李小六，李艷梅，李 萍，范永山

(1.唐山幼兒師范高等專科學(xué)校，河北 灤縣 063700； 2.唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

河北大花蕙蘭疫病病原鑒定及其生物學(xué)特性分析

李小六1，李艷梅2，李 萍2，范永山2

(1.唐山幼兒師范高等?？茖W(xué)校，河北 灤縣 063700； 2.唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

為了明確大花蕙蘭疫病的發(fā)生機(jī)制，對(duì)河北地區(qū)引起大花蕙蘭疫病的病原菌進(jìn)行分離、純化、鑒定和接種試驗(yàn)，并對(duì)大花蕙蘭疫病的病原菌進(jìn)行生物學(xué)特性分析。結(jié)果表明，河北大花蕙蘭疫病的病原菌為掘氏疫霉(Phytophthoradrechsleri)，有傷接種3 d后即可以產(chǎn)生典型疫病癥狀。病原菌的適應(yīng)能力較強(qiáng)，在24～32 ℃和pH值4.0～10.0條件下均能正常生長，其最適生長溫度為28 ℃，最適pH值為7.0。在V8培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基和CA培養(yǎng)基上均生長良好，但在PDA培養(yǎng)基上生長較差。在無菌水中連續(xù)光照培養(yǎng)2 d即可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量孢子囊和孢囊孢子。孢囊孢子保濕12.0 h萌芽率即可達(dá)90.0%以上，適宜萌芽溫度為20～40 ℃，最適萌芽溫度為30 ℃，適宜萌芽pH值為4.0～9.0，最適pH值為7.0。以上研究表明，河北地區(qū)大花蕙蘭疫病病原菌具有較強(qiáng)的致病力和環(huán)境適應(yīng)能力。

大花蕙蘭疫?。?病原鑒定； 掘氏疫霉； 生物學(xué)特性

大花蕙蘭(Cymbidiumhybridium)，又叫虎頭蘭、喜姆比蘭和蟬蘭，屬于蘭科蘭屬多年生草本植物。自1889年英國培育出第1個(gè)大花蕙蘭品種以后，歐美和亞洲等地也相繼選育出大量的種間和品種間雜種。至今，大花蕙蘭的栽培品種已有近2萬個(gè)，成為蘭花中的龐大品種群，在國內(nèi)外花卉市場十分暢銷，是國際上五大盆栽蘭花之一[1-3]。自20世紀(jì)90年代河北地區(qū)引進(jìn)種植大花蕙蘭以來，其在栽培過程中由于生長環(huán)境溫暖潮濕，極易感染疫病。大花蕙蘭疫病主要危害幼苗和成株的莖基部、葉片，其中心葉最易受到傷害。該病一旦發(fā)生如不及時(shí)處理，則很快傳染到根莖、球莖，造成毀滅性的傷害[4]。在生產(chǎn)上,防治大花蕙蘭疫病的方法主要是化學(xué)防治，然而防治效果并不顯著，主要原因是對(duì)大花蕙蘭疫病的發(fā)生機(jī)制了解不清楚。病原菌鑒定和生長特性分析是澄清病害發(fā)生機(jī)制的前提條件。但是，目前對(duì)大花蕙蘭疫病病原菌的研究較少，唐祥寧等[5]和秦建彬等[6]分別認(rèn)為棕櫚疫霉(Phytophthorapalmivora)是上海地區(qū)和福建地區(qū)大花蕙蘭疫病的主要病原菌，而陳永強(qiáng)等[7]認(rèn)為柑橘生疫霉(P.citricola)和煙草疫霉(P.nicotianae)也能引起廣州地區(qū)的大花蕙蘭疫病。由此可見，由于生態(tài)條件不同，引起大花蕙蘭疫病的病原菌可能會(huì)不同。河北地區(qū)是我國北方大花蕙蘭的主要產(chǎn)區(qū)，由于生態(tài)和氣候條件與上海、福建和廣州等南方地區(qū)差別較大，因此，大花蕙蘭疫病的發(fā)病機(jī)制可能也與南方地區(qū)不同。鑒于目前尚無關(guān)于河北地區(qū)大花蕙蘭疫病發(fā)生發(fā)展研究的報(bào)道，本研究將在對(duì)河北地區(qū)大花蕙蘭疫病病原菌進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上，分析大花蕙蘭疫病病原菌的生物學(xué)特性，為闡明河北地區(qū)大花蕙蘭疫病的發(fā)病機(jī)制以及后續(xù)的防治技術(shù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 大花蕙蘭 由唐山師范學(xué)院蘭花培育基地生產(chǎn)的大花蕙蘭作為本研究的試驗(yàn)材料。

1.1.2 培養(yǎng)基 采用方中達(dá)[8]的方法配制V8培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和CA培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大花蕙蘭疫病病原菌的分離、純化和鑒定 參照秦建彬等[6]的試驗(yàn)方法進(jìn)行大花蕙蘭疫病病原菌的分離、純化和鑒定。選取具有典型疫病癥狀的病葉，用水洗凈切塊，然后用70%乙醇表面消毒10 s，無菌水沖洗2次后轉(zhuǎn)移到CA培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取邊緣菌絲體進(jìn)行純化培養(yǎng)2代，獲得大花蕙蘭疫病病原菌的純培養(yǎng)菌株。將純培養(yǎng)菌株接種在CA平板上28 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察菌落生長情況，顯微觀察孢囊梗、孢子囊、孢囊孢子等無性繁殖器官的形態(tài)特征，觀測(cè)藏卵器和卵孢子的直徑及雄器的著生方式和大小。按照余永年[9]的鑒定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)獲得的純培養(yǎng)菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.2 孢子囊制備和致病性鑒定 將純培養(yǎng)菌株接種在CA培養(yǎng)基平板上，于28 ℃下培養(yǎng)5 d，用直徑5 mm的打孔器打取菌盤，置于帶有無菌水的培養(yǎng)皿中，28 ℃連續(xù)日光燈光照48 h，鏡檢孢子囊的產(chǎn)生數(shù)量，并制備孢囊孢子濃度為4×103個(gè)/mL的孢子囊懸浮液。取50 μL孢子囊懸浮液接種健康無傷的大花蕙蘭新葉，分為4種接種方式：無傷接種、刺傷接種(用解剖針刺傷葉片表皮接種)、剪傷接種(用消毒后的剪刀剪傷葉片后在傷口處接種)和磨傷接種(取少量細(xì)石英砂放在大花蕙蘭葉片上，用鑷子夾取滅菌后的脫脂棉輕輕摩擦，在微傷口處接種)；以清水處理為空白對(duì)照。每個(gè)處理10株。接種后28 ℃保濕培養(yǎng)，3 d后開始觀察發(fā)病情況，5～10 d后剪取出現(xiàn)典型疫病癥狀的病葉，取病健交界處分離、純化，將獲得的純培養(yǎng)菌株與原接種菌株進(jìn)行一致性比較，明確是否為同一種病原菌。

1.2.3 病原菌的生物學(xué)特性分析

1.2.3.1 生長溫度對(duì)菌絲生長的影響試驗(yàn) 打取直徑5 mm的菌盤移入CA培養(yǎng)基平板上，分別在20、24、28、32、36、40 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d，觀測(cè)溫度對(duì)病原菌生長情況的影響。

1.2.3.2 培養(yǎng)基pH值對(duì)菌絲生長的影響試驗(yàn) 用10%NaOH和10%HCl調(diào)節(jié)CA培養(yǎng)基的pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，接種菌盤后28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀測(cè)培養(yǎng)基pH值對(duì)病原菌生長情況的影響。

1.2.3.3 培養(yǎng)基種類對(duì)菌絲生長的影響試驗(yàn) 在pH值7.0的V8培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和CA培養(yǎng)基中央分別接種直徑5 mm的菌盤，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀測(cè)培養(yǎng)基種類對(duì)病原菌生長情況的影響。

1.2.3.4 不同因素對(duì)孢囊孢子萌芽的影響試驗(yàn) 用接種環(huán)挑取少許于CA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌絲，接入V8培養(yǎng)液中，28 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，用無菌移液管取出1 mL菌懸液，無菌水稀釋1 000倍，用滴管吸取孢子懸液到凹玻片的凹槽中，置培養(yǎng)皿內(nèi)保濕培養(yǎng)，鏡檢并統(tǒng)計(jì)孢囊孢子萌芽率。分析保濕時(shí)間(0.5、6.0、12.0、24.0 h)、孢子懸液pH值(2.0～12.0)、保濕溫度(10～90 ℃)對(duì)孢囊孢子萌芽的影響。每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用IBM SPSS 19軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 河北地區(qū)大花蕙蘭疫病病原菌鑒定

從河北地區(qū)大花蕙蘭疫病病株上分離純化后獲得的純培養(yǎng)菌株在CA培養(yǎng)基上生長良好，菌落淡粉色(圖1A)，背面觀為黃褐色(圖1B)，氣生菌絲中等旺盛。在顯微鏡下觀察，菌絲無分隔，寬5.8～7.3 μm；菌絲體分枝較多，無規(guī)則，分枝大部分為銳角；常形成結(jié)節(jié)狀或不規(guī)則的菌絲膨大體，菌絲膨大體常串生(圖1C)。菌絲塊置于無菌水中連續(xù)光照培養(yǎng)2 d，產(chǎn)生大量孢子囊。孢囊梗不分枝或簡單合軸分枝，孢子囊無乳突且不從孢囊梗上脫落，孢子囊卵圓形、長橢圓形或橢圓形，長35～95 μm，寬23～45 μm(圖1D)。孢子囊內(nèi)生3～6個(gè)孢囊孢子，長12～16 μm，寬9～14 μm。觀測(cè)到病菌的有性繁殖器官，其藏卵器圓形，壁光滑，基部棍棒狀，直徑22～45 μm；卵孢子不滿器，直徑15～32 μm；雄器圍生，長15～36 μm，寬8～22 μm(圖1E)。

A.菌落正面；B.菌落背面；C.菌絲膨大體；D.孢子囊；E.藏卵器和雄器圖1 河北地區(qū)大花蕙蘭疫病病原菌的生物學(xué)特征

對(duì)獲得的純培養(yǎng)菌株進(jìn)行致病性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，刺傷接種、剪傷接種和磨傷接種同時(shí)在第3天開始發(fā)病，傷口處布滿淡粉色的菌絲體，在創(chuàng)口邊緣出現(xiàn)黑褐色腐爛現(xiàn)象(圖2A)，而無傷接種不表現(xiàn)任何癥狀(圖2B)；接種10 d時(shí)，刺傷接種、剪傷接種和磨傷接種的腐爛范圍不斷向葉片兩邊擴(kuò)展(圖2C)，而無傷接種則剛開始表現(xiàn)癥狀，心葉上出現(xiàn)黑褐色小斑點(diǎn)；接種20 d時(shí)，刺傷接種、剪傷接種和磨傷接種的腐爛面積擴(kuò)大，染病部位明顯縊縮(圖2D)，無傷接種的整個(gè)心葉呈黑褐色腐爛狀態(tài)，在心葉周圍的葉片上也出現(xiàn)黑褐色小斑點(diǎn)，且有的幾個(gè)小斑點(diǎn)連成一片成為大斑點(diǎn)。從每種處理發(fā)病葉片的病健交界處重新分離純培養(yǎng)菌株，其與初始接種菌株在CA培養(yǎng)基上的菌落特征和孢囊梗、孢子囊、孢囊孢子、藏卵器、卵孢子、雄器的形態(tài)完全一致。

以上研究結(jié)果表明，試驗(yàn)中分離獲得的純培養(yǎng)菌株為河北地區(qū)大花蕙蘭疫病的病原菌。按照余永年[9]的鑒定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)該病原菌進(jìn)行鑒定，該病原菌為鞭毛菌亞門卵菌綱霜霉目疫霉屬掘氏疫霉(Phytophthoradrechsleri)。

A.傷口接種3 d；B.無傷接種3 d；C.傷口接種10 d；D.傷口接種20 d圖2 河北地區(qū)大花蕙蘭疫病病原菌的致病性鑒定

2.2 河北地區(qū)大花蕙蘭疫病病原菌的生物學(xué)特性分析

2.2.1 不同因素對(duì)菌絲生長的影響

2.2.1.1 生長溫度 河北地區(qū)大花蕙蘭疫病病原菌的適宜生長溫度為24～32 ℃，28 ℃下生長最好，菌落直徑達(dá)到85.5 mm(圖3A)。低于24 ℃和高于32 ℃均生長緩慢，菌絲稀疏，顏色變暗。

2.2.1.2 培養(yǎng)基pH值 河北地區(qū)大花蕙蘭疫病病原菌在pH值4.0～10.0內(nèi)均可正常生長，適宜范圍較廣，最適生長pH值為7.0，菌落直徑達(dá)到87.0 mm(圖3B)。

圖3 生長溫度(A)和培養(yǎng)基pH值(B)對(duì)病原菌生長的影響

2.2.1.3 培養(yǎng)基種類 河北地區(qū)大花蕙蘭疫病病原菌在V8培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基和CA培養(yǎng)基上生長狀況均良好，7 d后菌落直徑都可以達(dá)到85.0 mm，而在PDA培養(yǎng)基上生長情況較差。菌落顏色在不同培養(yǎng)基上有所不同：在V8培養(yǎng)基上菌落正面呈粉色，背面呈紅棕色；在CA和PDA培養(yǎng)基上菌落正面呈淡粉色，背面呈黃褐色；在查氏培養(yǎng)基上菌落正面呈白色，背面呈淺黃色。

2.2.2 不同因素對(duì)孢囊孢子萌芽的影響

2.2.2.1 保濕時(shí)間 保濕0.5 h后約有2%的孢囊孢子產(chǎn)生芽突，6.0 h后萌芽率接近16%，12.0 h萌芽率即達(dá)90%以上，保濕24.0 h時(shí)所有孢囊孢子均萌芽，且部分芽管長達(dá)600～800 μm，并有多個(gè)分枝。孢囊孢子有基部萌芽和兩端萌芽2種方式，以基部萌芽為主，約占90%，一個(gè)孢子最多可萌生出2個(gè)芽管。

2.2.2.2 保濕溫度 孢囊孢子在10～30 ℃內(nèi)萌芽率逐漸升高，但高于30 ℃后萌芽率逐漸下降，到達(dá)50 ℃時(shí)萌芽率降低到68.7%，90 ℃時(shí)未見孢囊孢子萌芽(圖4A)。因此，孢囊孢子的適宜萌芽溫度為20～40 ℃，最適萌芽溫度為30 ℃，致死溫度為90 ℃。

2.2.2.3 孢子懸液pH值 在pH值4.0～9.0內(nèi)孢囊孢子均有較高的萌芽率，其最適pH值為7.0，此時(shí)萌芽率為98.1%。pH值低于4.0和高于9.0時(shí)萌芽率均顯著下降(圖4B)。

圖4 生長溫度(A)和孢子懸液pH值(B)對(duì)孢囊孢子萌芽的影響

3 結(jié)論與討論

蘭花疫病是世界性蘭花病害之一，不但可以危害大花惠蘭、卡特蘭、蝴蝶蘭等洋蘭，還可以危害墨蘭、東亞蘭等30余種國蘭及300余種觀賞植物[10]。因此，蘭花疫病的危害極大，直接影響蘭花的品質(zhì)和產(chǎn)量，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。大花惠蘭作為著名的“蘭花新星”，在國內(nèi)外花卉市場十分暢銷，深受花卉愛好者的傾愛。但是，由于霧霾天氣頻發(fā)和大氣變暖等原因，大花蕙蘭疫病的發(fā)生越來越嚴(yán)重，已成為限制大花蕙蘭生產(chǎn)的主要病害之一。然而，由于引起大花蕙蘭疫病的病原菌種類多、差異大，不同地區(qū)、不同生態(tài)環(huán)境下該病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制可能不同。本研究結(jié)果表明，河北地區(qū)大花蕙蘭疫病的病原菌為掘氏疫霉(Phytophthoradrechsleri)，與上海[5]、福建[6]和廣州[7]等地區(qū)的病原菌均不同。

掘氏疫霉是一種廣譜致病菌，可以危害茄果類、瓜類、棉花、蘋果、梨、枸杞、草莓、紅花、白術(shù)等多種農(nóng)作物[11-13]，但是其在蘭花上致病，本研究為首次報(bào)道。該病菌的致病性非常強(qiáng)，為寄生性病菌，它的菌絲體多在寄主細(xì)胞間隙擴(kuò)展并產(chǎn)生吸器進(jìn)入寄主細(xì)胞內(nèi)吸收養(yǎng)分[14]。本研究明確了該病原菌的生長特性和孢囊孢子萌芽的影響因素，為進(jìn)一步闡明該病的侵染機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

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Pathogen Identification and Biological Characteristics ofCymbidiumhybridiumBlight in Hebei Province

LI Xiaoliu1，LI Yanmei2，LI Ping2，F(xiàn)AN Yongshan2

(1.Tangshan Preschool Teachers College,Luanxian 063700,China; 2.Department of Life Science,Tangshan Normal University,Tangshan 063000,China)

In order to clarify the occurrence mechanism ofCymbidiumhybridiumblight,the pathogen was isolated,purified,identified,and re-inoculated in Hebei province.The biological characteristics of the pathogen were analyzed at the same time.The results showed that the pathogen ofCymbidiumhybridiumblight in Hebei province was identified asPhytophthoradrechsleri,which could produce typic blight symptom after 3 days of wound inoculation.The pathogen was strongly adaptive to environment and could grow well at 24—32 ℃ and pH 4.0—10.0.The optimal growth temperature and pH value of the pathogen was 28 ℃ and 7.0 respectively.The pathogen could grow well in the V8 medium,Chavez medium and CA medium,but poor in PDA medium.A large number of sporangia and sporangiospores could be easily induced after 2 days of continuous illumination in autoclaved water.The germination rate of sporangiospores was above 90.0% after 12.0 h of moisture culture.The sporangiospore could germinate very well at 20—40 ℃ and pH 4.0—9.0.The optimal temperature and pH value of sporangiospore germination were 30 ℃ and 7.0 respectively.The above results indicated that the pathogen ofCymbidiumhybridiumblight in Hebei province possessed strong pathogenicity and environmental adaptivity.

Cymbidiumhybridiumblight; pathogen identification;Phytophthoradrechsleri; biological characteristics

2017-01-12

唐山師范學(xué)院科技發(fā)展項(xiàng)目(2014E04,2013A03,2016C05)

李小六(1971-)，男，河南確山人，副教授，碩士，主要從事微生物學(xué)研究。E-mail：1274390449@qq.com

S436.8+1

A

1004-3268(2017)08-0083-04