蘇曉云,賀繼平,鄭 華

(1山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院護(hù)理學(xué)系護(hù)理人文教研室,汾陽 032200;2山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖教研室;3重慶師范大學(xué)體育學(xué)院)

雌激素對去卵巢大鼠焦慮行為及杏仁核c-fos表達(dá)的影響

蘇曉云1,賀繼平2,鄭 華3

(1山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院護(hù)理學(xué)系護(hù)理人文教研室,汾陽 032200;2山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖教研室;3重慶師范大學(xué)體育學(xué)院)

目的 觀察雌二醇對去卵巢大鼠焦慮樣行為及杏仁核c-fos表達(dá)的影響,探討雌二醇改善去卵巢大鼠焦慮樣行為的可能機(jī)制。 方法 30只SD雌性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、卵巢切除組和去卵巢雌二醇組。雌二醇治療8周后通過高架迷宮實(shí)驗(yàn)觀察雌二醇對去卵巢大鼠焦慮樣行為的影響;隨后采用免疫組織化學(xué)結(jié)合圖像半定量方法對杏仁核c-fos的表達(dá)進(jìn)行測量和分析。 結(jié)果 與假手術(shù)組大鼠比較,高架迷宮實(shí)驗(yàn)中卵巢切除組大鼠開放臂次數(shù)及時間、開放臂次數(shù)比例及時間比例均顯著下降(P<0.01),杏仁核c-fos數(shù)量及面積均顯著增加(P<0.05);而去卵巢雌二醇組去卵巢大鼠的焦慮行為可顯著改善,杏仁核c-fos表達(dá)減弱(P<0.05)。 結(jié)論 卵巢摘除會導(dǎo)致大鼠焦慮樣行為,長期雌二醇治療可改善去卵巢大鼠的焦慮行為,可能與雌二醇降低去卵巢大鼠杏仁核c-fos的表達(dá)有關(guān)。

雌二醇; 杏仁核; c-fos; 焦慮樣行為； 去卵巢； 大鼠

焦慮癥是最常見的精神疾病,美國每年將近18%人口患此病。一般來說,女性比男性更容易患焦慮癥,特別是絕經(jīng)后,因此可以認(rèn)為性腺激素在焦慮性行為的病因及流行方面發(fā)揮重要作用[1,2]。Tangen等[3]研究認(rèn)為,與絕經(jīng)前比較,圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后的婦女易患焦慮和抑郁癥狀,支持促性腺激素與女性情緒障礙的關(guān)系。此外,Rasgon等[4]認(rèn)為雌激素替代治療可選擇性增強(qiáng)抑制女性患抑郁癥的血清素再吸收,而通過開場實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)證實(shí),給予去卵巢大鼠雌激素治療后焦慮行為顯著改善[5]。這些結(jié)果表明雌激素參與情緒和情感的調(diào)控,然而雌激素調(diào)節(jié)焦慮行為的機(jī)制仍不清楚。

杏仁核是一個復(fù)雜的大腦核團(tuán),在調(diào)節(jié)焦慮樣行為、恐懼條件反射及情感記憶中扮演重要角色[6],研究認(rèn)為杏仁核包含大量的雄激素和雌激素受體,并且杏仁核雌激素受體在雌激素調(diào)節(jié)焦慮樣行為中發(fā)揮重要作用[7]。c-fos蛋白被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元形態(tài)和神經(jīng)激活的標(biāo)記,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)卵巢切除可導(dǎo)致紋狀體c-fos表達(dá)減少,但是有關(guān)卵巢切除對杏仁核c-fos的表達(dá)的影響相關(guān)報道較少。因此,本實(shí)驗(yàn)利用雌性去卵巢大鼠模擬絕經(jīng)后女性,以杏仁核c-fos為研究重點(diǎn),觀察去卵巢大鼠雌激素治療8周大鼠焦慮樣行為及杏仁核c-fos表達(dá)的變化,旨在探討雌二醇改善去卵巢大鼠抑郁行為的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

3月齡SD雌性大鼠30只,體質(zhì)量220-250 g,均購于山西醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)中心(動物許可證號SCXK-2009-0001)。所有大鼠被飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中,每籠3只,所有大鼠可自由攝食、飲水。適應(yīng)環(huán)境1周后,將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham group)、卵巢切除組(OVX)和去卵巢雌二醇組(OVX+E2)。OVX+E2組大鼠每天上午9:00-10:00腹腔注射苯甲酸雌二醇0.1 ml(1 mg/ml),連續(xù)8周。

1.2 卵巢切除手術(shù)操作

[8]方法操作,大鼠經(jīng)腹腔注射烏來糖(50 mg/kg)麻醉,常規(guī)消毒后進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù),在恥骨聯(lián)合上緣約2 cm處切開皮膚,進(jìn)入腹腔,沿輸卵管找到雙側(cè)卵巢后切除卵巢(假手術(shù)組大鼠只切除腹腔內(nèi)一小塊脂肪組織),然后縫合切口,所有大鼠術(shù)后肌注青霉素3 d。

1.3 高架迷宮實(shí)驗(yàn)

卵巢切除8周對所有大鼠進(jìn)行高架迷宮實(shí)驗(yàn)。高架迷宮(兩條相對開放臂及閉合臂組成),距離地面50 cm。根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]描述的方法將大鼠放在迷宮中心區(qū)探索5 min,焦慮行為指標(biāo)包括:①開放臂次數(shù)(open arm entry,OE)及時間(open arm time,OT);②開放臂次數(shù)比例(OE%):開放臂次數(shù)/(開放臂次數(shù)+閉合臂次數(shù))×100%;③開放臂時間比例(OT%):開放臂時間/(開放臂時間+閉合臂時間)×100%。OE%及OT%比值越小,表明大鼠的焦慮程度越嚴(yán)重。

1.4 下丘腦室旁核c-fos取材、切片與染色

高架迷宮實(shí)驗(yàn)測試結(jié)束后即刻,大鼠被麻醉后經(jīng)常規(guī)灌注固定,然后行腦冠狀位連續(xù)冰凍切片,片厚30 μm。隨后經(jīng)過氧化氫/甲醇溶液(3%)室溫孵育30 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS沖洗后加入5%山羊血清工作液孵育1 h,加入c-fos血清兔抗大鼠第一抗體(1 ∶2 000),4 ℃孵育24 h加入生物素羊抗兔IgG第二抗體,接著DAB室溫顯色15 min,清洗、貼片,常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明,樹膠封片(以上所有試劑均由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn))。

1.5 圖像分析

參照大鼠腦立體定位圖譜每組取10張切片,在鏡下輸入圖像分析系統(tǒng),每張切片隨機(jī)觀察5個視野測量杏仁核c-fos(400倍)陽性細(xì)胞數(shù)及面積,求其平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雌二醇對去卵巢大鼠高架迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

在高架迷宮實(shí)驗(yàn)中,與SHAM組比較,OVX大鼠OE、OT、OE%及OT%均顯著下降(均P<0.01,見表1),OE%及OT%下降幅度分別為33.22%及43.43%;而OVX+E2組大鼠與sham組比較,上述指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05);給予雌激素替代治療8周,與OVX組大鼠比較,OVX+E2組大鼠OE、OT、OE%及OT%均顯著增加(P<0.01或P<0.05,見表1),增加幅度分別為86.97%,68.96%,37.89%及56.73%。結(jié)果提示,長期慢性雌二醇治療可顯著改善去卵巢大鼠的焦慮行為。

組別 OE(次) OT(s) OE%(%) OT%(%)sham組4.51±1.5648.56±13.2635.45±11.9716.67±4.57OVX組2.38±0.98ΔΔ26.45±8.46ΔΔ23.67±6.65ΔΔ 9.43±1.68ΔΔOVX+E2組4.45±2.01**44.69±10.89**32.64±9.46*14.78±4.35**

與sham組比較,ΔΔP<0.01;與OVX比較,*P<0.05，**P<0.01

2.2 雌二醇對去卵巢大鼠c-fos表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較,卵巢切除組大鼠杏仁核c-fos陽性細(xì)胞數(shù)量及面積均顯著增高(均P<0.05，見表2),增加幅度分別為30.57%及20.05%;去卵巢雌二醇組大鼠與假手術(shù)組大鼠比較,杏仁核c-fos表達(dá)無顯著變化(P>0.05);與卵巢切除組大鼠比較,去卵巢雌二醇組大鼠杏仁核c-fos陽性細(xì)胞數(shù)量及面積均顯著下降(P<0.01),降低幅度分別為18.64%

組別n 面積(μm2)陽性細(xì)胞數(shù)(個)sham組10348.68±48.45 8.34±1.06OVX組10418.59±70.22Δ10.89±1.87ΔOVX+E2組10362.96±41.38* 8.86±0.97*

與sham組比較,ΔP<0.05;與OVX組比較,*P<0.05

及13.29%。免疫組化結(jié)果顯示,OVX大鼠杏仁核c-fos免疫陽性神經(jīng)元表達(dá)增強(qiáng);雌二醇注射8周大鼠杏仁核c-fos免疫陽性神經(jīng)元表達(dá)減弱(見圖1)。

圖1 不同處理組大鼠杏仁核c-fos表達(dá)Figure 1 The c-fos positive expression in amygdala in different groups by immunohistochemistry

3 討論

女性圍絕經(jīng)期時由于循環(huán)激素水平改變可能導(dǎo)致認(rèn)知缺陷和/或情緒障礙。Walf等[10]通過開場試驗(yàn)及高架迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)卵巢摘除可以降低大鼠對新異環(huán)境的探究能力、增強(qiáng)大鼠對高懸敞開臂的恐懼,表現(xiàn)出焦慮及抑郁行為。然而Imwalle等[11]通過高架迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí),雌激素剝奪大鼠不會產(chǎn)生焦慮樣行為。有學(xué)者認(rèn)為雌激素剝奪時間與焦慮行為呈顯著的正相關(guān),大鼠雌激素剝奪15 d,30%的動物出現(xiàn)焦慮狀態(tài),而雌激素剝奪21-28 d,60%-90%的動物出現(xiàn)焦慮狀態(tài),這些結(jié)果表明,雌激素剝奪至少3周以上才可以引起大鼠焦慮狀態(tài)[12]。此外,有研究表明雌激素剝奪時間與焦慮癥狀呈顯著的負(fù)相關(guān),雌激素剝奪時間越長焦慮癥狀越明顯[13]。因此,本研究采用大鼠卵巢摘除模擬女性圍絕經(jīng)期時雌激素水平下降狀態(tài),通過高架迷宮實(shí)驗(yàn)觀察雌激素剝奪8周大鼠焦慮樣行為的變化,結(jié)果顯示OVX大鼠在高架迷宮實(shí)驗(yàn)中開放臂次數(shù)及時間、開放臂次數(shù)及時間百分比均顯著減少,說明OVX大鼠表現(xiàn)出了對新環(huán)境的探究能力下降和對高懸開放臂的恐懼程度增加,出現(xiàn)了嚴(yán)重的焦慮情緒。大多數(shù)研究表明雌二醇主要由卵巢分泌,可減少更年期動物模型的焦慮行為和產(chǎn)生抗抑郁癥狀。臨床研究發(fā)現(xiàn)在絕經(jīng)后婦女,雌激素替代療法已被證明可以改善心理癥狀與焦慮狀態(tài)[14]。而通過高架T迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí),接受慢性雌二醇治療的OVX大鼠表現(xiàn)出抗焦慮作用[15]。本研究也證實(shí)了上述觀點(diǎn),OVX大鼠經(jīng)過8周雌二醇治療焦慮癥狀明顯改善,具體表現(xiàn)為高架迷宮實(shí)驗(yàn)中OVX+E2大鼠開放臂次數(shù)及時間、開放臂次數(shù)及時間百分比均顯著增加,提示長期雌激素治療可以在一定程度上改善OVX大鼠的焦慮狀態(tài),與其他學(xué)者研究結(jié)果一致。

c-fos是原癌基因家族中成員之一,在體內(nèi)相當(dāng)于第三信使的作用,可直接參與細(xì)胞的分裂、生長、分化及學(xué)習(xí)記憶等生理過程,并且在調(diào)節(jié)焦慮樣行為中發(fā)揮重要作用[16]。研究發(fā)現(xiàn),性腺激素雌二醇可以調(diào)節(jié)c-fos的表達(dá),然而研究結(jié)果差異較大。有些學(xué)者認(rèn)為去卵巢可導(dǎo)致下丘腦室旁核、視交叉上核及弓狀核c-fos表達(dá)減少,而注射高劑量雌二醇可以使c-fos表達(dá)恢復(fù)到正常水平[17,18]。而有些研究認(rèn)為卵巢切除可增加包括皮質(zhì)、杏仁核、丘腦等大腦區(qū)域的c-fos表達(dá),而每天重復(fù)注射苯甲酸雌二醇(10 μg)可降低c-fos的表達(dá)[19]。本研究與后者結(jié)果相同,與假手術(shù)組比較,去卵巢大鼠杏仁核c-fos表達(dá)顯著增加。研究認(rèn)為,c-fos蛋白在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面起著決定性的作用[20],且細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生會損壞腦細(xì)胞,最近的研究顯示有些凋亡基因表達(dá)與焦慮的發(fā)展有很大的相關(guān)性[21]。因此,有理由推測本實(shí)驗(yàn)中雌激素剝奪大鼠的焦慮樣行為與杏仁核c-fos的過度表達(dá)導(dǎo)致的杏仁核神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。而雌二醇替代治療改善雌激素剝奪大鼠焦慮行為可能與雌二醇下調(diào)c-fos表達(dá)減少杏仁核神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān),具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

去卵巢可導(dǎo)致大鼠焦慮樣行為及杏仁核c-fos表達(dá)增加,而去卵巢大鼠長期注射雌二醇可減弱大鼠焦慮行為,杏仁核c-fos表達(dá)減弱,因此推測雌二醇減弱去卵巢大鼠焦慮行為可能與雌二醇下調(diào)c-fos表達(dá)降低杏仁核神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Schmidt PJ. Depression, the perimenopause, and estrogen therapy[J]. Ann NY Acad Sci, 2005, 1052:27-40.

[2] Walf AA, Frye CA. A review and update of mechanisms of estrogen in the hippocampus and amygdala for anxiety and depression behavior[J]. Neuropsychopharmacology, 2006, 31(6):1097-1111.

[3] Tangen T, Mykletun A. Depression and anxiety through the climacteric period: an epidemiological study (HUNT-II)[J]. J Psychosom Obstet Gynaecol, 2008, 29(2):125-131.

[4] Rasgon NL, Altshuler LL, Fairbanks LA,etal. Estrogen replacement therapy in the treatment of major depressive disorder in perimenopausal women[J]. J Clin Psychiatry,2002,63(Suppl 7):45-48.

[5] Bowman RE, Ferguson D, Luine VN. Effects of chronic restraint stress and estradiol on open field activity, spatial memory, and monoaminergic neurotransmitters in ovariectomized rats[J]. Neuroscience, 2002, 113(2):401-410.

[6] Anglada-Figueroa D, Quirk GJ. Lesions of the basal amygdala block expression of conditioned fear but not extinction[J]. J Neurosci, 2005, 25(42):9680-9685.

[7] Weiser MJ, Foradori CD, Handa RJ. Estrogen receptor beta activation prevents glucocorticoid receptor-dependent effects of the central nucleus of the amygdala on behavior and neuroendocrine function[J]. Brain Res, 2010, 1336:78-88.

[8] Heydarpour P, Salehi-Sadaghiani M, Javadi-Paydar M,etal. Estradiol reduces depressive-like behavior through inhibiting nitric oxide/cyclic GMP pathway in ovariectomized mice[J]. Horm Behav, 2013, 63(2):361-369.

[9] Li H, Chen L, Li P,etal. Insular muscarinic signaling regulates anxiety-like behaviors in rats on the elevated plus-maze[J]. Behav Brain Res, 2014, 270:256-260.

[10] Walf AA, Frye CA. Administration of estrogen receptor beta-specific selective estrogen receptor modulators to the hippocampus decrease anxiety and depressive behavior of ovariectomized rats[J]. Pharmacol Biochem Behav, 2007, 86(2):407-414.

[11] Imwalle DB, Gustafsson JA, Rissman EF. Lack of functional estrogen receptor beta influences anxiety behavior and serotonin content in female mice[J]. Physiol Behav, 2005, 84(1):157-163.

[12] Daendee S, Thongsong B, Kalandakanond-Thongsong S. Effects of time of estrogen deprivation on anxiety-like behavior and GABAA receptor plasticity in ovariectomized rats[J]. Behav Brain Res, 2013, 246:86-93.

[13] Walf AA, Frye CA. Parity and estrogen-administration alter affective behavior of ovariectomized rats[J].Physiol Behav, 2008, 93(1-2):351-356.

[14] Zeidan MA, Igoe SA, Linnman C,etal. Estradiol modulates medial prefrontal cortex and amygdala activity during fear extinction in women and female rats[J]. Biol Psychiatry, 2011, 70(10):920-927.

[15] Pandaranandaka J, Poonyachoti S, Kalandakanond-Thongsong S. Differential effects of exogenous and endogenous estrogen on anxiety as measured by elevated T-maze in relation to the serotonergic system[J]. Behav Brain Res, 2009, 198(1):142-148.

[16] Smith IM, Pang KC, Servatius RJ,etal. Paired-housing selectively facilitates within-session extinction of avoidance behavior, and increases c-Fos expression in the medial prefrontal cortex, in anxiety vulnerable Wistar-Kyoto rats[J]. Physiol Behav, 2016, 164(Pt A):198-206.

[17] Peterfi Z, Churchill L, Hajdu I,etal. Fos-immunoreactivity in the hypothalamus: dependency on the diurnal rhythm, sleep, gender, and estrogen[J]. Neuroscience, 2004, 124 (3):695-707.

[18] 申國明,許浩,胡光明,等.電針對雌性去勢大鼠行為學(xué)和下丘腦室旁核c-fos表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(9):2062-2064.

[19] Rachman IM, Unnerstall JR, Pfaff DW,etal. Estrogen alters behavior and forebrain c-fos expression in ovariectomized rats subjected to the forced swim test[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(23):13941-13946.

[20] Ozeki A, Tsukamoto I. Retinoic acid repressed the expression of c-fos and c-jun and induced apoptosis in regenerating rat liver after partial hepatectomy[J]. Biochim Biophys Acta, 1999, 1450(3):308-319.

[21] Yan ZY, Zhang TE, Pan LZ,etal. Action of valeriana jatamansi jones on the apoptosis-related genes expression in the anxiety model of rat[J]. Procedia Environmental Sciences,2011,8:744-750.

Effects of estradiol on anxiety-like behavior and amygdala c-fos expression in ovariectomized rats

SU Xiaoyun1,HE Jiping2,ZHENG Hua3

(1DepartmentofNursingHumanities,FenyangCollegeofShanxiMedicalUniversity,Fenyang032200,China;2DepartmentofAnatomy,FenyangCollegeofShanxiMedicalUniversity;3DepartmentofPhysicalEducation,ChongqingNormalUniversity)

ObjectiveTo explore the influence of estradiol on anxiety-like behavior and amygdala c-fos expression and the possible mechanism of estradiol improving anxiety-like behavior of the ovariectomized(OVX) rats.MethodsThirty adult SD female rats were randomly assigned into 3 groups: sham group, OVX group and OVX+E2 group(ovariectomized rats treated with estradiol). The elevated plus maze was used to assess the anxiety-like behavior after 8-week estradiol treatment. Immunohistochemical staining was used to detect the c-fos expression in amygdala.ResultsCompared with sham group, open arm entry(OE), open arm time(OT), the percentage of OE and the percentage of OT significantly decreased in OVX group(P<0.01), while the number and area of amygdala c-fos expression significantly increased(P<0.05). Compared with OVX group, anxiety-like behavior was improved and amygdala c-fos expression decreased after 8-week estradiol treatment in OVX+E2group(P<0.05).ConclusionThe ovariectomy may induce the anxiety-like behavior, and estradiol may ameliorate the anxiety-like behavior in OVX rats by decreasing the amygdala c-fos expression.

estradiol; amygdala; c-fos; anxiety-like behavior； ovariectomized; rats

蘇曉云,女,1982-04生,碩士,講師

2017-03-31

R749.2

A

1007-6611(2017)08-0791-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.008