尹曉然,馮 誠(chéng),馬一楠,高曉燕,劉 欣,賈麗君,張寅斌,張 軍

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤科,西安 710004;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化科;*通訊作者,E-mail:yinxiaoran@163.com)

OE19腫瘤干細(xì)胞的無(wú)血清分離培養(yǎng)以及腫瘤干細(xì)胞特性的鑒定

尹曉然1*,馮 誠(chéng)2,馬一楠1,高曉燕1,劉 欣2,賈麗君1,張寅斌1,張 軍2

(1西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤科,西安 710004;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化科;*通訊作者,E-mail:yinxiaoran@163.com)

目的 從人Ⅱ型食管胃交界處腺癌OE19細(xì)胞中分離富集腫瘤干細(xì)胞的懸浮腫瘤細(xì)胞球,鑒定該懸浮腫瘤球細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性。 方法 使用無(wú)血清培養(yǎng)法從OE19細(xì)胞株中富集得到懸浮腫瘤細(xì)胞球,并將其傳代擴(kuò)增;同時(shí)常規(guī)培養(yǎng)OE19親本細(xì)胞。采用MTT實(shí)驗(yàn)、單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、血清分化實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn),研究OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞與OE19親本細(xì)胞的增殖、更新、分化和侵襲能力的差異;使用real-time PCR以及Western blot法檢測(cè)兩者腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志ABCG2和CD133的表達(dá)情況;使用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)研究OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞以及OE19親本細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。由此鑒定懸浮腫瘤球細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性。 結(jié)果 在無(wú)血清培養(yǎng)條件下,OE19細(xì)胞能夠形成懸浮腫瘤細(xì)胞球。懸浮腫瘤球細(xì)胞具有穩(wěn)定傳代的特性以及多向分化的潛能。OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞與OE19親本細(xì)胞相比較高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志ABCG2和CD133(P<0.05),其體外增殖、自我更新、克隆形成、侵襲轉(zhuǎn)移以及裸鼠體內(nèi)成瘤能力均高于OE19親本細(xì)胞(P<0.05)。 結(jié)論 通過(guò)無(wú)血清非黏附培養(yǎng)法可以有效富集OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球。該懸浮腫瘤球細(xì)胞高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志分子ABCG2和CD133,具有腫瘤干細(xì)胞特性。

食管胃交界處腺癌; OE19細(xì)胞; 無(wú)血清培養(yǎng); 腫瘤干細(xì)胞; 腫瘤細(xì)胞球

20世紀(jì)80年代以來(lái)，世界范圍內(nèi)的食管鱗癌和胃遠(yuǎn)端腫瘤的發(fā)病率明顯下降，而美國(guó)白人、歐洲國(guó)家人群以及我國(guó)食管胃交界處腺癌(esophageal-gastric junction adenocarcinoma, AEG)的發(fā)病率逐年升高[1]。Siewert等[2]提出AEG起源于食管末端Z線上下5 cm區(qū)域內(nèi)，是一類(lèi)獨(dú)立的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。按解剖特點(diǎn)將其分為三型：Ⅰ型為食管下段腺癌，腫瘤中心位于Z線上方1-5 cm區(qū)域。Ⅱ型為賁門(mén)腺癌，腫瘤中心位于Z線上1 cm至Z線下2 cm區(qū)域。Ⅲ型為賁門(mén)下胃腺癌，腫瘤中心位于Z線下2-5 cm區(qū)域。Ⅰ型和Ⅱ型AEG傾向于按照食管腺癌治療，Ⅲ型AEG則按胃癌治療[3]。AEG發(fā)病隱匿，癥狀不明顯，許多患者就診時(shí)已達(dá)晚期，錯(cuò)失了最佳的手術(shù)時(shí)期。AEG預(yù)后差，術(shù)后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高，并對(duì)放療以及化療的敏感度欠佳，晚期患者死亡率較高[4]。因此，迫切需要尋找其他有效的治療方法以提高療效，改善患者的生存。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)是腫瘤組織中少數(shù)具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞群體,約占腫瘤組織細(xì)胞總數(shù)的0.01%-2.00%[5]。CSCs具有自我更新和多向分化潛能,具有強(qiáng)大的侵襲能力,能夠逃脫免疫細(xì)胞的攻擊,對(duì)放化療不敏感,是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[6]。因此,消除CSCs成為治療惡性腫瘤的關(guān)鍵。CSCs研究的前提是分離、鑒定CSCs。分離和富集CSCs的方法主要包括通過(guò)特定CSCs標(biāo)記物、使用流式或免疫磁珠、使用無(wú)血清懸浮分選等方法[5,7]。不同的分選方法各有利弊,需要研究者根據(jù)不同腫瘤細(xì)胞的具體情況進(jìn)行權(quán)衡。

本研究采用無(wú)血清非黏附培養(yǎng)法對(duì)AEG細(xì)胞株OE19進(jìn)行分離和富集,對(duì)富集的懸浮腫瘤細(xì)胞球進(jìn)行體內(nèi)外一系列CSCs特性的鑒定,并對(duì)兩個(gè)潛在的CSCs標(biāo)志分子CD133和ABCG2在OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球的表達(dá)及其與CSCs特征之間的內(nèi)在聯(lián)系進(jìn)行探索;旨在建立一種快速分離AEG的CSCs的通用方法,為AEG的CSCs的深入研究提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人Ⅱ型AEG細(xì)胞系OE19，由第三軍醫(yī)大學(xué)房殿春教授饋贈(zèng);胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,0.25%胰酶-EDTA購(gòu)自美國(guó)HyClone公司;重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子(b-FGF)、重組人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)均購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司,B27購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,重組人胰島素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司,Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司;PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司,鼠抗人Oct4和Nanog單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司,鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,鼠抗人CD133單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Millipore公司,鼠抗人ABCG2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ購(gòu)自日本Takara公司。

1.2 無(wú)血清條件下培養(yǎng)OE19細(xì)胞獲取懸浮腫瘤細(xì)胞球

將OE19細(xì)胞接種至含10% FBS的RPMI1640中(完全培養(yǎng)基),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),3-4 d傳代1次,實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OE19細(xì)胞以1×104/ml的濃度接種至含20 ng/ml的EGF、10 ng/ml的bFGF、10 ng/ml的LIF、B27(體積比為1 ∶50)和2 mmol/L的L-谷氨酰胺的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中,37 ℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng),隔日800 r/min離心5 min換液。每日光鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),觀察懸浮腫瘤細(xì)胞球形成的情況。根據(jù)懸浮腫瘤細(xì)胞球的生長(zhǎng)情況,用0.25%胰酶將懸浮腫瘤球消化成單細(xì)胞懸液,1 000 r/min離心5 min,棄上清,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用第3代以后的懸浮腫瘤細(xì)胞球。

另外,為了觀察血清誘導(dǎo)懸浮腫瘤球細(xì)胞的分化現(xiàn)象,選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球,加至含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中,倒置顯微鏡下觀察懸浮腫瘤細(xì)胞球再次貼壁及細(xì)胞形態(tài)的變化情況,并拍照記錄。

1.3 MTT體外增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的增殖能力

采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖。分別取OE19親本細(xì)胞(完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2周以上的細(xì)胞)和OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞(無(wú)血清培養(yǎng)),使用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液,以1×103個(gè)/孔的密度將細(xì)胞加入7塊96孔板中,終體積為200 μl,均用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng),設(shè)空白組,每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。接種后連續(xù)7 d,每隔24 h取出一塊培養(yǎng)板,去除培養(yǎng)基,PBS洗2次,加入終濃度為5 mg/ml的MTT溶液,37 ℃孵育4 h，棄上清,每孔加入150 μl的DMSO處理15 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度值(OD)。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,比較兩者增殖能力的差異。

1.4 單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OE19懸浮腫瘤球單個(gè)細(xì)胞的增殖能力

取OE19親本細(xì)胞和OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球,胰酶消化,使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋成50個(gè)細(xì)胞/100 μl,以每孔2 μl分別接種于96孔板中,無(wú)血清體系的終體積為200 μl。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察,對(duì)單個(gè)細(xì)胞孔做標(biāo)記并記錄其孔數(shù)量,培養(yǎng)2周,分別統(tǒng)計(jì)形成懸浮腫瘤細(xì)胞球的孔數(shù),比較兩組懸浮腫瘤細(xì)胞球形成率的差別。懸浮腫瘤細(xì)胞球形成率=形成懸浮腫瘤細(xì)胞球的孔數(shù)/接種單個(gè)細(xì)胞孔數(shù)×100%。

1.5 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的侵襲能力

按1 ∶4的比例將Matrigel膠與無(wú)血清RMPI1640培養(yǎng)液混勻,包被Transwell小室底部,室溫風(fēng)干4-5 h。吸出培養(yǎng)板中殘余的液體,取OE19親本細(xì)胞和OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球,制備單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。Transwell小室內(nèi)分別加入1×104細(xì)胞,小室外加入含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)12 h后取出小室,用棉棒輕輕擦去微孔膜上層細(xì)胞,4%多聚甲醛固定,1%結(jié)晶紫染色,PBS漂洗,顯微鏡下觀察小室膜下層細(xì)胞。隨機(jī)記錄5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù),統(tǒng)計(jì)結(jié)果。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 real-time PCR檢測(cè)OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞CSCs標(biāo)志分子ABCG2、CD133的mRNA表達(dá)

取OE19親本細(xì)胞和OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球,使用Trizol法提取總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA在260 nm和280 nm的吸光度值,并根據(jù)A260值計(jì)算RNA濃度?？俁NA按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s),反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩DNA在ABI定量PCR儀上進(jìn)行兩步法real-time PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s,退火、延伸60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán))。采用ABI 7300 SDS Software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。mRNA的表達(dá)量表示為對(duì)照組細(xì)胞的N倍,N=樣品表達(dá)量/基準(zhǔn)表達(dá)量=(2-樣本ΔCt)/(2-基準(zhǔn)ΔCt)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[8]。

CSCs標(biāo)志分子ABCG2、CD133以及內(nèi)參β-actin的引物由大連寶生物工程有限公司合成,實(shí)驗(yàn)所需引物序列見(jiàn)表1。

1.7 Western blot檢測(cè)OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞CSCs標(biāo)志分子ABCG2、CD133的蛋白表達(dá)

取OE19親本細(xì)胞和OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球,使用蛋白裂解法提取總蛋白,使用BCA法進(jìn)行蛋白定量。1×Loading buffer將樣品調(diào)成相同濃度,沸水煮5-10 min將蛋白變性。取適當(dāng)?shù)鞍讟悠愤M(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,使用半干電轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉4 h。加入待檢測(cè)的ABCG2(1 ∶1 000)和CD133(1 ∶1 000)一抗,將β-actin(1 ∶1 000)作為內(nèi)參照,4 ℃過(guò)夜。PBST洗膜,加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1 ∶10 000),室溫孵育2 h,PBST洗膜,PBS沖洗。ECL顯色,化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)觀察并拍照。使用IPP軟件檢測(cè)條帶,結(jié)果以各組蛋白與內(nèi)參的比值表示[9]。

表1 CSCs標(biāo)志分子的引物序列

Table 1 Primer sequences of cancer stem cell markers

標(biāo)志分子 Sequence(5'-3') ABCG2Forward:CACAAGGAAACACCAATGGCTReverse:ACGCCTTGTCCTTGGTAGTGTTG CD133Forward:AGTGGCATCGTGCAAACCTGReverse:CTCCGAATCCATTCGACGATA β-actinForward:TGGCACCCAGCACAATGAAReverse:CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAG-CA

1.8 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力

4-6周齡裸小鼠,雌性,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,于恒定溫度(22-25 ℃)、恒定濕度(40%-50%)的SPF層流室中分籠飼養(yǎng),食用高壓滅菌的標(biāo)準(zhǔn)飼料和水。

取OE19親本細(xì)胞和OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球,制成單細(xì)胞懸液。OE19親本細(xì)胞以1×105/100 μl、1×104/100 μl和1×103/100 μl接種于小鼠左側(cè)背部皮下,OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞以1×104/100 μl、1×103/100 μl和1×102/100 μl接種于小鼠右側(cè)背部皮下。每組6只鼠,每天觀察腫瘤形成以及生長(zhǎng)情況,每3 d測(cè)量1次移植瘤的大小,連續(xù)4周,至觀察期達(dá)12周。腫瘤體積V=a×b2/2(a為長(zhǎng)徑,b為短徑)。處死、解剖小鼠,剝?nèi)∧[瘤稱(chēng)重、測(cè)量瘤體積,拍照并將兩組移植瘤行HE染色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 無(wú)血清分離培養(yǎng)OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球

OE19細(xì)胞在含10% FBS的培養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng),貼壁細(xì)胞呈梭形伸展。而在無(wú)血清條件培養(yǎng)液中,消化成為單細(xì)胞接種3 d后,部分單細(xì)胞形成若干大小、形態(tài)不等的懸浮腫瘤細(xì)胞球,細(xì)胞間連接較緊密。培養(yǎng)6-8 d后,細(xì)胞球包含的腫瘤細(xì)胞數(shù)目逐漸增多,細(xì)胞呈球形或橢圓形立體生長(zhǎng),體積逐漸增大。生長(zhǎng)至10 d左右,形成含數(shù)十個(gè)腫瘤細(xì)胞的懸浮腫瘤細(xì)胞球,呈橢圓形或者類(lèi)圓形,球內(nèi)細(xì)胞結(jié)合緊密,球體飽滿,折光性強(qiáng)(見(jiàn)圖1)。說(shuō)明在無(wú)血清條件培養(yǎng)液中,部分OE19細(xì)胞能夠存活并增殖形成懸浮腫瘤細(xì)胞球。

將OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球消化后繼續(xù)置于無(wú)血清培養(yǎng)環(huán)境中,一部分可以再形成新的腫瘤細(xì)胞球,依次傳代,連續(xù)10代以上仍然可以形成腫瘤細(xì)胞球。OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球的生長(zhǎng)隨著代數(shù)的增多有加速趨勢(shì),完全培養(yǎng)基中的OE19親本細(xì)胞則無(wú)此特點(diǎn)(見(jiàn)圖2)。說(shuō)明無(wú)血清培養(yǎng)條件下,OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球中的部分細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新能力,并且CSCs富集的程度可隨傳代的增多而提高。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球的形態(tài)(×200)Figure 1 The morphology of floating tumor spheres of OE19 cells under inverted phase contrast microscope at different culture time points (×200)

圖2 不同傳代次數(shù)OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球的形態(tài) (×200)Figure 2 The morphology of OE19 floating tumor spheres in various generations under inverted phase contrast microscope (×200)

2.2 含血清條件下OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的分化

將OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球置于含血清環(huán)境中,12 h后腫瘤細(xì)胞球周邊可見(jiàn)細(xì)胞貼壁,貼壁細(xì)胞呈梭形伸展;隨著時(shí)間的延長(zhǎng),貼壁細(xì)胞逐漸增多,且腫瘤細(xì)胞球逐漸縮小;培養(yǎng)48 h后,腫瘤球細(xì)胞全部貼壁;繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞聚集成團(tuán)生長(zhǎng),失去典型的細(xì)胞形態(tài)(見(jiàn)圖3)。說(shuō)明在含血清條件下,OE19懸浮腫瘤球中的部分細(xì)胞具備多向分化為異質(zhì)腫瘤細(xì)胞的能力。

2.3 OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的增殖能力

用MTT法分別檢測(cè)OE19親本細(xì)胞以及OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示,OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球組的吸光值(A值)較對(duì)照組OE19親本細(xì)胞明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖4)。說(shuō)明OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的增殖能力明顯高于OE19親本細(xì)胞。

圖3 含血清培養(yǎng)基中OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的分化能力 (×200)Figure 3 The differentiation ability of OE19 floating tumor sphere cells under inverted phase contrast microscope (×200)

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖4 MTT檢測(cè)OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的增殖能力Figure 4 The proliferation ability of OE19 floating tumor sphere cells by MTT assay

取單個(gè)OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞以及OE19親本細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng),培養(yǎng)2周,計(jì)算克隆球形成率。結(jié)果顯示,OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球組克隆球形成率為(13.37±1.36)%,而OE19親本細(xì)胞組觀察2周無(wú)一形成克隆球。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,無(wú)血清培養(yǎng)篩選出的OE19懸浮腫瘤球中富集了具有自我更新能力的腫瘤細(xì)胞。

2.4 OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的侵襲能力

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球組穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)為(216±34)個(gè)/視野,對(duì)照組OE19親本細(xì)胞穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)為(73±18)個(gè)/視野,差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖5)。說(shuō)明OE19懸浮腫瘤球組細(xì)胞比OE19親本細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力。

2.5 OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的ABCG2和CD133的mRNA表達(dá)

通過(guò)real-time PCR檢測(cè)在OE19親本細(xì)胞及OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞中的CSCs標(biāo)志ABCG2和CD133的mRNA表達(dá)差異，結(jié)果顯示,OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球組ABCG2的mRNA表達(dá)與對(duì)照組OE19親本細(xì)胞中ABCG2的mRNA表達(dá)分別為1.70±0.17和1.00±0.25,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖6);OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球組CD133的mRNA表達(dá)與對(duì)照組OE19親本細(xì)胞中CD133的mRNA表達(dá)分別為2.43±0.26和1.00±0.14,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖6)。提示在mRNA水平,OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞中CSCs標(biāo)志ABCG2和CD133的表達(dá)明顯升高。

與親本細(xì)胞比較,**P<0.01圖5 Transwell檢測(cè)OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的侵襲能力(×200)Figure 5 The invasion ability of OE19 floating tumor sphere cells by Transwell assay (×200)

2.6 OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的ABCG2和CD133的蛋白表達(dá)

通過(guò)Western blot檢測(cè)在OE19親本細(xì)胞及OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞中的CSCs標(biāo)志ABCG2和CD133蛋白表達(dá)的差異，結(jié)果顯示,經(jīng)β-actin標(biāo)準(zhǔn)化定量后,懸浮腫瘤球細(xì)胞組中ABCG2的蛋白表達(dá)

與親本細(xì)胞比較,*P<0.05,**P<0.01圖6 Real-time PCR檢測(cè)OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞中CD133和ABCG2的mRNA表達(dá)Figure 6 The mRNA expression of ABCG2 and CD133 in OE19 floating tumor sphere cells by real-time PCR assay

與親本細(xì)胞組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖7)、懸浮腫瘤細(xì)胞球組中CD133的蛋白表達(dá)與對(duì)照組OE19親本細(xì)胞中CD133的蛋白表達(dá)分別為4.63±0.52和1.00±0.11,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見(jiàn)圖7)。提示在蛋白水平,OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞中CSCs標(biāo)志ABCG2和CD133的表達(dá)明顯升高。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖7 Western blot檢測(cè)OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞中CD133和ABCG2蛋白的表達(dá)Figure 7 The protein expression of ABCG2 and CD133 in OE19 floating tumor sphere cells by Western blot assay

2.7 OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞裸鼠體內(nèi)致瘤能力

取OE19親本細(xì)胞和OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球,制成單細(xì)胞懸液,分別以1×102/100 μl(A組),1×104/100 μl(B組)和1×106/100 μl(C組)接種100 μl至裸鼠左側(cè)以及右側(cè)背部皮下，觀察并記錄移植瘤形成的時(shí)間、瘤體大小。移植后第28天處死小鼠,移植瘤組織行HE染色病理檢查。結(jié)果顯示,觀察至第28天,接種OE19親本細(xì)胞的A組和B組裸鼠未見(jiàn)腫瘤形成、C組裸鼠可見(jiàn)腫瘤形成,接種OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的A、B、C三組裸鼠均可見(jiàn)腫瘤形成(見(jiàn)表2,圖8)。同一組中,OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的成瘤速度及成瘤率均高于OE19親本細(xì)胞,OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞成瘤力顯著強(qiáng)于OE19親本細(xì)胞,成瘤潛伏期也要短于OE19親本細(xì)胞組。移植瘤病理切片行HE染色,均可見(jiàn)典型的AEG腫瘤組織表現(xiàn)(見(jiàn)圖9)。說(shuō)明OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞具有更強(qiáng)的體內(nèi)致瘤能力。

表2 OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞的裸鼠成瘤情況

Table 2 Tumor formation of OE19 tumor sphere cells in nude mice

分組n成瘤小鼠數(shù)量(個(gè))親本細(xì)胞懸浮腫瘤球細(xì)胞A組601B組604C組656

3 討論

CSCs不但具有無(wú)限增殖的潛能,而且具有多向分化的能力,能夠產(chǎn)生不同表型的腫瘤細(xì)胞,使腫瘤不斷增大[10]。CSCs對(duì)放化療耐受,并且能夠逃脫血液免疫細(xì)胞的攻擊。CSCs還具有強(qiáng)大的侵襲能力,能夠通過(guò)血液循環(huán)、淋巴循環(huán)、種植等途徑轉(zhuǎn)移到其他器官并生長(zhǎng)[11]。目前,在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌以及肝癌等多種實(shí)體腫瘤中,已成功分離并鑒定出CSCs[12-16]。

AEG的CSCs的分離是研究者亟待解決的問(wèn)題之一。SP細(xì)胞篩選法、表面標(biāo)記物篩選法、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法以及耐藥培養(yǎng)法等是分離和富集CSCs的主要方法。然而,染色分離過(guò)程中使用的染料的毒性可以干擾SP細(xì)胞的成瘤能力,依靠特異性標(biāo)記物分選出的陽(yáng)性CSCs則因?yàn)榧?xì)胞亞群數(shù)量少、壽命短而不利于長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn),并且包括AEG在內(nèi)的多數(shù)腫瘤的CSCs表面特異性標(biāo)志物也尚不明確。由于一般腫瘤細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)環(huán)境中難以存活,而CSCs則能夠在該環(huán)境中生存，擴(kuò)增形成懸浮腫瘤細(xì)胞球，并且長(zhǎng)期保持未分化狀態(tài)[15]。并且,無(wú)血清培養(yǎng)法具有簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、高效的優(yōu)點(diǎn)[14]。因此,國(guó)內(nèi)外研究者多使用無(wú)血清非黏附培養(yǎng)法分離特異性標(biāo)志物未知腫瘤的CSCs[13,14,17,18]。另外,真正的CSCs能夠形成二代、三代甚至以上的細(xì)胞球,為保證結(jié)果的可靠性,本研究所有實(shí)驗(yàn)均使用第三代懸浮腫瘤細(xì)胞球。

左:OE19親本細(xì)胞,右:OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞圖8 裸鼠皮下食管癌異種移植瘤生長(zhǎng)第28天的形態(tài)觀察Figure 8 The morphology of subcutaneously esophageal cancer xenografted tumors after transplanted for 28 d

圖9 裸鼠皮下食管癌異種移植瘤組織HE染色的病理形態(tài)觀察 (×400)Figure 9 The pathological morphology of subcutaneously esophageal cancer xenografted tumors by HE staining (×400)

CSCs除了具有自我更新、多向分化兩大特性之外,還必須具有較強(qiáng)的致瘤性[16]。因此,鑒定CSCs是從腫瘤中分離出特定的細(xì)胞亞群,再對(duì)這群細(xì)胞進(jìn)行體外增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)以及再分化實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)等研究,進(jìn)一步驗(yàn)證其CSCs特性。其中,缺乏免疫力的動(dòng)物體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)是鑒定CSCs的“金標(biāo)準(zhǔn)”[13,15]。本研究使用無(wú)血清培養(yǎng)法從AEG細(xì)胞OE19中分離富集可穩(wěn)定傳代的懸浮腫瘤細(xì)胞球,并通過(guò)體外MTT實(shí)驗(yàn)、單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、血清分化實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)以及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)等研究證明,無(wú)血清培養(yǎng)獲得的OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球比OE19親代細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力、成瘤能力、自我更新能力、分化能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力。

干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)于CSCs干性的維持具有重要作用,這些基因的表達(dá)上調(diào)與其強(qiáng)大的增殖、自我更新和分化能力緊密相關(guān),也是鑒定CSCs的常用方法之一[19]。多種腫瘤CSCs高表達(dá)ABCG2以及CD133,是可重復(fù)性較高的CSCs標(biāo)志物[13,20]。ABCG2又稱(chēng)乳腺癌耐藥蛋白,是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,能夠介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的抵抗[16]。CD133是轉(zhuǎn)膜糖蛋白,其高表達(dá)往往提示惡性生物學(xué)行為和高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[13]。AEG的CSCs沒(méi)有公認(rèn)的分子標(biāo)志物。本研究在成功分離培養(yǎng)出AEG的OE19細(xì)胞株懸浮腫瘤球的基礎(chǔ)上,針對(duì)ABCG2和CD133進(jìn)行檢測(cè)。Real-time PCR以及Western blot的結(jié)果顯示,OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞ABCG2和CD133的mRNA以及蛋白的表達(dá)明顯高于OE19親本細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中以CD133的差異尤為明顯。結(jié)果提示,ABCG2和CD133在OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球的共表達(dá)細(xì)胞,可能是具有CSCs特性的亞群。

總之,本研究使用無(wú)血清培養(yǎng)AEG的OE19細(xì)胞,分離、富集出OE19懸浮腫瘤細(xì)胞球,是快速易行的方法;進(jìn)而通過(guò)體內(nèi)外的一系列研究證實(shí),OE19懸浮腫瘤球細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的CSCs特性,高表達(dá)CSCs標(biāo)志分子CD133和ABCG2,可能是代表AEG CSCs的亞群。本研究為AEG CSCs生物學(xué)特性的深入研究以及靶向治療奠定了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] Pohl H, Sirovich B, Welch HG. Esophageal adenocarcinoma incidence: Are we reaching the peak?[J]. Cancer Epidemiol Bio-markers Prev, 2010, 19(6):1468-1470.

[2] Siewert JR, Stein HJ, Sendler A,etal.Surgical resection for cancer of the cardia[J]. Semin Surg Oncol,1999,17(2):125-131.

[3] Japan Esophageal Society. Japanese classification of esophageal cancer, 11th edition: part Ⅱ and Ⅲ[J]. Esophagus, 2017, 14(1):37-65.

[4] Schulze B, Bergis D, Balermpas P,etal. Neoadjuvant chemoradiation versus perioperative chemotherapy followed by surgery in resectable adenocarcinomas of the esophagogastric junction: A retrospective single center analysis[J]. Oncol Lett, 2014, 7(2):534-540.

[5] Jiang W, Peng J, Zhang Y,etal. The implications of cancer stem cells for cancer therapy[J]. Int J Mol Sci, 2012, 13(12):16636-16657.

[6] Luna JI, Grossenbacher SK, Murphy WJ,etal. Targeting cancer stem cells with natural killer cell immunotherapy[J]. Expert Opin Biol Ther, 2017, 17(3):313-324.

[7] Qi W, Chen J, Cheng X,etal. Targeting the Wnt-regulatory protein CTNNBIP1 by micro RNA-214 enhances the stemness and self-renewal of cancer stem-like cells in lung adenocarcinomas[J]. Stem Cells, 2015, 33:3423-3436.

[8] 尹曉然,馮誠(chéng),張軍,等.DADS抑制食管胃交接部腺癌細(xì)胞OE19增值及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,35(3):370-374.

[9] 尹曉然,馮誠(chéng),張軍,等.DADS對(duì)TE-1體外以及裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的影響及作用機(jī)制[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,44(12):919-922.

[10] Ebben JD, Treisman DM, Zorniak M,etal. The cancer stem cell paradigm: a new understanding of tumor development and treatment[J]. Expert Opin Ther Targets, 2010, 14(6):621-632.

[11] Bomken S, Fiser K, Heidenreich O,etal. Understanding the cancer stem cell[J]. Br J Cancer, 2010, 103(4): 439-445.

[12] Rakian R, Block TJ, Johnson SM,etal. Native extracellular matrix preserves mesenchymal stem cell "stemness" and differentiation potential under serum-free culture conditions[J]. Stem Cell Res Ther, 2015, 6:235-246.

[13] Chen KL, Pan F, Jiang H,etal. Highly enriched CD133(+)CD44(+) stem-like cells with CD133(+) CD44(high) metastatic subset in HCT116 colon cancer cells[J]. Clin Exp Metastasis, 2011, 28(8): 751-763.

[14] 劉攀，周向東.大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞生物學(xué)特性[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014,34(4):453-457.

[15] Cao L, Zhou Y, Zhai B,etal. Sphere-forming cell subpopulations with cancer stem cell properties in human hepatoma cell lines[J]. BMC Gastroenterol, 2011, 11: 71-82.

[16] Nakanishi T, Ross DD. Breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2): its role in multidrug resistance and regulation of its gene expression[J]. Chin J Cancer, 2012, 31(2):73-99

[17] Yang Y, Fan Y, Qi Y,etal. Side population cells separated from A549 lung cancer cell line possess cancer stem cell-like properties and inhibition of autophagy potentiates the cytotoxic effect of cisplatin[J]. Oncol Rep, 2015, 34(2): 929-935.

[18] Weiswald LB, Bellet D, Dangles-Marie V. Spherical cancer models in tumor biology[J]. Neoplasia, 2015, 17(1):1-15.

[19] Alamgeer M, Peacock CD, Matsui W,etal. Cancer stem cells in lung cancer: Evidence and controversies[J]. Respirology, 2013, 18(5):757-764.

[20] Hu J, Li J, Yue X,etal. Targeting BCRP/ABCG2 by RNA interference enhances the chemotherapy sensitivity of human colon cancer side population cells[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2017, 37(2):231-236.

Serum-free suspension culture and identification of cancer stem cells from human OE19 cell line

YIN Xiaoran1*,FENG Cheng2,MA Yinan1,GAO Xiaoyan1,LIU Xin2,JIA Lijun1,ZHANG Yinbin1,ZHANG Jun2

(1DepartmentofOncology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;2DepartmentofDigestion,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:yinxiaoran@163.com)

ObjectiveTo isolate the floating tumor spheres from human type Ⅱesophageal-gastric junction adenocarcinoma cell line OE19, and to identify their cancer stem cell characteristics.MethodsOE19 cells were cultured in the serum-free medium to form the floating tumor spheres, and OE19 parent cells were cultured in serum medium with 10%FBS. MTT assay, single cell clone formation experiment, serum differentiation test and Transwell assay were employed to observe the proliferation, self-renewal, differentiation and invasive abilities of OE19 tumor spheres and OE19 parent cells. Real-time PCR and Western blot assays were performed to detect the expression of stem cell markers(ABCG2 and CD133) in OE19 tumor sphere cells and OE19 parent cells. OE19 tumor sphere cells and OE19 parent cells were inoculated subcutaneously in nude mice and the tumor growth was assessed to identify the cancer stem cell property.ResultsIn the serum-free medium, the cancer stem cells isolated from OE19 cells grew as floating tumor spheres, which had stable transmission and multi-directional differentiation characteristics. The expression of stem cell markers such as ABCG2 and CD133 in OE19 tumor sphere cells was higher than that in OE19 parent cells(P<0.05). Moreover, the proliferation, self-renewal, proliferation and invasive abilities of OE19 tumor sphere cells, and the tumorigenicity in nude mice of OE19 tumor sphere cells were stronger than that of OE19 parent cells(P<0.05).ConclusionIsolating tumor spheres without adhesion from OE19 cells in serum-free medium can be a quick and easy method.The floating tumor spheres are of high expression of ABCG2 and CD133, and possess cancer stem cell characteristics.

esophageal-gastric junction adenocarcinoma; OE19 cells; serum-free culture; cancer stem cell; tumor sphere

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81274136);陜西省社發(fā)攻關(guān)基金資助項(xiàng)目(2011K13-02-05)

尹曉然,女,1980-12生,博士,副主任醫(yī)師,E-mail:yinxiaoran@163.com

2017-04-05

R735

A

1007-6611(2017)08-0800-08

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.010