李玉宇,徐劍文

(1福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，神經(jīng)生物中心,福州 350108;2三明職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護學(xué)院解剖生理教研室;*通訊作者,E-mail:fjxjw@126.com)

新生大鼠缺氧性腦損傷模型的建立及評價

李玉宇1,2,徐劍文1*

(1福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，神經(jīng)生物中心,福州 350108;2三明職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護學(xué)院解剖生理教研室;*通訊作者,E-mail:fjxjw@126.com)

目的 模擬新生兒出生窒息,建立新生大鼠缺氧性腦損傷模型。 方法 將新生大鼠短暫置于100%氮氣環(huán)境中,建立出生窒息的模型。18只新生大鼠隨機分為對照組、缺氧10 min組、缺氧20 min組,采用神經(jīng)行為學(xué)觀察、Nissl染色及透射電鏡觀察腦組織病理變化等方法,評價動物模型的可靠性。 結(jié)果 缺氧過程新生大鼠均出現(xiàn)全身紫紺、意識障礙等精神行為的異常。Nissl染色可見缺氧10 min海馬CA1區(qū)部分神經(jīng)元腫脹,缺氧20 min神經(jīng)元損傷加重。尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)量缺氧10 min組低于對照組(P<0.05),缺氧20 min組顯著低于對照組(P<0.01)。超微結(jié)構(gòu)顯示:缺氧10 min神經(jīng)元出現(xiàn)染色質(zhì)邊集,微血管內(nèi)皮細(xì)胞空泡變性;缺氧20 min神經(jīng)元壞死,核溶解,細(xì)胞器模糊不清。微血管周圍星膠細(xì)胞腳板、細(xì)胞突起均腫脹。 結(jié)論 新生大鼠短暫置于100%氮氣中,可建立簡便可靠的新生鼠缺氧性腦損傷模型。

缺氧； 動物模型; 腦損傷; Nissl染色; 透射電鏡; 大鼠

胎兒窘迫與新生兒窒息是導(dǎo)致新生兒缺氧性腦損傷的主要因素,嚴(yán)重威脅著新生兒的生命和健康,可造成新生兒學(xué)習(xí)能力降低、運動障礙和智能低下等永久性神經(jīng)功能的損害[1]。探索該病的發(fā)病機制是尋求有效治療方案的根本途徑[2],有關(guān)研究多在能模擬缺氧性腦損傷并且簡單、重復(fù)性好、致死率低、易于觀測指標(biāo)的動物模型上進行。

建立缺氧性腦損傷模型的方法較多,如結(jié)扎頸總動脈結(jié)合缺氧法[3,4]、局部短暫腦缺血及再灌注法[5]、宮內(nèi)缺氧缺血法[6]及各種改良法[7-9],這些方法對新生兒缺氧性腦損傷的研究提供了大量重要的信息。其中以Rice法[3]最為經(jīng)典,即結(jié)扎7 d齡鼠一側(cè)頸總動脈,持續(xù)吸入8%氧氣與92%氮氣的低氧混合氣體3.5 h,但這種損傷模型可造成局部梗死及致死率高。本課題模擬新生兒窒息,將新生10-24 h SD大鼠短暫置于100%氮氣環(huán)境中,建立新生大鼠缺氧性腦損傷模型,通過神經(jīng)行為觀察和光鏡、電鏡技術(shù)證實,探討新模型的可靠性和簡便性。

1 材料與方法

1.1 動物分組

取SPF級新生10-24 h體質(zhì)量500-700 g SD大鼠18只,雌雄不拘,由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(閩)2012-0001。按照動物體質(zhì)量隨機分為正常對照組、缺氧10 min組和缺氧20 min組(n=6)。

1.2 動物缺氧模型的建立

將新生10-24 h SD大鼠置于36 ℃恒溫水浴有機玻璃缺氧箱(方形密閉裝置,其一側(cè)近底部小孔為排氣孔,對應(yīng)一側(cè)的近頂部小孔與氮氣源連接,便攜式氣體檢測儀置于其中),以1-2 L/min流量分別持續(xù)通入100%氮氣10 min、20 min,氧濃度以T2A-7X9便攜式氣體檢測儀監(jiān)測(見圖1A、1B)。復(fù)氧20 min返回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng)。正常對照組不做任何處理,對照組與缺氧組大鼠模型見圖1C。

A.缺氧裝置 B.缺氧實施 C.對照組與缺氧組模型圖1 新生大鼠缺氧模型Figure 1 Hypoxic model of neonatal rat

1.3 神經(jīng)行為學(xué)觀察

觀察正常對照組、缺氧10 min組、缺氧20 min組每只大鼠是否有夾尾尖叫、翻身能力異常,并記錄是否出現(xiàn)肢體抖動、驚厥、意識障礙,出現(xiàn)上述一項以上異常作為神行為異常的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 石蠟切片的制備

造模后24 h內(nèi)各組大鼠用乙醚麻醉,經(jīng)心臟依次灌注預(yù)冷的生理鹽水、含4%多聚甲醛的PB,取腦組織于上述相同固定液中后固定,脫水,透明,浸蠟,石蠟包埋。沿丘腦中1/3水平連續(xù)冠狀切片(顯示大鼠海馬結(jié)構(gòu),片厚5 μm)。間隔5張片取1張,每一標(biāo)本各取10張備用。

1.5 Nissl染色

石蠟切片常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水化,1%甲苯胺藍(lán)溶液56 ℃ 45 min-1 h,自來水沖洗,酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。切片在光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個視野攝片。Image Pro Plus6.0軟件分析尼氏體吸光度。吸光度代表尼氏體的表達(dá)水平,吸光度越大,陽性表達(dá)越強。

1.6 透射電鏡觀察

造模后24 h內(nèi)各組大鼠乙醚麻醉,取腦分離出海馬CA1區(qū),3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定2 d(4 ℃),1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定1.5 h,PBS漂洗;70%酒精飽和醋酸鈾染液塊染,酒精-丙酮梯度脫水,環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋。超薄切片80 nm,醋酸鈾、檸檬酸鉛各染色5 min;在日立Hu-12A型或飛利浦EM 208型透射電鏡下觀察海馬CA1神經(jīng)元和微血管變化、攝影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 缺氧過程神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)

缺氧開始新生鼠均出現(xiàn)煩躁不安,全身紫紺,呼吸急促,四處爬動。缺氧2 min活動逐漸減少,夾尾尖叫聲減弱,翻身能力降低或消失,部分有肢體抽動、驚厥及昏睡、昏迷等意識障礙?；謴?fù)正常供氧后膚色逐漸紅潤,活動增加,神經(jīng)行為異常消失。正常對照組未發(fā)生神經(jīng)行為異常。

2.2 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量變化

尼氏體光鏡下為嗜堿性深染的顆?；蛐K,存在于神經(jīng)元胞體和樹突中,經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后細(xì)胞胞質(zhì)呈藍(lán)色,尼氏體呈深藍(lán)色。觀察海馬結(jié)構(gòu)(見圖2A),進一步選取各組CA1區(qū)比較。對照組:海馬CA1區(qū)Nissl染色陽性細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,層次清晰,排列緊密,著色均勻,大小一致(見圖2B)。缺氧10 min組:細(xì)胞數(shù)量減少、排列較稀疏,部分細(xì)胞腫脹(見圖2C)。缺氧20 min組:細(xì)胞數(shù)量明顯減少,形態(tài)不規(guī)則,層次減少,排列紊亂,細(xì)胞腫脹,部分細(xì)胞固縮,尼氏體缺失形成空泡(見圖2D)。缺氧10 min組與對照組比較,尼氏體平均吸光度的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。缺氧20 min組與對照組比較,尼氏體平均吸光度的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,見圖3)。

A.正常海馬結(jié)構(gòu)(×40) B.對照組(×400) C.缺氧10 min組(×400) D.缺氧20 min組(×400)圖2 海馬CA1錐體細(xì)胞層(尼氏染色)Figure 2 CA1 pyramidal cell layer by Nissl staining

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 不同缺氧時間海馬CA1區(qū)尼氏體平均吸光度比較±s)Figure 3 Nissl body average absorbance in hippocampal CA1 at different hypoxia time ±s)

2.3 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元及微血管超微結(jié)構(gòu)變化

海馬CA1區(qū)對照組神經(jīng)元胞核大,呈橢圓形,染色質(zhì)分布均勻,核仁清晰,雙層核膜明顯,胞質(zhì)可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體(見圖4A)。缺氧10 min組神經(jīng)元凋亡早期表現(xiàn):細(xì)胞收縮變圓、核仁消失、核染色質(zhì)邊集；胞質(zhì)內(nèi)次級溶酶體形成(見圖4B)。缺氧20 min組局灶性細(xì)胞壞死,核溶解,細(xì)胞器模糊不清(見圖4C)。對照組微血管橫切面近橢圓形,管腔寬,內(nèi)皮細(xì)胞扁平結(jié)構(gòu)完整,表面較光滑,基底膜未完全形成,管周無水腫病變(見圖4D)。缺氧10 min組微血管內(nèi)皮細(xì)胞空泡變性(見圖4E)。缺氧20 min組微血管基底膜不完整,星膠細(xì)胞腳板腫脹、細(xì)胞突起腫脹(見圖4F)。

3 討論

腦缺氧是腦損傷的一種形式,可引起神經(jīng)細(xì)胞死亡,導(dǎo)致神經(jīng)功能的缺失。圍生期窒息發(fā)生一系列病理生理改變:缺氧開始時,由于低氧血癥和酸中毒,引起體內(nèi)血液重新分布,即肺、腎、肌肉、皮膚等處血管收縮,血流量減少,從而保證生命器官如心、腦等處的供血。如缺氧繼續(xù),無氧代謝使酸性產(chǎn)物極度增加,導(dǎo)致重度代謝性酸中毒,此時體內(nèi)儲存糖原耗盡,血流代償機制喪失,心臟功能受損,心率和動脈壓下降,心、腦等處缺血,導(dǎo)致腦損傷發(fā)生。因此,缺氧是導(dǎo)致新生兒缺氧性腦損傷最主要原因[10-12]。

在預(yù)實驗研究過程中,缺氧持續(xù)時間從10 min到30 min,評估動物的致死率,為達(dá)到最嚴(yán)重的缺氧而致死率最低,最終確定為20 min,在這種情況下動物的致死率為4%,而存活的動物在隨后的哺乳中未表現(xiàn)出明顯的異常。Grojean等[13]在建立新生大鼠缺氧模型后,檢測血液中PO2、PCO2和pH 3項指標(biāo),缺氧組出現(xiàn)低氧血癥、高碳酸血癥和酸中毒的病理生理改變。本研究在建立動物缺氧模型后對大鼠的神經(jīng)行為觀察顯示:缺氧過程中大鼠均出現(xiàn)煩躁不安、全身紫紺、昏迷等精神行為的異常,恢復(fù)正常供氧20 min上述異常消失。

A.對照組神經(jīng)元(×6 300);B.缺氧10 min組神經(jīng)元(×12 500);C.缺氧20 min組神經(jīng)元(×16 000);D.對照組微血管(×8 000);E.缺氧10 min組微血管(×10 000);F.缺氧20 min組微血管(×6 300)圖4 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元和微血管超微結(jié)構(gòu)Figure 4 The ultrastructure of neuron and micrangium in hippocampus CA1

Vert等[14]的研究表明,新生大鼠缺氧后受損的腦細(xì)胞主要是神經(jīng)元,因神經(jīng)元比其他腦細(xì)胞對缺氧更敏感[15-17],并且張留寶等[18]研究證實新生大鼠大腦及海馬神經(jīng)元對缺氧的耐受性不如成年大鼠。Nissl染色是神經(jīng)元的特異性染色方法,Nissl體大而數(shù)量多,說明神經(jīng)元合成蛋白質(zhì)的功能較強;相反在神經(jīng)元受到損傷時,Nissl體的數(shù)量會減少甚至消失。本實驗Nissl染色顯示正常新生大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊,輪廓正常。缺氧10 min部分細(xì)胞腫脹、排列較紊亂,細(xì)胞數(shù)量減少。缺氧20 min病變加重,細(xì)胞層次數(shù)量進一步減少,結(jié)構(gòu)松散,與周圍間隙增寬,尼氏體數(shù)量減少。Nissl染色結(jié)果初步提示本缺氧模型造成新生大鼠腦組織神經(jīng)元的損傷。

近年來逐漸有文獻(xiàn)報道[19-23],新生大鼠在缺氧性腦損傷發(fā)生后存在腦神經(jīng)元凋亡。本研究通過透射電鏡對海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)進行觀察,結(jié)果顯示新生大鼠出生后1-2 d神經(jīng)元發(fā)育較幼稚,基底膜未完全形成。缺氧10 min出現(xiàn)神經(jīng)元早期凋亡,核染色質(zhì)邊集,次級溶酶體形成,提示有選擇性的線粒體損傷,微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生空泡變性。缺氧20 min可見神經(jīng)元壞死、核溶解、細(xì)胞器模糊不清,微血管周圍星膠細(xì)胞腳板腫脹、細(xì)胞突起腫脹。電鏡結(jié)果進一步證明缺氧造成了部分腦組織的壞死和凋亡。

通過對新生大鼠在缺氧過程中的神經(jīng)行為觀察以及光鏡、電鏡技術(shù)的證實,說明本實驗已成功建立新生大鼠出生窒息的腦缺氧模型。該模型的優(yōu)點:首先缺氧是發(fā)病的主因,累及整個大腦,而不是局限于單側(cè)大腦,這與新生兒缺氧性腦損傷發(fā)生發(fā)展過程較為一致;其次,建模過程中避免了麻醉和手術(shù)創(chuàng)傷,且損傷條件一致,降低了動物的死亡率,重復(fù)性好。此外,儀器簡單,操作簡便,成功率高。選用的大鼠具有腦血管解剖和生理接近人類、品系純、抗病性強、繁殖周期短、一產(chǎn)多胎等優(yōu)點,被廣泛用于腦缺血及缺血再灌注模型的制作[24]。因此,本研究建立的缺氧模型可為新生兒圍產(chǎn)期窒息所致的缺血缺氧性腦病的防治提供一種實驗方法。

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Establishment and evaluation of a rat model of neonatal hypoxic brain injury

LI Yuyu1,2,XU Jianwen1*

(1DepartmentofAnatomyandHistologyandEmbryology,CollegeofBasicMedicalSciences,CenterofNeurobiology,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350108,China;2DepartmentofAnatomyandPhysiology,CollegeofMedicineandNursing,SanmingVocationalTechnicalCollege;*Correspondingauthor,E-mail:fjxjw@126.com)

ObjectiveTo establish a rat model mimicking the brain injury caused by neonatal hypoxia.MethodsNeonatal rats were transiently exposed to 100% nitrogen gas. Eighteen rats were randomly divided into normal control group,10 min hypoxia group and 20 min hypoxia group. The reliability of the model was evaluated by behavior analysis and pathological examination of the brain tissues by means of Nissl staining and transmission electron microscopy.ResultsTransient hypoxia in neonatal rats resulted in systemic cyanosis,abnormal mental behavior and conscious disturbance. Nissl staining showed that hypoxia for 10 min led to the swelling of the partial neurons in the hippocampal CA1 region and that hypoxia for 20 min caused the neuron injury more severe. Compared with normal control group, the number of Nissl staining positive cells was decreased in 10 min hypoxia group(P<0.05) and 20 min hypoxia group (P<0.01). Ultrastructure of the neurons revealed the margination of chromatin and the vacuolar degeneration of microvascular endothelial cells during 10 min of hypoxia. Also the neuron necrosis was observed in 20 min hypoxia group, featured by dissolved nuclei, indistinct organelles, and the swelling of both baseboard and processes of astrocytes.ConclusionA simple and reliable animal model of hypoxic brain injury is successfully established by transient exposure of neonatal rats to 100% nitrogen gas.

hypoxia; animal model; brain injury; Nissl staining; transmission electron microscope; rats

福建省自然科學(xué)基金資助項目(2015J01133)

李玉宇,女,1968-05生,碩士,副教授,E-mail:Liyuyu_fj@163.com

2017-03-07

R-332

A

1007-6611(2017)08-0795-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.009