAGCAGTGTA-3’，下游5’-GCCAGG AAGGGGAGGAT TG-3’；f4，上游5’-AGGCCAAGGG GGTCTGCTAC-3’，下游5’-CGGGGAGGACAGGCT TCTTT-3’；f5，上游5’-TGAAAGCAGAGGGGCTTCA A-3’，下游5’-ACCATCCAAAGGGCTGGTTG-3’；f6，上游5’-TGTCCTTGGGCTGCCTGTTT-3’，下游5’-AGCCCTGTCGCAAGGATCTG-3’；f7，上游5’-TTCT GCAGCCACCACTGAGC-3’，下游5’-GTGGAGCAG CATGGGGTAGG-3’；f8，上游5’-CCCACCTCAGCCA CCTGAAT-3’，下游5’-GGGCAGATCACAGGGTCAG G-3’；f9，上游5’-AGTGGGCACATTTAGACATAGCA GGT-3’，下游5’-CCTCCCGGTCATGCCTTTC-3’；f10，上游5’-GTCAGGTGCCACTGGGGTCT-3’，下游5’-CGGTCCCCTGTTTCAATGCT-3’。采用實(shí)時(shí)PCR篩查調(diào)控p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄功能的ERα反應(yīng)元件（圖1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖1 調(diào)控p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄功能的ERα反應(yīng)元件示意圖Fig.1 Schematic diagram of the ERα response element that regulates the transcriptional activity of the p21WAF1/CIP1promoter

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組MCF-7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)f1～f10片段ERα高功能結(jié)合位點(diǎn)的篩選

對(duì)照組MCF-7細(xì)胞經(jīng)ERα抗體ChIP處理后，45 μL樣品與5 μL內(nèi)對(duì)照的DNA分別在f1～f10片段的引物作用下進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，二者Ct值之差為該樣品在p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)各自片段的ΔCt值，再以f9片段為對(duì)照，其他片段的ΔCt值與其相減，得到對(duì)照組樣品在p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)f1～f10片段各自ΔΔCt值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各片段DNA的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)照組f1、f2、f8片段DNA相對(duì)表達(dá)量較f9片段升高2倍以上（P＜0.01），故p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)f1、f2、f8片段是ERα的高功能結(jié)合位點(diǎn)。見圖2。

2.2 與對(duì)照組比較SAHA組及l(fā)eptin組MCF-7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)f1～f10片段ERα高功能結(jié)合位點(diǎn)的篩選

圖2 對(duì)照組MCF?7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)f1～f10片段ERα高功能結(jié)合位點(diǎn)篩選Fig.2 Screening of high?affinity binding sites for ERα in the f1 to f10 fragments of the p21WAF1/CIP1promoter region in MCF?7 cells in control group

SAHA組及l(fā)eptin組MCF-7細(xì)胞與ERα抗體進(jìn)行ChIP處理，并將純化的DNA組分進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。結(jié)果表明：SAHA組MCF-7細(xì)胞的p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)f1～f10片段結(jié)合ERα抗體的DNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組對(duì)應(yīng)片段均降低，其中f2、f6～f10片段有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或0.01），f8片段達(dá)最低值。leptin組細(xì)胞f1～f10片段結(jié)合ERα抗體的DNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組對(duì)應(yīng)片段均降低，其中f1、f2、f5、f6、f8、f10片段有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或0.01）。SAHA組及l(fā)eptin組f8片段結(jié)合ERα抗體的DNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組對(duì)應(yīng)片段均降低，但SAHA組明顯低于leptin組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

2.3 以SAHA組及l(fā)eptin組細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)f1～f10片段中特定片段為對(duì)照篩選ERα高功能結(jié)合位點(diǎn)

圖3 SAHA組及l(fā)eptin組MCF?7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)f1～f10片段ERα高功能結(jié)合位點(diǎn)篩選Fig.3 Screening of high?affinity binding sites for ERα in the f1 to f10 fragments of the p21WAF1/CIP1promoter region in MCF?7 cells in the SAHA and leptin groups

以SAHA組MCF-7細(xì)胞的p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子f8片段DNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照，f1～f7、f9～f10片段DNA相對(duì)表達(dá)量均較其升高（P＜0.05或0.01）。以leptin組MCF-7細(xì)胞的p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子f8片段DNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照，f1～f7、f9～f10片段DNA相對(duì)表達(dá)量均較其降低，除f1片段外均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。見表1。

表1 以f8片段為對(duì)照篩選SAHA組及l(fā)eptin組MCF?7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)f1～f10片段ERα高功能結(jié)合位點(diǎn)Tab.1 Screening of high?affinity binding sites for ERα in the f1 to f10 fragments of the p21WAF1/CIP1promoter region in MCF?7 cells in the SAHA and leptin groups，with f8 fragment as the control

3 討論

乳腺癌是女性惡性腫瘤之首，其中70%的患者為ERα陽(yáng)性［4-5］。ERα在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要，已成為臨床內(nèi)分泌治療的金標(biāo)準(zhǔn)，因此深入研究ERα陽(yáng)性的MCF-7乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，對(duì)完善乳腺癌的治療方法、抑制其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有不容忽視的臨床價(jià)值。近年來(lái)，表觀遺傳學(xué)修飾成為乳腺癌研究的熱點(diǎn)，組蛋白乙?；叭ヒ阴；裙矁r(jià)修飾是主要研究?jī)?nèi)容。HDAC使組蛋白去乙?；?，增加組蛋白與DNA雙鏈的親和性，可與一些調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合而抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄。在乳腺癌細(xì)胞增殖過(guò)程中，細(xì)胞增殖信號(hào)在p21WAF1/CIP1的啟動(dòng)子區(qū)可招募HDAC1轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)組蛋白去乙?；碛^遺傳修飾影響p21WAF1/CIP1表達(dá)。ERα是由雌激素激活的轉(zhuǎn)錄因子，雌激素應(yīng)答成分位于雌激素應(yīng)答靶基因的啟動(dòng)子區(qū)，ERα可直接結(jié)合到雌激素應(yīng)答成分或通過(guò)與AP1、SP1、MTA1、HDAC1等其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄［6］。

本研究利用DNA-ChIP方法研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組MCF-7細(xì)胞p21WAF1/CIP1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)近端啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)f1、f2和遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)區(qū)f8片段結(jié)合ERα抗體的DNA相對(duì)表達(dá)量較f9片段顯著升高。這表明在細(xì)胞增殖過(guò)程中，ERα可被招募至p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)，f1、f2、f8片段是ERα的高功能結(jié)合位點(diǎn)。

研究［7-8］表明，SAHA作為一種廣譜的HDAC抑制劑，可以從轉(zhuǎn)錄水平抑制ERα合成，同時(shí)可以通過(guò)增強(qiáng)熱休克蛋白90乙?；揎椂龠M(jìn)ERα經(jīng)泛素—蛋白酶體通路降解。SAHA作用下的MCF-7細(xì)胞，與p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)DNA結(jié)合的ERα明顯減少，且在f8片段（-2 800 bp～-3 200 bp）處受SAHA影響ERα與p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)DNA的結(jié)合量最少。leptin可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡、影響細(xì)胞外環(huán)境等多重機(jī)制促進(jìn)ERα陽(yáng)性的MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移［9-10］。leptin可提高HDAC1的活性［11］，HDAC1與ERα和ERβ均能特異結(jié)合，但HDAC1僅能特異地降低ERα蛋白水平，而不影響ERβ蛋白水平［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相應(yīng)片段比較，leptin作用下的MCF-7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)f1～f10片段結(jié)合ERα的DNA相對(duì)表達(dá)量均降低。以leptin組自身f8片段DNA相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照，其他片段都較之為低。由于leptin可通過(guò)促進(jìn)芳香酶的表達(dá)導(dǎo)致雌激素生成增多［13］，也可上調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中ERα的表達(dá)水平［14］。故經(jīng)SAHA、leptin處理后的MCF-7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)f8片段結(jié)合ERα的DNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均降低，但SAHA組明顯低于leptin組。這一結(jié)果表明：在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，某些細(xì)胞增殖信號(hào)招募ERα于p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子特定區(qū)域，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，f8片段是SAHA、leptin發(fā)揮作用的功能敏感區(qū)。

綜上所述，本研究首先通過(guò)ChIP方法篩選出對(duì)照組MCF-7細(xì)胞p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)ERα的高功能結(jié)合位點(diǎn)，再對(duì)SAHA及l(fā)eptin處理后的MCF-7細(xì)胞進(jìn)一步ChIP篩選，明確p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子區(qū)-2 800 bp至-3 200 bp區(qū)域可能是與ERα高度結(jié)合的靶功能區(qū)。本研究的發(fā)現(xiàn)豐富了SAHA和leptin在調(diào)節(jié)p21WAF1/CIP1啟動(dòng)子功能過(guò)程中的分子機(jī)制，更為抗乳腺癌的藥物研發(fā)及靶向治療奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（編輯 陳 姜）

High?affinity Binding Sites for Estrogen Receptor α in the p21WAF1/CIP1Promoter Region in Breast Cancer MCF?7 Cells

ZOU Dan1，F(xiàn)ENG Xiuyan2，ZHOU Weiqiang2

（1.Department of Pathophysiology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Key Laboratory of Environmental Pollution and Microecology of Liaoning Province，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China）

Objective To investigate the specific sites that estrogen receptor（ER）α could be recruited to in thep21WAF1/CIP1promoter region to regulate its transcriptional activity in MCF-7 cells，and to clarify the molecular mechanism of suberoylanilide hydroxamic acid（SAHA）and leptin in the regulation ofp21WAF1/CIP1promoter function.MethodsMCF-7 cells were starved by culturing them in fetal calf serum-free medium for 24 hours，and then treated with 20 μmol/L of 0.88 μL SAHA（SAHA group）or 0.625 nmol/L of 10 μL leptin（leptin group）for 24 hours，or cultured in complete RPMI-1640 medium（control group）.Cell lysates were incubated with anti-ERα antibody for ChIP analysis.The relative expression levels of DNA fragments，ranging from the TSS to upstream of thep21WAF1/CIP1promoter region（+2 to-4 000 bp），that bound the antibody were detected by real-time PCR.ResultsIn the control group，the relative expression levels of f1，f2，and f8 DNA fragments that bound the anti-ERα antibody were two-fold higher than the relative expression of the f9 fragment（P＜0.01）.In the SAHA and leptin groups，the relative expression of f1 to f10 DNA fragment that bound anti-ERα antibody was significantly lower than that of the control.The binding affinity of ERα for the f8 fragment was the lowest（P＜0.01）in the SAHA group，and it was significantly lower than that in the leptin group（P＜0.01）.ConclusionERα could be recruited to thep21WAF1/CIP1promoter via signaling pathways activated during the proliferation of breast cancer MCF-7 cells.Moreover，the DNA fragment ranging from-2 800 to-3 200 bp upstream of thep21WAF1/CIP1promoter is the target functional region for high-affinity binding with ERα.

breast cancer；MCF-7 cell；p21WAF1/CIP1；estrogen receptor α；suberoylanilide hydroxamic acid；leptin

R977.12

A

0258-4646（2017）08-0677-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.08.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（81172509）；遼寧省自然科學(xué)基金（201602735）；沈陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（F15-199-1-28）

鄒丹（1971-），女，副教授，博士.

周偉強(qiáng)，E-mail：zhouwq@hotmail.com

2016-12-16

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