陸蔚天,黃 娟,許士葉,蔣徐麗,孫善全*

(1重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心,重慶 400016;2重慶醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室;3湖北民族學(xué)院科技學(xué)院解剖教研室;*通訊作者,E-mail:sunsq2151@cqmu.edu.cn)

單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白4在癲癇患者腦組織中的表達(dá)

陸蔚天1，2,黃 娟1，2,許士葉1，2,蔣徐麗3,孫善全1，2*

(1重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心,重慶 400016;2重慶醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室;3湖北民族學(xué)院科技學(xué)院解剖教研室;*通訊作者,E-mail:sunsq2151@cqmu.edu.cn)

目的 檢測癲癇患者腦組織中單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白4(monocarboxylate transporters 4,MCT4)的表達(dá),以探討其在癲癇發(fā)生中的作用。 方法 收集16例顳葉癲癇患者和6例腦外傷患者清創(chuàng)術(shù)后顳葉腦組織作為研究對象,采用免疫組織化學(xué)和免疫印記檢測腦組織MCT4蛋白表達(dá),并進(jìn)行圖像分析和統(tǒng)計學(xué)處理。 結(jié)果 免疫組織化學(xué)顯示,對照組及癲癇組患者腦內(nèi)均可見MCT4陽性細(xì)胞表達(dá),IPP軟件分析顯示癲癇組腦內(nèi)MCT4陽性細(xì)胞平均光密度值(0.266±0.012)高于對照組(0.230±0.023),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。蛋白印記檢測顯示MCT4蛋白在癲癇患者腦內(nèi)的表達(dá)水平(0.426±0.019)較對照組相比明顯增加(0.311±0.044),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論 癲癇患者腦組織中MCT4表達(dá)增高,提示MCT4與癲癇腦內(nèi)異常的能量代謝密切相關(guān)。

單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白4; 癲癇; 乳酸; 能量代謝

癲癇是一種嚴(yán)重影響人類健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,以腦內(nèi)神經(jīng)元異常放電為主要特征,近年來發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)能量代謝紊亂是癲癇發(fā)生的一個重要原因[1,2]。研究發(fā)現(xiàn),為適應(yīng)癲癇發(fā)作時腦內(nèi)高應(yīng)激狀態(tài)下的能量消耗,無氧糖酵解及其代謝產(chǎn)物乳酸參與了為神經(jīng)元提供能量底物的過程。單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白(monocarboxylate transporter, MCT)是一類轉(zhuǎn)運乙酰乙酸、乳酸和酮體類物質(zhì)的膜蛋白,在維持細(xì)胞正常pH值環(huán)境和能量代謝等方面發(fā)揮重要作用[3,4]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),MCT4位于膠質(zhì)細(xì)胞膜,負(fù)責(zé)將膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸轉(zhuǎn)運釋放至細(xì)胞外,以供神經(jīng)元攝取并利用。以往研究證實MCT及其介導(dǎo)的乳酸轉(zhuǎn)運是腦內(nèi)能量代謝的重要組成部分。MCT表達(dá)異常將影響細(xì)胞正常的能量代謝,加速能量代謝紊亂,在腫瘤、肥胖、認(rèn)知功能障礙等發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4-8]。有關(guān)在MCT4在癲癇腦內(nèi)表達(dá)及作用的研究,目前報道較少。因此,本研究通過檢測癲癇腦組織中MCT4的表達(dá),以探討MCT4在癲癇發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集耐藥性顳葉癲癇患者手術(shù)切除的顳葉病灶16例,樣本來源采集于第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院、大坪醫(yī)院及重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院。其中男性10例,女性6例,平均年齡(22.17±14.18)歲。病例符合以下條件:①符合癲癇發(fā)作類型分類規(guī)定;②頭顱CT或磁共振檢查排除神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病。對照組6例,采集于腦外傷清創(chuàng)患者的顳葉腦組織,病理切片證實選取腦組織結(jié)構(gòu)基本正常,患者無癲癇病史及家族遺傳性病史。以上患者家屬知情并簽署知情同意書。

兔抗人MCT4一抗、鼠抗人GAPDH一抗購自Santa Cruz公司(USA),小鼠抗兔二抗、羊抗小鼠二抗購自Biorad公司(USA),DAB顯色試劑盒購自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集及保存 對患者進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)前顳葉切除術(shù),術(shù)中用電極檢測并確定腦電異常部位,切除并收集腦組織。標(biāo)本取出后一部分置于4%多聚甲醛4 ℃固定過夜,隨后進(jìn)行梯度蔗糖脫水。組織沉底后進(jìn)行連續(xù)冰凍切片,片厚20 μm,晾干后-20 ℃保存?zhèn)溆糜诿庖呓M織化學(xué)染色。另一部分腦組織立即置于-80 ℃冰箱待用于免疫印跡檢測。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色檢測腦組織MCT4表達(dá) 用0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min。0.3%過氧化氫封閉10 min,滴加兔抗人MCT4一抗(1 ∶100)4 ℃孵育過夜。取出后0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min,滴加山羊抗兔二抗37 ℃孵育10 min,0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min。配制含硫酸鎳的DAB顯色。0.01 mol/L PBS終止顯色,常規(guī)脫水、透明、封片。PBS代替一抗進(jìn)行染色作為陰性對照。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析,測定MCT4陽性神經(jīng)元的光密度值,光密度值越高,MCT4陽性表達(dá)越高。

1.2.3 免疫印跡檢測腦組織MCT4蛋白表達(dá) 將所取腦組織在冰上研磨、裂解,收集后-80 ℃?zhèn)溆?。BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,350 mA電轉(zhuǎn)56 min至PVDF膜,37 ℃封閉1 h。加入兔抗人MCT4一抗(1 ∶400)或鼠抗人GAPDH一抗(1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜。洗膜后加入小鼠抗兔二抗(1 ∶2 000)或羊抗小鼠二抗(1 ∶1 000),37 ℃孵育2 h。0.01 mol/L PBST洗膜后加入DAB顯色。采用Quantity one軟件測定MCT4和GAPDH條帶灰度值,用MCT4/GAPDH條帶比值作為蛋白相對值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

對照組和癲癇組腦內(nèi)均可見MCT4棕黃色顆粒陽性表達(dá),IPP軟件分析MCT4陽性細(xì)胞平均光密度值癲癇組高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(0.266±0.012vs0.230±0.023，P<0.05,見圖1)。

圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測MCT4在對照組及癲癇組腦組織中的表達(dá) (×200)Figure 1 Expression of MCT4 in brain tissues in control group and epilepsy group by immunohistochemistry (×200)

2.2 免疫印跡結(jié)果

與對照組相比,MCT4在癲癇腦組織內(nèi)的蛋白相對表達(dá)量顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(0.426±0.019vs0.311±0.044,P<0.05,見圖2)。

圖2 免疫印跡檢測MCT4蛋白在對照組及癲癇組腦組織中的表達(dá)Figure 2 Expression of MCT4 protein in brain tissues in control group and epilepsy group by Western blot

3 討論

癲癇是一種腦內(nèi)神經(jīng)元高度同步化異常放電所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常性疾病[9,10]。研究表明癲癇發(fā)作與腦內(nèi)能量代謝異常密切相關(guān)。正常情況下,大腦依賴大量及持續(xù)的能量供應(yīng)以維持各種生理活動的需要。因此,若腦內(nèi)能量代謝發(fā)生障礙將對神經(jīng)元,甚至大腦的正常功能帶來極大的影響。癲癇發(fā)作時大量神經(jīng)元同步放電,處于異常高代謝狀態(tài),消耗腦內(nèi)大量ATP。為補充能量供應(yīng)不足的應(yīng)激狀態(tài),需要腦內(nèi)加速代謝以提供能量底物。由于此時腦內(nèi)處于局部相對缺氧的狀態(tài),由有氧代謝三羧酸循環(huán)途徑的供能降低[11],不能滿足能量消耗。因此,無氧糖酵解此時作為另一條重要供能途徑啟動并且增強,為神經(jīng)元提供能量供應(yīng),緩解能量相對短缺[10]。

乳酸是糖酵解途徑的中間產(chǎn)物,傳統(tǒng)觀點認(rèn)為葡萄糖是為神經(jīng)元活動提供能量的唯一底物,乳酸是腦內(nèi)能量代謝廢物,會對神經(jīng)元及腦組織造成損傷。但近來研究已證實乳酸是腦內(nèi)一種非常重要的能量底物[12],并且在膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的信息交流中發(fā)揮重要作用[13]。有研究發(fā)現(xiàn),在基礎(chǔ)代謝狀態(tài)下,乳酸可為腦內(nèi)代謝提供約10%的能量供應(yīng)。而在高代謝狀態(tài)時,這一比例可提高至60%[12]。此時,神經(jīng)元從胞外攝取乳酸,在乳酸脫氫酶催化下轉(zhuǎn)化成丙酮酸,后者進(jìn)入三羧酸循環(huán)有氧代謝,產(chǎn)生大量ATP,從而維持神經(jīng)元活動需要。

在腦內(nèi),膠質(zhì)細(xì)胞存儲糖原并通過糖酵解產(chǎn)生和釋放大量乳酸[14],神經(jīng)元將乳酸轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)作為底物進(jìn)行能量合成。MCT是一類跨膜蛋白,負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運乙酰乙酸、酮體和乳酸等物質(zhì)[15]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),MCT4位于膠質(zhì)細(xì)胞膜,可以將糖酵解產(chǎn)生的乳酸釋放至細(xì)胞外間隙;MCT2位于神經(jīng)元,負(fù)責(zé)從細(xì)胞外攝取乳酸[16]。MCT4及其介導(dǎo)的乳酸轉(zhuǎn)運是否與癲癇的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性,目前尚未見文獻(xiàn)報道。

本研究采用免疫組織化學(xué)檢測,結(jié)果顯示對照組腦內(nèi)和癲癇組腦內(nèi)均可見MCT4陽性細(xì)胞表達(dá)。進(jìn)一步的MCT4陽性細(xì)胞光密度值檢測及蛋白免疫印跡檢測結(jié)果均顯示,癲癇組患者腦內(nèi)MCT4表達(dá)水平較對照組明顯升高。在腦內(nèi),MCT4主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。因此,癲癇組腦內(nèi)MCT4表達(dá)升高可提示膠質(zhì)細(xì)胞向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運乳酸增強,從而可以為神經(jīng)元攝取乳酸進(jìn)行無氧代謝提供更多的能量底物,進(jìn)而參與癲癇狀態(tài)下神經(jīng)元的異常放電過程。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示癲癇患者腦內(nèi)MCT4表達(dá)增高,提示MCT4及其介導(dǎo)的乳酸轉(zhuǎn)運與癲癇腦內(nèi)神經(jīng)元異常的能量代謝密切相關(guān)。深入探討MCT4及乳酸對神經(jīng)元異常放電及癲癇發(fā)生的調(diào)控,將有助于進(jìn)一步闡明癲癇發(fā)病機制,并有可能會成為癲癇新的治療靶點。

[1] Wu Y, Liu D, Song Z. Neuronal networks and energy bursts in epilepsy[J]. Neuroscience,2015, 287:175-186.

[2] Reid CA, Mullen S, Kim TH,etal. Epilepsy, energy deficiency and new therapeutic approaches including diet[J]. Pharmacol Ther, 2014,144 (2):192-201.

[3] Halestrap AP. The monocarboxylate transporter family-Structure and functional characterization[J]. IUBMB Life,2012,64(1):1-9.

[4] Vijay N, Morris ME. Role of monocarboxylate transporters in drug delivery to the brain[J]. Curr Pharm Des,2014,20(10):1487-1498.

[5] Suzuki A, Stern SA, Bozdagi O,etal. Astrocyte-neuron lactate transport is required for long-term memory formation[J]. Cell,2011,144 (5):810-823.

[6] Romero-Garcia S, Moreno-Altamirano MM, Prado-Garcia H,etal. Lactate contribution to the tumor microenvironment: mechanisms, effects on immune cells and therapeutic relevance[J]. Front Immunol,2016,52:1-11.

[7] Carneiro L, Pellerin L. Monocarboxylate transporters: new players in body weight regulation[J]. Obes Rev,2015, 16(Suppl 1):55-66.

[8] Beesley PW, Herrera-Molina R, Smalla KH,etal. The neuroplastin adhesion molecules: key regulators of neuronal plasticity and synaptic function[J]. J Neurochem,2014,131(3):268-283.

[9] Serrano E, Kanner AM. Recent treatment advances and novel therapeutic approaches in epilepsy[J]. F1000Prime Rep,2015,61:1-9.

[10] Wasterlain CG, Thompson KW, Suchomelova L,etal. Brain energy metabolism during experimental neonatal seizures[J]. Neurochem Res,2010,35(12):2193-2198.

[11] Waldbaum S, Patel M. Mitochondria, oxidative stress, and temporal lobe epilepsy[J]. Epilepsy Res,2010,88 (1):23-45.

[12] Riske L, Thomas RK, Baker GB,etal. Lactate in the brain: an update on its relevance to brain energy, neurons, glia and panic disorder[J]. Ther Adv Psychopharmacol,2017,7(2):85-89.

[13] Mason S. Lactate shuttles in neuroenergetics-homeostasis, allostasis and beyond[J]. Front Neurosci,2017,43:1-15.

[14] Jakoby P, Schmidt E, Ruminot I,etal. Higher transport and metabolism of glucose in astrocytes compared with neurons: a multiphoton study of hippocampal and cerebellar tissue slices[J]. Cereb Cortex,2014,24 (1):222-231.

[15] Halestrap AP, Wilson MC. The monocarboxylate transporter family-role and regulation[J]. IUBMB Life,2012,64 (2):109-119.

[16] Halestrap AP. The SLC16 gene family-structure, role and regulation in health and disease[J]. Mol Aspects Med,2013,34 (2-3):337-349.

Expression of MCT4 in brain tissue of epileptic patients

LU Weitian1，2,HUANG Juan1，2,XU Shiye1，2,JIANG Xuli3,SUN Shanquan1，2*

(1InstituteofNeuroscience,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2DepartmentofHumanAnatomy,ChongqingMedicalUniversity;3ScienceandTechnologyCollegeofHubeiUniversityforNationalities;;*Correspondingauthor,E-mail:sunsq2151@cqmu.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the expression of monocarboxylate transporters 4(MCT4) protein in the brain tissues of patients with epilepsy.MethodsSixteen epileptic patients(epileptic group) and six normal temporal samples(control group) from patients undergoing surgical debridement due to head trauma were randomly selected. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the expression of MCT4 protein in temporal lobe.ResultsImmunohistochemistry results showed that MCT4 expressed both in control group and epileptic group, and the mean density(OD) of MCT4 immunoreactivity in epileptic group was significantly higher than that in control group(0.266±0.012vs0.230±0.023,P<0.05). Western blot showed that MCT4 expression level was significantly higher in epileptic group than that in control group(0.426±0.019vs0.311±0.044,P<0.05).ConclusionThe expression of MCT4 is up-regulated in the brain tissues of epileptic patients, which indicates that the increased expression of MCT4 in brain tissue may be involved in the pathophysiology of energy metabolism in brain tissues of patients with epilepsy.

monocarboxylate 4; epilepsy; lactate; energy metabolism

重慶市渝中區(qū)科技計劃基金資助項目(20140115);國家自然科學(xué)基金資助項目(81601051);重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃項目(cstc2016jcyjA0172);重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目(KJ1600222);重慶醫(yī)科大學(xué)2015年度國家自然科學(xué)基金預(yù)研資助項目(NSFYY201525)

陸蔚天,男,1979-05生,博士,副教授,E-mail:weitianlu@cqmu.edu.cn

2017-04-23

R742.1

A

1007-6611(2017)08-0840-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.018