潘艷芳，方 艷，應小平

Exendin-4對淀粉樣 β 蛋白所致大鼠學習記憶和海馬神經元胞內鈣離子的影響

潘艷芳，方 艷，應小平

目的 探討Exendin-4對淀粉樣 β 蛋白( Aβ1- 42)所致大鼠學習記憶及對大鼠海馬神經元細胞內鈣離子濃度的影響。方法 SD雄性大鼠( n= 40)分為對照組、Aβ1- 42、Exendin-4、Exendin-4 + Aβ1- 42等4組。雙側海馬注射 Aβ1- 42 建立阿爾茨海默病(AD)模型，Exendin-4預處理后進行Morris水迷宮實驗檢測大鼠的學習記憶能力， 利用激光掃描共聚焦顯微成像技術檢測海馬神經元細胞內鈣離子[Ca2+]i熒光強度。結果 與對照組相比， 海馬單獨注射 Aβ1- 42 可導致大鼠學習記憶能力明顯下降( P<0.05)；單獨注射Exendin-4不影響大鼠的學習記憶， 但Exendin-4預處理可有效逆轉 Aβ1- 42 引起的學習記憶損傷(P>0.05)；Exendin-4預處理逆轉了Aβ1- 42引發(fā)的海馬神經元細胞內Ca2+的濃度增高(P<0.05)。結論 Exendin-4可有效拮抗 Aβ1- 42 所致的大鼠空間學習記憶傷害，作用機制可能通過調節(jié)AD模型大鼠海馬神經元細胞內鈣離子穩(wěn)態(tài)。

阿爾茨海默病；Exendin-4； 淀粉樣 β 蛋白；學習記憶； 細胞內鈣濃度

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)是一種神經退行性疾病，其特征性病理改變?yōu)槟X內出現(xiàn)淀粉樣β蛋白(Amyloid β protein，Aβ)沉積，神經細胞內出現(xiàn)神經元纖維纏結(NFTs)、大量的神經元丟失與腦萎縮[1]。 Aβ是老年斑的主要成分， 其來源于淀粉樣前體蛋白(APP)在 γ 和 β 分泌酶的作用下裂解而成的一個多肽，具有廣泛的神經毒性[2]。然而目前仍缺乏有效的AD治療手段。 近年來流行病學調查表明，AD與2型糖尿病(T2DM)的發(fā)生具有密切的相關性[3]。T2DM 病人罹患 AD 的概率比正常人高出兩倍，85%的 AD 病人同時伴發(fā)有T2DM 或血糖水平的明顯升高[4]。近年來提出的一個治療 AD 的新策略就是：利用抗 T2DM 的藥物干預 AD。目前，這方面的研究已經有一定進展。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)及其類似物能夠減少 Aβ的沉積和Tau蛋白磷酸化，改善線粒體功能，抑制炎癥反應和促進神經元生長，從而使AD病人的認知功能得到改善[5]。Exendin-4是一個GLP-1的類似物，與GLP-1受體結合后，導致細胞內環(huán)磷酸腺苷(cAMP)增加、鈣離子濃度升高，促進胰島素出胞，從而葡萄糖依賴性降低血糖上調。研究進一步顯示， AD小鼠側腦室灌注 Exendin-4后全腦勻漿Aβ水平明顯下降，并能逆轉Aβ導致的海馬神經元凋亡[6]； 這提示， Exendin-4對Aβ可能具有強大的中樞拮抗效應。本研究探討Exendin-4發(fā)揮的神經保護作用是否通過調節(jié)細胞內鈣離子的穩(wěn)態(tài)來實現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 成年雄性 Sprague-Dawley (SD)大鼠230 g～250 g， 由西安交通大學實驗動物中心提供。將40只大鼠隨機分為4組，每組10只 ： control、 Aβ1-42 (3 nmoL)、Exendin-4(2 nmoL)和 Aβ1-42+ Exendin-4。Exendin-4 和Aβ1- 42均購置美國 Sigma 公司。Exendin-4 和Aβ1- 42經微量二甲基亞砜 ( DMSO) 充分溶解后， 用磷酸鹽緩沖液( phosphate buffered saline， PBS) 稀釋。Aβ1-42 在 37 ℃下孵育 72 h， 間斷振蕩，使其老化成寡聚體。各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉 (300 mg/kg) 麻醉后， 固定于腦立體定位儀(68004， 瑞沃德公司 )上。 切開頭皮，暴露顱骨，參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟點 為基準， 用骨鉆于鉆孔， 將自制的不銹鋼給藥導管插入大鼠雙側海馬 CA1 區(qū)后3.0 mm、 中線旁開 2.2 mm、 深度 3.0 mm， 再利用微量注射泵 (KD Scientific， Inc， KDS 310 Plus， USA) 和 5 μL微量注射器將藥物或溶劑 ( 2 μL)緩慢注入雙側海馬，給藥速度 0.2 μL/min。藥物注射完后留針 5 min， 藥物注射間隔 15 min。注射藥物后，顱骨上的注射孔用骨蠟封口、 皮膚縫合并給予抗生素處理?；謴?周后開始水迷宮試驗。

1.2 Morris水迷宮測試 大鼠被放置在一個直徑為 150 cm、 深度為 50 cm的水迷宮宮體中，水溫保持在(23±2) ℃，讓其尋找一個比水面低1 cm 的水下平臺 ( 直徑 14 cm、 高 29 cm)。水池內表面與平臺均涂成黑色。所有大鼠的活動和軌跡通過水池正上方固定的攝像頭進行監(jiān)視并把信號用行為學分析軟件系統(tǒng) (Ethovision 3.0， Noldus Information Technology， Netherlands) 進行處理。全部測試包括三個方面：定位航行試驗、空間探索試驗和可視平臺試驗。主要觀察指標有：大鼠找到水下平臺的平均逃避潛伏期和平均逃避距離、撤除平臺后大鼠在目標象限內的游泳時間和距離百分比以及游泳速度等。

1.3 海馬原代神經元培養(yǎng) 取新生SD大鼠，無菌條件下剪開頭皮、顱骨，用彎鑷拉開腦區(qū)視野，小心取出全腦，D-hanks液洗數(shù)次，以腦中線為起點，小心撥開大腦顳葉皮層，小心夾出海馬組織，置于冰浴的D-hanks液中，仔細剔除微血管，大腦海馬剪成米粒大碎片， 以終濃度為 0.125%的胰蛋白酶消化( 37 ℃，20 min)，用含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化， 用尖頭吸管輕輕吹打細胞10～20 次數(shù)分鐘，至液體成米糊狀即停止吹打， 用150目網篩過濾， 濾后1 000 r/min 離心5 min， 棄上清， 用DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細胞， 調整細胞密度為 1×106/mL， 種植于預先用多聚賴氨酸液包被的 35 mm 培養(yǎng)皿中， 在 37 ℃、飽和濕度并通有 5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。接種后24 h將培養(yǎng)液換成含B27的無血清Neurobasal培養(yǎng)液， 48 h 后加入 10 μmol/L 的阿糖胞苷以抑制非神經元細胞的增殖， 以后每3 d半量換液。

1.4 激光共聚焦顯微鏡鈣測定 取培養(yǎng)7 d后的海馬神經細胞， 對Exendin-4對照組及聯(lián)合給藥組進行Exendin-4預處理 24 h后，用PBS溶液洗滌3 次， 加入 Fluo-4/AM (5 μmol/L) 在37 ℃下負載30 min熒光染料，負載結束后， 用生理鹽溶液洗去細胞外多余染液。然后置于激光共聚焦倒置顯微鏡(日本OLYMPUS，F(xiàn)V-1000)下動態(tài)檢測對[Ca2+]i對急性給予 Aβ1-42 的反應。

2 結 果

2.1 Exendin-4保護大鼠學習記憶免受 Aβ1- 42 引起的損傷 在定位航行試驗中，隨著訓練天數(shù)的增加，對照組和各處理組大鼠尋找平臺所需要的時間(圖1A)和所游過的距離(圖1B)均逐漸減少。除訓練第 1 天外， Aβ1-42組大鼠的游泳距離在2 d～5 d與對照組相比，均明顯增加(P<0.05)。單獨給予2 nmoL Exendin-4 沒有明顯影響(P>0.05)，但是與單獨給予Aβ1-42組相比，在2 d～5 d，2 nmoL Exendin-4+Aβ1-42組大鼠尋找平臺距離均明顯降低(P<0.05)。圖1C圖1D 顯示了第 6 天進行的空間探索試驗結果。對組照大鼠在目標象限內停留百分比(45.62±2.72)%和距離百分比(44.71± 1.94)%，給予 Aβ1-42 的大鼠在目標象限內停留百分比(27.78± 2.54)%和游泳距離的百分比(29.13± 2.37)%，均較對照組明顯縮短(P<0.05)。單獨Exendin-4大鼠在目標象限中花費的時間百分比(45.71± 1.84)%和游過距離占游泳總距離的百分比為(44.42 ± 1.93)%， 與對照組相比無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)。而2 nmoL Exendin-4+Aβ1-42組在目標象限內停留的時間占總時間的百分比(36.94 ± 2.51)%和游泳距離占游泳總距離的百分比分別為 (35.68 ±2.72)%，較單獨 Aβ1-42 處理組明顯增加 (P<0.05)。以上結果表明， Exendin-4 單獨注射不影響大鼠的空間學習記憶功能， 但 Exendin-4預處理卻拮抗 Aβ1-42 引起的學習記憶傷害。詳見圖1。

圖1 Exendin-4阻止Aβ1-42引起的大鼠空間學習記憶傷害

2.2 Aβ1-42和Exendin-4對大鼠的視力及速度的影響 為了排除藥物對大鼠速度及視力的影響，在Morris 水迷宮實驗中檢測了各組大鼠的游泳時間，在可視平臺試驗中檢測了大鼠到達可視平臺所需時間。 各處理組大鼠平均游泳速度和尋找平臺潛伏期之間均無明顯差異。詳見圖2。藥物處理對大鼠行為學的影響不是通過影響視力和運動功能而實現(xiàn)的。

圖 2 海馬內注射Exendin-4和Aβ1-42不影響大鼠的視力和運動能力

2.3 Exendin-4預處理拮抗了Aβ1-42引起的鈣超載 為了檢測Exendin-4拮抗Aβ1-42對學習記憶的傷害是否和調節(jié)細胞內鈣離子穩(wěn)態(tài)有關系。本研究比較了不同處理對海馬神經元細胞內鈣離子濃度的影響。與對照組相比(100.0±5.1)%， 10 μmoL Aβ1-42加入后，細胞內相對熒光密度增加到(228.1±6.7)%(P<0.05)。加入 200 nmoL Exendin-4后，相對熒光密度與對照組相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但是在Exendin-4 (200 nmoL)預處理卻能夠抵抗Aβ1-42引起的熒光密度的增加。因此表明Exendin4發(fā)揮神經保護作用可能和調節(jié)細胞內[ Ca2+]i穩(wěn)態(tài)有關。詳見圖3。

圖3 Exendin-4預處理拮抗了Aβ1-42引起的鈣超載

3 討 論

雙側海馬注射 Aβ1-42 可引起大鼠空間學習記憶功能損傷 ；這一過程可能涉及細胞內[ Ca2+]i穩(wěn)態(tài)的打破[7]。Exendin4 預處理可能通過調節(jié)[ Ca2+]i的平衡拮抗 Aβ1-42 引起的學習記憶傷害。鈣離子是一個關鍵的細胞信轉導號分子，在細胞增殖、神經興奮性、突觸傳遞、基因轉錄過程中起重要作用Ca2+參與突觸傳遞神經遞質釋放，以及神經元興奮性和突觸可塑性調節(jié)[7]。細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的擾亂誘導了許多神經系統(tǒng)疾病， 包括AD、腦卒中和帕金森病[8]。一些研究表明，細胞內正常濃度范圍的Ca2+能夠保持神經元的興奮性。鈣超載可以降低神經元興奮閾值，導致神經元凋亡[9]。還有研究表明，鈣穩(wěn)態(tài)破壞和神經炎癥可導致認知功能和突觸功能下降，且在衰老細胞中有過量的Ca2+。異常鈣調節(jié)是參與到AD的病理過程。調制鈣平衡可以提供潛在的方法預防和逆轉AD。

Aβ在AD發(fā)病早期起著重要作用。Aβ可以通過許多機制誘導神經毒性，如鈣穩(wěn)態(tài)的打破，氧化應激和神經毒性； 然而，細胞內鈣平衡的破壞被認為是最重要。已經有研究表明，細胞內鈣超載會導致神經細胞死亡，而Aβ25-35能夠引起原代培養(yǎng)海馬神經元的鈣超載和學習和記憶損害[10]。本研究發(fā)現(xiàn)Aβ1-42能夠引起原代培養(yǎng)海馬神經元的鈣超載和學習和記憶損傷。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)治療2型糖尿病的藥物可改善AD病理變化。GLP-1能夠發(fā)揮神經保護作用和提高學習記憶功能，但是天然的GLP-1只有(1～2)

min的半衰期，從而導致了其臨床應用的有限性。有幸的是，Exendin4擁有一個較長的半衰期(60～90 min)，且能發(fā)揮神經保護作用，刺激軸突生長，阻止興奮毒作用和氧化應激[11]。本研究顯示：與單獨Aβ1-42相比，給予Exendin4能夠降低海馬神經元細胞內Ca2+的水平，這一過程極可能參與到Exendin4拮抗Aβ1-42導致的學習記憶功能傷害過程中。因此Exendin4可能用于AD的預防和治療中。

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(本文編輯王雅潔)

Effects of Exendin-4 on Amyloid β-protein Induced Impairments of Learning Memory and Intracellular Calcium Concentration of Hippocampal Neuron in Rats

Pan Yanfang，F(xiàn)ang Yan，Ying Xiaoping

School of Basic Medical Science， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， Shaanxi，China

Objective To explore the effects of exendin-4 on amyloid β-protein (Aβ) 1-42-induced deficits in learning memory and intracellular calcium concentration of hippocampal neuron in rats.Methods Forty male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups (n=10，each group):control， Aβ1-42 ， Exendin-4， Exendin-4+Aβ1-42.After bilateral hippocampal injection of Aβ1-42 and exendin-4 rats，Morris water maze test was used to test the ability of spatial learning and memory，and laser-scanning confocal calcium imaging technique was used to test the [Ca2+]i in primary cultured rat hippocampal neurons.Results Hippocampal injection of Aβ1-42 alone impaired spatial learning and memory of rats (P<0.05).Exendin-4 did not affect learning and memory of rats，but alleviated Aβ1-42-induced spatial learning and memory deficits，compared with Aβ1-42 alone group (P>0.05).Pretreatment with exendin-4 suppressed Aβ1-42-induced elevate on in intracellular calcium concentration [Ca2+]i.(P<0.05).Conclusion These findings indicate that systemic pretreatment with exendin-4 can effectively prevent the impairment in spatial learning and memory of rats induced by neurotoxic Aβ1-42， and the underlying protective mechanism of exendin-4 may be involved in regulation of calcium homeostasis.

Alzheimer’s disease；exendin-4；amyloid β-protein；spatial learning and memory;intracellular calcium concentration

陜西省自然科學基礎研究計劃(No.2015JQ8299)

陜西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院病理教研室( 陜西咸陽 712046)

信息：潘艷芳，方艷，應小平.Exendin-4對淀粉樣 β 蛋白所致大鼠學習記憶和海馬神經元胞內鈣離子的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(15)：1834-1837.

R749.1 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.15.006

1672-1349(2017)15-1834-04

2016-08-03)