姜 茜,蔚開慧,張 震,李 頎,肖 萍,蘇 琳,李 龍,潘尚領(lǐng)

(1首都兒科研究所遺傳研究室,兒童發(fā)育營養(yǎng)組學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100020;2廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室;3首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院普通外科;4首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院病理科;5安徽醫(yī)科大學(xué);*通訊作者,E-mail:teaco@126.com)

先天性巨結(jié)腸癥SEMA3C/3D基因突變抑制腸神經(jīng)嵴細(xì)胞的分化和成熟

姜 茜1*,蔚開慧2,張 震3,李 頎3,肖 萍4,蘇 琳5,李 龍3,潘尚領(lǐng)2

(1首都兒科研究所遺傳研究室,兒童發(fā)育營養(yǎng)組學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100020;2廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室;3首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院普通外科;4首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院病理科;5安徽醫(yī)科大學(xué);*通訊作者,E-mail:teaco@126.com)

目的 觀察先天性巨結(jié)腸癥(hirschsprung disease, HSCR)患者攜帶的SEMA3C/3D基因錯(cuò)義突變編碼蛋白對原代培養(yǎng)的腸神經(jīng)嵴細(xì)胞(enteric neural crest cell, ENCC)分化、成熟和遷移的影響。 方法 分別用野生型(wild type, WT)和突變型SEMA3C/3D質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞獲取上清液,用含0.5 nmol/ml相應(yīng)蛋白的上清液處理ENCC 72 h,分別用神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和未成熟神經(jīng)元特異性標(biāo)志物(Peripherin、GFAP、MASH1)多重免疫熒光染色法檢測處理后細(xì)胞的分化傾向和分化后神經(jīng)元的成熟速度,用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的變化。 結(jié)果 與WT相比,突變型SEMA3C(S329G、V337M)處理組的ENCC分化為神經(jīng)元和成熟神經(jīng)元的能力均下降(WT, S329G, V337M組的Peripherin/GFAP比值分別為0.95±0.34, 0.53±0.35, 0.28±0.07;Peripherin/MASH1比值分別為1.14±0.17, 0.95±0.38, 0.60±0.19),其中以V337M突變型SEMA3C處理組的下降最為明顯(P<0.01),而野生型和突變型SEMA3C/3D對神經(jīng)球的遷移均沒有明顯影響。 結(jié)論 突變型SEMA3C可以抑制ENCC分化為神經(jīng)元/成熟神經(jīng)元,從而影響腸神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育,這可能為HSCR的發(fā)病機(jī)制研究提供新的線索。

先天性巨結(jié)腸癥;SEMA3C/3D; 腸神經(jīng)嵴細(xì)胞; 細(xì)胞分化

先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung disease, HSCR)是造成新生兒及嬰幼兒腸梗阻的常見原因之一,又稱腸無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥(congenital aganglionosis),發(fā)病率約為1/5 000,男性高于女性[1]。HSCR是一種神經(jīng)嵴細(xì)胞(neural crest cell, NCC)源性疾病,患兒在胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)NCC遷移、定植、發(fā)育異常,病變腸段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如伴腸道神經(jīng)調(diào)節(jié)紊亂,以致病變結(jié)腸持續(xù)異常收縮而近端腸段代償性擴(kuò)張,形成巨結(jié)腸[2]。目前認(rèn)為HSCR是一種多基因改變導(dǎo)致的遺傳性先天性疾病,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種相關(guān)基因如RET、EDN3、SOX10等,但這些基因中發(fā)現(xiàn)的所有突變僅能解釋不足20%的患者的發(fā)病原因,高度提示其他致病基因或危險(xiǎn)因子的存在[3]。

Semaphorins(SEMAs)家族分子是一類系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上高度保守的分泌型或跨膜型糖蛋白,屬較早發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典的神經(jīng)元軸突導(dǎo)向因子,廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)。其中SEMA3是唯一表達(dá)于脊椎動(dòng)物的分泌型蛋白,包括7個(gè)亞型(SEMA3A-G)[4]。SEMA3主要通過調(diào)節(jié)突觸的形成、成熟以及軸突的生長、導(dǎo)向等來調(diào)控神經(jīng)元的遷移、增殖、分化甚至凋亡[5]。有研究發(fā)現(xiàn),無論是與患者自身的正常腸段相比還是與正常對照相比,HSCR患者無神經(jīng)節(jié)病變腸段平滑肌層內(nèi)的SEMA3A表達(dá)量都有顯著增加,說明該基因編碼的蛋白產(chǎn)物可能與HSCR的發(fā)病相關(guān)[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在HSCR患者篩查中發(fā)現(xiàn)的5個(gè)SEMA3C/3D基因錯(cuò)義突變不僅影響SEMA3蛋白的表達(dá)和分泌,還可抑制Neuro-2a細(xì)胞的軸突生長和遷移[7]。本研究擬探索SEMA3C/3D基因及5個(gè)錯(cuò)義突變編碼蛋白對原代培養(yǎng)的腸神經(jīng)嵴細(xì)胞的影響作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒來源

HEK293T細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。懷孕16 d的SPF級SD大鼠(品系代碼:101)購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)許可證號:京ICP備15004894號-1)。N-端AP-tagged野生型小鼠Sema3c/3d表達(dá)質(zhì)粒(注:小鼠與人的SEMA3C/3D基因氨基酸序列相似度CLUSTAL 2.1評分分別為97.0和92.0,幾乎完全一致)由美國約翰霍普金斯大學(xué)Aravinda Chakravarti教授饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑和儀器

DAPI(北京索萊寶科技有限公司),P75NTR(Cell Signaling,美國),Peripherin(abcam,英國),GFAP(Cell Signaling,美國),MASH1(abcam,英國),Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗兔IgG(abcam,英國),Alexa Fluor488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(abcam,英國),多聚賴氨酸(Millipore,美國),Lipofectamine 2000(Invitrogen,美國),Transwell小室(Corning,美國),激光共聚焦顯微鏡(Leica,德國)。

1.3 主要液體配制

HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(Gibco,美國)中含10% FBS(Gibco,美國)、1%雙抗(Gibco,美國)和1%谷氨酰胺(Gibco,美國);ENCC原代培養(yǎng)基DMEM/F12(Gibco,美國)中含36%Neurobasal(Gibco,美國)、0.02 mg/ml bFGF(Gibco,美國)、0.02 mg/ml EGF(Gibco,美國)、0.02 mg/ml IGF1(Gibco,美國)、1%B27(Gibco,美國)、0.5%N2Supplement(Gibco,美國)和1%雙抗;ENCC促分化培養(yǎng)基DMEM/F12中含1%雙抗和5%FBS;lysis buffer含1%Triton和10 mmol/L Tris(pH=8.0);2×SEAP含1 mmol/L MgCl2、4 mol/L二乙醇胺、4.5 mg/ml L-高精氨酸鹽酸鹽、1 mg/ml BSA和8.9 mg/ml PNPP。

1.4 SEMA3-AP融合蛋白的獲取

將HEK293T細(xì)胞傳代于預(yù)先用0.1 mg/ml多聚賴氨酸包被的10 cm培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞匯合度接近70%時(shí),取8 μg質(zhì)粒DNA(已構(gòu)建好的野生型及突變型全長cDNA表達(dá)質(zhì)粒)與24 μl Lipofectamine 2000分別溶于400 μl opti-MEM液中室溫靜置5 min,把對應(yīng)的質(zhì)粒和Lipofectamine 2000混勻(共800 μl),再室溫靜置20 min,最后將混合液均勻滴入HEK293T無雙抗細(xì)胞培養(yǎng)基中并于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)12 h,將細(xì)胞培養(yǎng)液換為低血清的opti-MEM再培養(yǎng)72 h收集含有SEMA3C/3D-AP融合蛋白的細(xì)胞上清液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 SEMA3-AP融合蛋白定量檢測

將含有SEMA3C/3D-AP融合蛋白的細(xì)胞上清液用lysis buffer稀釋25倍至50 μl,再與預(yù)先加至96孔板中的50 μl 2×SEAP混合(避光),迅速移至多功能酶標(biāo)儀,將機(jī)器設(shè)置為每15 s讀取一次數(shù)據(jù),讀取5次(OD1,OD2,OD3,OD4,OD5),讀取波長405 nm。按以下公式計(jì)算Sema3-AP融合蛋白濃度:SEMA3-AP融合蛋白濃度(nmol/ml)=(OD5-OD1)×50/3.5

1.6 ENCC原代培養(yǎng)及性質(zhì)鑒定

在冰浴及無菌條件下,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉懷孕16 d的SD大鼠,解剖大鼠取出10只胎鼠轉(zhuǎn)移到細(xì)胞間,置于超凈工作臺(tái)中含雙抗的預(yù)冷PBS溶液內(nèi),解剖胎鼠分離出腸管。收集所有腸組織,清洗2遍,用小剪刀快速剪碎,800 r/min離心3 min,留沉淀。加稀釋后的胰蛋白酶消化4 min,胎牛血清終止消化,1 000 r/min離心3 min,留沉淀。再加PBS 13 ml,用70 μm的過濾篩過濾雜質(zhì),過濾液以1 200 r/min離心4 min,留沉淀,并按照1×106個(gè)細(xì)胞/ml接種于T25培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)24 h,以2/3量換液,再孵育3 d進(jìn)行傳代,之后可以2-4 d一代的速度傳代,傳代2次后便不含雜質(zhì)細(xì)胞。

將克隆球傳代于預(yù)先爬片并用0.1 mg/ml多聚賴氨酸包被6 h的24孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h,取出細(xì)胞用4%多聚甲醛、0.5% Triton X-100各處理20 min,5% BSA封閉1 h,然后用P75NTR(1 ∶500)4 ℃孵育過夜,用Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗兔IgG(1 ∶200)室溫孵育1 h,DAPI染核1 min,最后取出蓋玻片,封片劑封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.7 細(xì)胞免疫熒光染色

將克隆球傳代于預(yù)先爬片并用0.1 mg/ml多聚賴氨酸包被6 h的24孔板內(nèi),分別加入含0.5 nm/ml野生型或突變型SEMA3C/3D-AP融合蛋白的細(xì)胞上清液孵育72 h,將培養(yǎng)基換為促分化培養(yǎng)基再孵育7 d,取出細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。

先用4%多聚甲醛固定20 min,PBS洗3次,然后用0.5%Triton X-100透膜10 min,PBS洗3次,用5%BSA封閉30 min,PBS洗3遍,最后用相應(yīng)一抗(Peripherin 1 ∶200,GFAP 1 ∶200,MASH1 1 ∶200)4 ℃孵育過夜,PBS洗3遍,再用相應(yīng)的二抗(1 ∶200)室溫孵育1 h,PBS洗3遍。少量DAPI染核1 min,取出蓋玻片封片劑封片,在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖片,最后采用Image-Pro Plus 6.0軟件記錄Peripherin、GFAP、MASH1的熒光強(qiáng)度值,用Peripherin熒光強(qiáng)度值/GFAP熒光強(qiáng)度值來反映細(xì)胞分化能力,用Peripherin熒光強(qiáng)度值/MASH1熒光強(qiáng)度值來反映細(xì)胞成熟能力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

1.8 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

將克隆球傳代于Transwell上室中,下室中加入含0.5 nm/ml野生型或突變型SEMA3C/3D-AP融合蛋白的細(xì)胞上清液,同時(shí)在下室中加入10% FBS、上室中加入5% FBS促進(jìn)細(xì)胞的分化,5% CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)60 h取出Transwell板,用棉簽擦掉小室內(nèi)表面未遷移的細(xì)胞,4%多聚甲醛固定20 min,再用0.1%結(jié)晶紫染色30 min,清水漂洗,顯微鏡下觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次,采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)用于進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SEMA3C/3D-AP融合蛋白定量檢測

SEMA3C/3D-AP融合蛋白定量檢測結(jié)果(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)見表1。根據(jù)測量結(jié)果將其濃度按一定比例統(tǒng)一稀釋為0.5 nmol/ml,存放于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 HEK293T細(xì)胞上清液中SEMA3C/3D-AP融合蛋白定量檢測結(jié)果

Table 1 Quantitative detection of SEMA3C/3D-AP fusion protein in the supernatant of HEK293T cells

上清液 OD1OD5濃度(nmol/ml)lysisbuffer0.248±0.0050.248±0.007 0±0.029AP2.765±0.0043.046±0.0114.014±0.1143CWT-AP2.589±0.1672.865±0.1993.943±0.4573CS329G-AP2.915±0.0593.241±0.0674.657±0.1143CV337M-AP0.802±0.0270.869±0.0330.964±0.0933DWT-AP0.947±0.0081.029±0.0131.171±0.0573DH424Q-AP0.720±0.0120.778±0.0130.836±0.0213DV457I-AP0.929±0.0331.026±0.0401.386±0.1003DP615T-AP0.975±0.0301.079±0.0391.493±0.136

SEMA3-AP融合蛋白濃度(nmol/ml)計(jì)算公式=(OD5-OD1)×50/3.5

2.2 體外培養(yǎng)腸神經(jīng)嵴細(xì)胞的性質(zhì)鑒定

接種初期的細(xì)胞形態(tài)多樣,孵育2 d開始出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán),繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)會(huì)逐漸增大,在連續(xù)傳代過程中雜細(xì)胞逐漸減少而克隆球逐漸純化,最終傳代2次后便不含雜質(zhì)細(xì)胞,較大的克隆球可懸浮生長。對原代培養(yǎng)的ENCC進(jìn)行性質(zhì)鑒定結(jié)果見圖1,P75NTR染色陽性,表明該克隆球具有神經(jīng)干細(xì)胞特性,為腸神經(jīng)嵴細(xì)胞。純度大于95%,可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)突變型SEMA3C干擾ENCC分化

在0.5 nmol/ml WT和突變型SEMA3C/3D上清液作用下,Peripherin/GFAP和Peripherin/MASH1熒光標(biāo)記的染色結(jié)果分別見圖2和圖3,數(shù)據(jù)分析結(jié)果見圖2C和圖3C。結(jié)果顯示,在SEMA3C處理組中,與空載體組相比,WT SEMA3C處理組的ENCC分化為神經(jīng)元和成熟神經(jīng)元的傾向更加明顯(P<0.01);而與WT組相比,突變型(S329G、V337M)SEMA3C處理組的ENCC分化為神經(jīng)元和成熟神經(jīng)元的能力均下降,其中以V337M突變型SEMA3C處理組的下降最為明顯(P<0.01)。在SEMA3D處理組中,野生型和突變型(H424Q、V457I、P615T)SEMA3D作用下的ENCC分化為神經(jīng)元和成熟神經(jīng)元的能力沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖1 原代培養(yǎng)ENCC性質(zhì)鑒定Figure 1 Identification of primary passage ENCCs

A.野生型和突變型SEMA3C-AP融合蛋白作用下ENCC免疫熒光染色

B.野生型和突變型SEMA3D-AP融合蛋白作用下FENCC免疫染色與AP比較，**P<0.01；與3C WT-AP比較，#P<0.05，##P<0.01

C.統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖2 野生型和突變型SEMA3C/3D-AP融合蛋白對ENCC分化傾向的影響(GFAP:紅色，Peripherin:綠色)

Figure 2 The effect of wild-type and mutant SEMA 3C/3D-AP fusion protein on the differentiation of ENCC

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)SEMA3C/3D對ENCC神經(jīng)球的遷移無明顯影響

在0.5 nm/ml WT和突變型SEMA3C/3D上清液作用下,穿過小室基底膜下層的細(xì)胞,其中右圖為左圖中單個(gè)神經(jīng)球的放大。結(jié)果顯示,對照組、野生型、突變型SEMA3C/3D各處理組中的ENCC神經(jīng)球均可以穿過Transwell小室的基底膜,野生型和突變型SEMA3C/3D對ENCC神經(jīng)球的遷移均沒有明顯影響(見圖4)。

A.野生型和突變型SEMA3C-AP融合蛋白作用下的ENCC免疫熒光染色

B.野生型和突變型SEMA3D-AP融合蛋白作用下的ENCC免疫熒光染色與AP比較，**P<0.01；與3C WT-AP比較，##P<0.01

C.統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖3 野生型和突變型SEMA3C/3D-AP融合蛋白對ENCC成熟度的影響(MASH1:紅色，Peripherin:綠色)

Figure 3 The effect of wild-type and mutant SEMA 3C/3D-AP fusion protein on the maturation of ENCC

右圖為左圖中單個(gè)神經(jīng)球的放大圖4 野生型和突變型SEMA3C/3D-AP融合蛋白對ENCC遷移的影響作用Figure 4 The effect of wild-type and mutant SEMA3C/3D-AP fusion protein on the migration of ENCC

3 討論

SEMA3作為唯一表達(dá)于脊椎動(dòng)物的分泌型神經(jīng)元軸突導(dǎo)向因子,包括7個(gè)亞類分子(SEMA3A至3G)。SEMA3蛋白由400-1 000個(gè)氨基酸構(gòu)成,含有一個(gè)免疫球蛋白樣(immunoglobulin-like)結(jié)構(gòu)區(qū)、一個(gè)PSI(plexins,semaphorins and intesrins)區(qū)域和一個(gè)高度保守的SEMA結(jié)構(gòu)域[8],其中S329G、V337M、H424Q和V457I突變均發(fā)生在高度保守的SEMA結(jié)構(gòu)域,而P615T突變則發(fā)生在Ig結(jié)構(gòu)區(qū)。由于SEMA3對于神經(jīng)軸突的成束、分枝、導(dǎo)向、突觸形成及神經(jīng)元遷移、增殖、分化都具有重要調(diào)控作用,因此,當(dāng)SEMA3發(fā)生突變時(shí),很可能通過影響蛋白的結(jié)構(gòu)和功能引起相關(guān)疾病的發(fā)生[9]。

本研究首次以離體培養(yǎng)的腸神經(jīng)嵴細(xì)胞為對象研究先天性巨結(jié)腸患者攜帶的SEMA3C/3D基因錯(cuò)義突變編碼蛋白的功能變化及其作用機(jī)制。本試驗(yàn)首先參考文獻(xiàn)[10]建立了大鼠胚胎ENCC體外原代培養(yǎng)模型,由于P75NTR為分化前的神經(jīng)嵴細(xì)胞的一種標(biāo)志物[11],所以根據(jù)P75NTR染色陽性和細(xì)胞的生長狀態(tài)可確定該細(xì)胞為腸神經(jīng)嵴細(xì)胞,這種ENCC原代培養(yǎng)技術(shù)的建立為腸神經(jīng)系統(tǒng)疾病病因?qū)W研究提供了極大的便利。Peripherin和GFAP均是一種Ⅲ型中間纖維絲蛋白,參與細(xì)胞骨架系統(tǒng)的構(gòu)成并維持一定的張力強(qiáng)度,其中Peripherin特異性地表達(dá)于神經(jīng)元內(nèi),而GFAP特異性地表達(dá)于星型膠質(zhì)細(xì)胞中[12]。MASH1為哺乳動(dòng)物早期神經(jīng)分化發(fā)育的關(guān)鍵基因,多表達(dá)于神經(jīng)元分化之前,并隨著細(xì)胞分化的進(jìn)程表達(dá)量逐漸降低。因此,本研究應(yīng)用神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞(Peripherin、GFAP)特異性標(biāo)志物多重免疫熒光染色法檢測ENCC的分化傾向(Peripherin熒光強(qiáng)度值/GFAP熒光強(qiáng)度值);應(yīng)用不同成熟期神經(jīng)元(Peripherin、MASH1)特異性標(biāo)志物多重免疫熒光染色法檢測ENCC分化后神經(jīng)元的成熟速度(Peripherin熒光強(qiáng)度值/MASH1熒光強(qiáng)度值)。

有研究表明SEMA3在不同的組織結(jié)構(gòu)或發(fā)育期可表現(xiàn)為2種效應(yīng):促進(jìn)作用和抑制作用[13,14]。SEMA3A對皮質(zhì)神經(jīng)軸[15]以及SEMA3E對視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞[16]均表現(xiàn)為抑制作用,但是SEMA3A對膽堿能神經(jīng)元[17]以及SEMA3E對小鼠海馬鉤回神經(jīng)元軸突的生長[18]卻均表現(xiàn)為促進(jìn)作用,Mumblat等[19]的研究發(fā)現(xiàn)SEMA3C對淋巴內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)為抑制作用,可以誘導(dǎo)其細(xì)胞骨架塌陷。本研究的多重免疫熒光染色結(jié)果顯示,野生型SEMA3C可以促進(jìn)ENCC更多的往神經(jīng)元的方向分化,并有促進(jìn)其成熟的作用,而突變型SEMA3C的上述作用較之野生型都明顯減弱。與SEMA3C相比,SEMA3D的作用不明顯。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,野生型和突變型SEMA3C/3D對ENCC神經(jīng)球的遷移均沒有明顯的影響。因此,本研究結(jié)果提示SEMA3C可以通過促進(jìn)ENCC的分化和成熟(而非遷移)促進(jìn)腸神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育,而當(dāng)SEMA3C發(fā)生突變、蛋白質(zhì)功能嚴(yán)重受損時(shí),ENCC則不能正常分化和成熟,繼而引起HSCR的發(fā)生。至于SEMA3D突變蛋白的作用機(jī)制可能還需要進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

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SEMA3C/3Dmutations in Hirschsprung disease patients inhibit the differentiation and maturation of enteric neural crest cells

JIANG Qian1*,YU Kaihui2,ZHANG Zhen3,LI Qi3,XIAO Ping4,SU Lin5,LI Long3,PAN Shangling2

(1DepartmentofMedicalGenetics,BeijingMunicipalKeyLaboratoryofChildDevelopmentandNutriomics,CapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020,China;2DepartmentofPathophysiology,SchoolofPreclinicalSciences,GuangxiMedicalUniversity;3DepartmentofGeneralSurgery,Children’sHospitalAffiliatedtoCapitalInstituteofPediatrics;4DepartmentofPathology,Children’sHospitalAffiliatedtoCapitalInstituteofPediatrics;5AnhuiMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:teaco@126.com)

ObjectiveTo explore the effect ofSEMA3C/3Dmutations in Hirschsprung disease patients on the differentiation, maturation and migration of the enteric neural crest cells(ENCC).MethodsHEK293T cells were transfected with wild-type(WT) and mutant SEMA3C/3D-AP plasmids to collect the fusion protein supernatant. The ENCCs were treated with wild-type and mutant supernatants containing 0.5 nmol/ml of corresponding fusion protein for 72 h. Differentiation, maturation and migration abilities of the ENCC were determined by multiple-immunofluorescence(Peripherin, GFAP, MASH1) and Transwell migration assay.ResultsCompared with WT group, the ability of ENCC to differentiate into neurons/mature neurons both decreased in mutant SEMA 3C groups, especially in V337M SEMA 3C group(P<0.01). The Peripherin/GFAP ratios of WT, S329G and V337M were 0.95±0.34, 0.53±0.35 and 0.28±0.07, respectively;and the Peripherin/MASH1 ratios of WT, S329G and V337M were 1.14±0.17, 0.95±0.38 and 0.60±0.19, respectively. There was no statistically significant difference in migration capacity of ENCC between WT group and mutant SEMA3C/3D group.ConclusionMutant SEMA3C may affect the development of the enteric nervous system by inhibiting the ENCC to differentiate into neurons/mature neurons, which may provide a new clue for the pathogenesis of HSCR.

Hirschsprung disease;SEMA3C/3D; enteric neural crest cell; cell differentiation

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81300266);北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(7142029);北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)個(gè)人項(xiàng)目(2013D003034000007);北京市科技新星基金資助項(xiàng)目(Z151100000315091)

姜茜,女,1979-10生,博士,副研究員,E-mail:teaco@126.com

2017-05-08

R725.7

A

1007-6611(2017)08-0817-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.013