莊曉彤，肖偉

（1.沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110031；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110004）

·論著·

先天性白內(nèi)障家系致病基因篩查及相關(guān)生物信息學(xué)分析

莊曉彤1，肖偉2

（1.沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110031；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110004）

目的 直接測(cè)序檢測(cè)先天性白內(nèi)障家系突變，探討先天性白內(nèi)障的可能機(jī)制。方法收集1個(gè)常染色體顯性遺傳的先天性白內(nèi)障家系，進(jìn)行候選基因（CRYGD基因）外顯子測(cè)序篩查突變后，利用生物數(shù)據(jù)庫(kù)分析CRYGD蛋白質(zhì)野生型及突變型的理化特性以及翻譯后的修飾、功能域、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等。結(jié)果對(duì)CRYGD基因直接測(cè)序顯示，堿基第452位插入GACT 4個(gè)堿基，發(fā)生了移碼突變。突變后等電點(diǎn)的變化影響晶狀體細(xì)胞內(nèi)的pH值。功能結(jié)構(gòu)域變短，蛋白質(zhì)內(nèi)部重復(fù)性變化，從而影響蛋白功能。結(jié)論發(fā)現(xiàn)了CRYGD基因1個(gè)新的突變位點(diǎn)—Tyr151X，該突變?yōu)槭状螆?bào)道的由插入突變引起先天性白內(nèi)障的CRYGD基因移碼突變。

CRYGD基因；生物信息學(xué)；基因突變；先天性白內(nèi)障

先天性白內(nèi)障是一種臨床常見的晶狀體疾病，主要是胎兒發(fā)育過程中晶狀體代謝異常形成不同程度、不同形式的晶狀體混濁，它不僅使視網(wǎng)膜成像模糊，而且阻止視通路發(fā)育，造成單側(cè)或雙側(cè)的視力損害甚至失明。晶狀體蛋白是重要的結(jié)構(gòu)蛋白，根據(jù)晶體蛋白的分子結(jié)構(gòu)分為3種，3種晶體蛋白的成分比例以及空間排列順序?qū)τ诰S持晶狀體的透明性非常重要［1］。目前發(fā)現(xiàn)的很多先天性白內(nèi)障家系都是由于晶體蛋白基因突變引起，約占50%以上，因此該基因成為先天性白內(nèi)障重要的致病候選基因。本研究對(duì)象是1個(gè)常染色體顯性遺傳的四代家系，所有患者均表現(xiàn)為特征性前極縫性“Y”字形核混濁，到目前為止的相關(guān)報(bào)道中與其關(guān)系最為密切的是晶狀體蛋白基因CRYGD，所以本研究對(duì)家系成員以CRYGD基因作為候選基因直接測(cè)序。

生物信息學(xué)應(yīng)用先進(jìn)的數(shù)據(jù)管理技術(shù)、數(shù)學(xué)分析模型和計(jì)算機(jī)軟件，通過對(duì)生物信息查詢、搜索和比較分析，揭示分子的結(jié)構(gòu)，功能和進(jìn)化等相關(guān)知識(shí)［2］。本研究通過對(duì)蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)分析及蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模擬及功能模擬，推測(cè)突變引起白內(nèi)障的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院眼科就診的具有常染色體顯性遺傳特點(diǎn)的先天性白內(nèi)障家系，該家系傳遞4代（圖1），共有成員14人，其中患者4例，無近親婚姻史。嚴(yán)格遵循赫爾辛基宣言，在征得所有患者及其家屬同意后對(duì)家系成員進(jìn)行采樣（取外周靜脈血5 mL），并進(jìn)行詳細(xì)的臨床檢查。

1.2 基因測(cè)序

圖1 先天性白內(nèi)障家系圖Fig.1 Pedigree of a Chinese family with autosomal dominant nuclear cataract

采用TIANamp Blood DNA Kit血液基因組試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣本DNA純度和濃度。將提取的基因組（1 μL）以特定的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR結(jié)束后，取2 μL PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上電泳，以證實(shí)擴(kuò)增片段為目的片段。純化后PCR產(chǎn)物（20～25 μL）送至北京美吉生物科技發(fā)展公司，使用美國(guó)ABIPRISMTM3730XL DNA自動(dòng)測(cè)序儀，應(yīng)用雙脫氧末端進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 野生型和突變型相關(guān)生物信息學(xué)分析

利用生物數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov），Expasy（http：//www.expasy.org/tools）和Radar（http：// www.ebi.ac.uk/Radar/index.html）生物網(wǎng)絡(luò)軟件包進(jìn)行相關(guān)分析：突變后蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)改變（分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等），一級(jí)結(jié)構(gòu)中糖基化、脂?；⒘姿峄?、硫酸化等修飾位點(diǎn)和模序的變化。并構(gòu)建蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果

2.1 基因測(cè)序結(jié)果

對(duì)CRYGD基因直接測(cè)序顯示，堿基第452位插入GACT 4個(gè)堿基，這個(gè)插入使堿基序列發(fā)生了移碼突變，原堿基序列由TAT移碼突變成終止密碼TGA，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止。見圖2。

2.2CRYGD基因相關(guān)生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果：野生型CRYGD通過軟件分析，等電點(diǎn)為7.0，不穩(wěn)定指數(shù)54.89，高于閾值（40），提示在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定，親水性指數(shù)-0.804。突變型與野生型相比較，等電點(diǎn)為6.05，發(fā)生了明顯變化，可能會(huì)引起蛋白質(zhì)分子之間靜電作用。不穩(wěn)定指數(shù)變得更高，為56.82，提示突變型的CRYGD更加不穩(wěn)定，親水性指數(shù)變?yōu)?0.799，提示突變型CRYGD對(duì)于水的溶解性也有變化。見表1。

2.2.2 Expasy（http：//www.expasy.org/tools）分析結(jié)果：野生型含有1個(gè)天門冬胺酰糖基化位點(diǎn)（50～53），1個(gè)酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（5～8）；2個(gè)潛在的N-肉豆蔻酰位點(diǎn)（71～76、158～163）；5個(gè)潛在的蛋白質(zhì)激酶C磷酸化位點(diǎn)（35～37、75～77、78～80、87～89、166～168）；1個(gè)細(xì)胞黏附序列（60～62）；1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（91～98）；4個(gè)晶體結(jié)構(gòu)蛋白Greek Key序列（2～40、41～83、82～128、129～171）。CRYGD突變后功能結(jié)構(gòu)域發(fā)生明顯改變：1個(gè)N-肉豆蔻酰位點(diǎn)（158～163）缺失；1個(gè)蛋白質(zhì)激酶C磷酸化位點(diǎn)（166～168）缺失；第4個(gè)晶體結(jié)構(gòu)蛋白Greek Key序列（129～171）提前終止，功能結(jié)構(gòu)域變短，缺失24個(gè)氨基酸。野生型CRYGD內(nèi)部重復(fù)序列為4段，突變型內(nèi)部重復(fù)序列為3段，并且氨基酸的長(zhǎng)度明顯縮短。

2.3 運(yùn)用Swiss-model software（version3.7）網(wǎng)絡(luò)蛋白質(zhì)分析軟件，預(yù)測(cè)CRYGD蛋白野生型和突變型的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化

圖2 家系成員CRYGD第3外顯子測(cè)序圖（示突變部分）Fig.2 Sequence map of exon 3 in CRYGD in the pedigree（the mutation is indicated）

表1 野生型與突變型理化性質(zhì)比較Tab.1 Comparison of CRYGD wild?type and mutant type

從三維結(jié)構(gòu)上看，突變后該蛋白缺失了1個(gè)alpha螺旋和1段beta折疊，屬于非常劇烈的突變。可以預(yù)計(jì)突變后立體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，很可能生物學(xué)功能也將喪失。見圖3。

3 討論

本研究選擇的是1個(gè)常染色體顯性遺傳的四代家系，所有的患者均表現(xiàn)為特征性前極縫性“Y”字形核混濁，到目前為止的相關(guān)報(bào)道中與其關(guān)系最為密切的是定位于2q33～35的晶狀體蛋白基因CRYGD，由于該基因外顯子僅有3個(gè)，而且編碼區(qū)包含的堿基數(shù)只有608 bp，由174個(gè)氨基酸構(gòu)成。所以對(duì)家系成員進(jìn)行以CRYGD基因作為候選基因直接測(cè)序。結(jié)果表明在第3外顯子第452堿基處發(fā)現(xiàn)了插入突變，插入的4個(gè)堿基直接導(dǎo)致了堿基的移碼，終止密碼提前出現(xiàn)，蛋白轉(zhuǎn)錄提前終止。

迄今為止，關(guān)于CRYGD基因的相關(guān)報(bào)道［3-5］大多數(shù)為單堿基的錯(cuò)義突變（包括R15C、P24T、R37S、R59H、E107A、W157X等），目前僅有1例報(bào)道［6］為單堿基的缺失造成移碼突變（G165fs）。本研究第1次發(fā)現(xiàn)了因?yàn)镃RYGD基因的堿基插入所導(dǎo)致的移碼突變。

圖3 CRYGD蛋白野生型和突變型的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Comparison of the tertiary structure of wild?type and mutant CRYGD

利用基因組編碼區(qū)的信息分析把野生型和突變型的DNA序列信息，通過多種生物學(xué)軟件對(duì)野生型蛋白和突變型蛋白進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其可能從以下幾個(gè)方面，導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生：（1）突變后等電點(diǎn)的變化影響晶狀體細(xì)胞內(nèi)的pH。生理?xiàng)l件下晶狀體細(xì)胞內(nèi)pH為7.0，野生型的CRYGD等電點(diǎn)也為7.0，這意味著CRYGD蛋白將不帶電荷，均勻分布在晶狀體纖維細(xì)胞中，從而保持晶狀體的透明性［7-8］；突變后，等電點(diǎn)下降為6.05，影響晶狀體蛋白電荷性質(zhì)，蛋白質(zhì)間異常的靜電作用可能會(huì)使其相互聚集，產(chǎn)生沉淀，影響晶狀體蛋白的正常排列，導(dǎo)致白內(nèi)障產(chǎn)生。（2）功能結(jié)構(gòu)域變短突變使轉(zhuǎn)錄提前終止，第4個(gè)晶體結(jié)構(gòu)蛋白Greek Key序列129～171提前終止，缺失24個(gè)氨基酸，整個(gè)CRYGD蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域變短，可能影響到蛋白質(zhì)的正確折疊。（3）蛋白質(zhì)內(nèi)部的重復(fù)性變化。目前認(rèn)為蛋白質(zhì)內(nèi)部重復(fù)片段在蛋白質(zhì)序列進(jìn)化的過程中具有重要意義，許多蛋白質(zhì)通過內(nèi)部復(fù)制進(jìn)行進(jìn)化，所以蛋白質(zhì)內(nèi)部的重復(fù)性與其功能和內(nèi)部結(jié)構(gòu)單位有關(guān)［9-11］。Tyr151X突變使得蛋白質(zhì)內(nèi)部的重復(fù)性發(fā)生改變，可能進(jìn)而影響到蛋白質(zhì)的功能。（4）蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化將CRYGD及其突變序列分別輸入Swiss-model，數(shù)據(jù)庫(kù)將序列與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行匹配，輸回三維圖像。從三維結(jié)構(gòu)上看，突變后該蛋白缺失了1個(gè)alpha螺旋和1段beta折疊，屬于非常劇烈的突變?？梢灶A(yù)計(jì)突變后立體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，很可能生物學(xué)功能也將喪失。

目前隨著基因定位和克隆技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的先天性白內(nèi)障致病基因被發(fā)現(xiàn)和克隆，極大地推動(dòng)了白內(nèi)障遺傳學(xué)研究。但是由于受實(shí)驗(yàn)對(duì)象的限制，在發(fā)現(xiàn)致病基因后有時(shí)也很難對(duì)突變蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及導(dǎo)致白內(nèi)障的機(jī)制開展深入研究。生物信息學(xué)通過對(duì)DNA和蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)分析，解讀核酸和蛋白質(zhì)序列中所表達(dá)的結(jié)構(gòu)和功能的生物信息，計(jì)算機(jī)輔助蛋白建模則為預(yù)測(cè)和分析突變蛋白結(jié)構(gòu)提供基礎(chǔ)，為研究其功能及參與白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制提供思路。

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（編輯 武玉欣）

Pathogenic Genes and Protein Function Changes in a Congenital Hereditary Cataract Pedigree

ZHUANG Xiaotong1，XIAO Wei2

（1.Department of Ophthalmology，The Fourth People’s Hospital of Shenyang，Shenyang 110031，China；2.Department of Ophthalmology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveWe screened for mutations in an autosomal dominant congenital cataract pedigree by gene sequence analysis to provide a basis for genetic diagnosis of congenital cataract.MethodsA Chinese family with congenital nuclear cataract was recruited for mutational screening of candidate genes by direct sequencing.We analyzed the differences between theCRYGDgene mutant and wild-type in terms of protein conformation and structural domains using bioinformatics methods.ResultsWe detected a novel heterozygous variant c.451_452insGACT in exon 3 ofCRYGD.Bioinformatics analysis showed that the mutated CRYGD protein structural domain became shorter，the conformation became simpler，and protein inner repeatability was altered，affecting protein function.ConclusionWe found that the Tyr151X gene mutation ofCRYGDcan lead to congenital hereditary cataract.To date，this is the only detected frameshift mutation caused by an insertion inCRYGDgene mutations.

CRYGDgene；bioinformatics；gene mutation；congenital cataract

R774.1

A

0258-4646（2017）08-0673-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.08.001

國(guó)家自然科學(xué)基金（30973276）

莊曉彤（1978-），女，副主任醫(yī)師，博士.

肖偉，E-mail：xiaow@sj-hospital.org

2017-01-07

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：