張 巖,李永勤,王聰霞,張春艷,胡艷超,寇惠娟,馬維冬,劉曉喚

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:wsxlyq@163.com)

siRNA沉默AT2受體通過Ang(1-9)-ACE2-AT2通路抑制心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成

張 巖,李永勤*,王聰霞,張春艷,胡艷超,寇惠娟,馬維冬,劉曉喚

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:wsxlyq@163.com)

目的 研究重組人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(rhACE2)作用于心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞后對NO產(chǎn)生的影響,采用siRNA沉默AT2受體研究Ang(1-9)-ACE2-AT2通路在這一過程中的作用。 方法 體外培養(yǎng)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMVEC),分為對照組、AngⅡ組、AngⅡ+rhACE2組、AT2受體抑制劑組和陰性對照siRNA組。Griess試劑法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的含量,RT-PCR檢測HUVEC中eNOS mRNA的表達(dá),檢測細(xì)胞內(nèi)NO的生成及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性。Western blot檢測磷酸化eNOS的表達(dá)。觀察rhACE2對AngⅡ作用后CMVEC生成NO、eNOS mRNA、eNOS蛋白表達(dá)的影響,同時(shí)觀察加用AT2受體抑制劑PD123319干預(yù)后,rhACE2對磷酸化eNOS蛋白表達(dá)的影響。觀察siRNA干擾CMVEC中AT2受體蛋白后對eNOS活性、NO的影響。 結(jié)果 AngⅡ組NO的含量[(3.495±0.362)nmol/L]明顯低于對照組[(11.513±0.392)nmol/L，P<0.05];AngⅡ+rhACE2組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量和磷酸化eNOS表達(dá)水平均明顯高于AngⅡ組(P<0.05),而eNOS mRNA和非磷酸化eNOS蛋白表達(dá)水平與AngⅡ組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。經(jīng)AT2通路抑制劑PD123319干預(yù)后的AT2受體抑制劑組磷酸化eNOS表達(dá)水平明顯低于AngⅡ+rhACE2 30 min組(P<0.05)。Western blot 檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染AT2 siRNA組轉(zhuǎn)染48 h AT2受體蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與AT2受體抑制劑組和陰性對照siRNA組相比,轉(zhuǎn)染AT2 siRNA組的eNOS活性和NO含量均顯著降低。 結(jié)論 rhACE2作用于人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞后,eNOS活性增強(qiáng),NO生成增加,Ang(1-9)-ACE2-AT2信號通路參與這一過程。

siRNA; AT2受體; 重組人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2; Ang (1-9)-ACE2-AT2通路; 微血管內(nèi)皮細(xì)胞

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system,RAS)是維持血壓、水和電解質(zhì)平衡及心血管穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控系統(tǒng)。近年來,許多研究發(fā)現(xiàn)RAS系統(tǒng)中還存在新成員,即血管緊張素1-9(angiotensin 1-9, Ang 1-9),合成Ang(1-9)的酶(ACE2)。曾有研究進(jìn)行放射性配體結(jié)合試驗(yàn),結(jié)果表明,AT2為Ang(1-9)的特異性受體,同樣具有類似于Ang(1-7)的生物學(xué)效應(yīng),由此Ang(1-9)-ACE2-AT2通路也成為了另一條RAS新的代謝通路,同發(fā)揮拮抗AngⅡ-ACE-AT1通路的心血管毒性作用[1]。其中ACE2為這條新的代謝通路的核心成分,發(fā)揮著重要的生物學(xué)效應(yīng)。

ACE2是在2000年由Donoghue和Tipnis分別從人心力衰竭(HF)cDNA文庫和人淋巴瘤文庫中克隆出來,廣泛分布于心血管組織(心肌細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞)和非心血管組織(回腸、十二指腸、空腸、盲腸和結(jié)腸)中。已證實(shí)ACE2對AngⅡ的親和力是所有已知肽類中最高的,可以通過水解AngⅠ生成Ang(1-9)[2-4]。ACE2也可以水解其他心血管系統(tǒng)中具有血管活性作用的肽類,例如,apelin-13、神經(jīng)緊張肽、緩激肽等,這些作用也參與血壓的控制、心臟功能和血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)。由此可見ACE2是RAS中的核心成分。

我們前期的研究表明,rhACE2可減低AngⅡ抑制人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMVEC)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性的作用[5],但其作用機(jī)制尚不明確。本研究主要從受體活性以及基因表達(dá)水平觀察Ang(1-9)-ACE2-AT2通路在rhACE2增強(qiáng)eNOS活性及NO生成中的作用,以探討rhACE2調(diào)節(jié)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMVEC)由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管病理生理研究室提供。用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)培養(yǎng)。

1.2 人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

CMVEC在5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%的胰蛋白酶消化、傳代。對照組:5%CO2,37 ℃條件下培養(yǎng)的正常CMVEC;AngⅡ干預(yù)組:在對照組的基礎(chǔ)上加AngⅡ(1×10-6mol/L)孵育24 h;AngⅡ干預(yù)基礎(chǔ)上加rhACE2,分別作用5,10,15,30,60 min(各亞組);AT2受體抑制劑組:在AngⅡ干預(yù)的基礎(chǔ)上,加入AT2受體抑制劑(10 μmol/L)作用30 min后,再加入rhACE2(100 μmol/L)作用15 min,收集各組細(xì)胞及細(xì)胞上清液;轉(zhuǎn)染AT2 siRNA組:用siRNA轉(zhuǎn)染CMVEC(即siAT2R001、siAT2R002和siAT2R003)后給予AngⅡ干預(yù),再加入rhACE2(100 μmol/L)作用30 min;陰性對照siRNA(negative control, NCsiRNA)組:轉(zhuǎn)染NCsiRNA后再按照上述方式處理。

1.3 siRNA構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

遵循siRNA的設(shè)計(jì)原則、GenBank中人AT2的cDNA序列(NM-012494.3),以其同源的編碼 DNA序列(coding DNA sequences, CDS)部分設(shè)計(jì)并合成3條AT2 siRNA,分別命名:siAT2R001、siAT2R002和siAT2R003,上述序列經(jīng)BLAST軟件分析,與人類基因外顯子無同源性,同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對照雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA),檢驗(yàn)有無非特異性影響。siRNA序列為:siAT2001 正義鏈5′-UGGAUUUGUACCAUUCUUCUGdTdT-3′,反義鏈3′-dTdT GAAGAAUGGUACAAAUCCAAG-5′;siAT2002正義鏈 5′-ACUCAUUGGUUCCUUUAAGGG dTdT-3′,反義鏈3′-dTdT CUUAAAGGAACCAAUGAGUCC-5′;siAT2003正義鏈5′-UUUUGAGUGGGUAUCAACCAG-dTdT-3′,反義鏈3′-dTdT GGUUGAUACCCACUCAAAAAG-5′。細(xì)胞生長融合至80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,按照LipofectamineTM2000(Invitrogen)的操作說明書完成轉(zhuǎn)染,置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),4-6 h換無血清ECM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 熒光標(biāo)記siRNA檢測轉(zhuǎn)染效率

化學(xué)熒光Cy3標(biāo)記的NCsiRNA對CMVEC進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染條件和目的基因相同,轉(zhuǎn)染48 h用激光共聚焦顯微鏡觀察,可以看見紅色熒光,以此來衡量轉(zhuǎn)染是否成功及轉(zhuǎn)染效率的高低。

1.5 Western blot檢測CMVEC中AT2蛋白表達(dá)及干擾效率

各轉(zhuǎn)染組分別轉(zhuǎn)染48 h,棄去培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS沖洗3次,在冰上按1 ∶100的比例加入含有Cocktail細(xì)胞裂解液100 μl,用細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞,將黏稠狀細(xì)胞裂解產(chǎn)物收集于離心管中。冰中靜置60 min,12 000 r/min,4 ℃,離心15 min。取5 μl上清液,按照蛋白濃度測定試劑盒的操作說明書完成蛋白含量測定,其余樣品加入加樣緩沖液,沸水煮10 min,SDS-PAGE電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜上,然后用含5%脫脂奶粉TBST緩沖液封閉1 h,加入AT2的一抗(1 ∶500)孵育過夜;第2天用TBST洗膜3次,各15 min,加入二抗(1 ∶5 000)搖床上孵育1 h,用TBS 洗膜3次,各15 min,用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色,顯影、定影。用Smart viewer 軟件進(jìn)行灰度分析,β-actin 蛋白條帶作為內(nèi)參對照,以上各組n=5。

1.6 eNOS及NO的測定

應(yīng)用Griess試劑法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中亞硝酸鹽的含量,以間接反映NO的含量。實(shí)時(shí)定量PCR檢測eNOS mRNA的表達(dá):上游引物5′CGGCATCACCAGGAAGAAGA 3′,下游5′-CATGAGCGGCGGAGAT-3′,探針:FAM-TTTAAAGAAGTGGCCAACGCCGTGAA-BH。β-actin上游引物5′-AGCGGTTCCGATGCCCT-3′,下游5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACG-3′,探針:FAM-CCTTCCTTCTTGGGTATGGAATCCTGTG-BHQ1。Western blot檢測eNOS和磷酸化eNOS的表達(dá)。eNOS和磷酸化eNOS蛋白的表達(dá)量用各組A值與相應(yīng)β-actinA值的比值半定量表示。eNOS的相對活力計(jì)算公式如下:eNOS相對活性=(RFU已刺激-RFU抑制劑+已刺激)/(RFU未刺激-RFU抑制劑+未刺激)。將CMVEC接種于放有圓形玻片的小培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞生長至80%左右轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染48 h將玻片取出放入自制的灌流槽中,按1 ∶2 000比例加入DAF-FM diacetate(DAF-FM DA)熒光探針稀釋液稀釋后的DAF-FM DA,37 ℃孵育細(xì)胞20 min,用HBS溶液沖洗3次,將灌流槽放于熒光顯微鏡上,用495 nm激發(fā)波長,515 nm發(fā)射波長,實(shí)時(shí)檢測使用2 mmol/L Spermine刺激前后的熒光變化,并通過IPA Software 進(jìn)行分析。NO相對熒光強(qiáng)度計(jì)算公式如下:NO含量=(測定孔曲線最高RFU-最低 RFU)-(空白孔曲線最高RFU-最低RFU),以上各組n=5。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 rhACE2對CMVEC生成NO和eNOS mRNA表達(dá)的影響

AngⅡ組NO的含量明顯低于正常對照組[(3.495±0.362)nmol/Lvs(11.513±0.392)nmol/L,P<0.05]。而AngⅡ+rhACE2組各亞組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量均高于AngⅡ組(P<0.05)。AngⅡ+rhACE2組處理5, 10, 15, 30, 60 min,NO的含量分別為(5.823±0.310)nmol/L,(7.182±0.633)nmol/L,(9.532±0.609)nmol/L,(10.398±0.508)nmol/L,(8.502±0.776)nmol/L,其中以30 min含量最高(見圖1A)。同樣設(shè)定正常對照組eNOS mRNA相對表達(dá)量為1,各組eNOS mRNA相對表達(dá)量為與它的比值來表示。AngⅡ組eNOS mRNA相對表達(dá)量低于正常對照組(0.578±0.031，P<0.05)。AngⅡ+rhACE2組孵育5, 10, 15, 30, 60 mineNOS mRNA相對表達(dá)量分別為0.532±0.040,0.602±0.040,0.613±0.069,0.593±0.050,0.585±0.055,與AngⅡ組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05, 見圖1B)。

2.2 Western blot檢測rhACE2對eNOS蛋白表達(dá)的影響

設(shè)定正常對照組的非磷酸化eNOS蛋白相對表達(dá)量為1,各組非磷酸化eNOS蛋白表達(dá)量為與它的比值來表示。AngⅡ組磷酸化eNOS蛋白相對表達(dá)量(0.483±0.031)明顯低于正常對照組(P<0.05)。而AngⅡ+rhACE2組各亞組細(xì)胞磷酸化eNOS蛋白相對表達(dá)量分別為0.822±0.023, 0.873±0.017, 0.903±0.031, 0.930±0.033, 0.842±0.027,與AngⅡ組相比,均明顯升高(P<0.05)。其中AngⅡ+rhACE2 30 min組的相對表達(dá)量最高(見圖2A)。

2.3 AT2受體抑制劑PD123319干預(yù)后,rhACE2對磷酸化eNOS蛋白表達(dá)的影響

AngⅡ組磷酸化eNOS蛋白相對表達(dá)量明顯低于正常對照組(P<0.05)。而AngⅡ+rhACE2組孵育后30 min,磷酸化eNOS蛋白相對表達(dá)量明顯高于AngⅡ組(0.918±0.049vs0.462±0.033,P<0.05)。AT2受體抑制劑PD123319組磷酸化eNOS蛋白相對表達(dá)量(0.579±0.058)下降,明顯低于AngⅡ+rhACE2組(P<0.05,見圖2B)。

與對照組相比,▲P<0.05;與Ang Ⅱ組相比,*P<0.05圖1 rhACE2對CMVEC生成NO及eNOS mRNA表達(dá)的影響(n=5)Figure 1 The effect of rhACE2 on NO content and eNOS mRNA expression in CMVEC cultured supernatant (n=5)

與對照組相比,▲P<0.05; 與Ang Ⅱ干預(yù)組相比,*P<0.05; 與rhACE2+30 min組相比,#P<0.05圖2 AT2受體抑制劑PD123319干預(yù)后,rhACE2對磷酸化eNOS蛋白表達(dá)的影響 (n=5)Figure 2 The effect of rhACE2 on the relative expression of phosphorylated eNOS protein after intervention with PD123319 (n=5)

2.4 siRNA干擾對CMVEC中AT2受體蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的NcsiRNA 48 h,激光共聚焦顯微鏡下可見成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞發(fā)出Cy3紅色熒光,由于化學(xué)熒光Cy3標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染條件和目的基因相同,因此可以間接反映目的基因的轉(zhuǎn)染效率。

實(shí)驗(yàn)各組轉(zhuǎn)染48 h提取總蛋白,Western blot檢測轉(zhuǎn)染AT2 siRNA組各亞組(siAT2001組、siAT2002 組、siAT2003組)、NC-siRNA組及對照組AT2蛋白的表達(dá),AT2蛋白的相對表達(dá)用各組AT2灰度值/β-actin灰度值,再均除以對照組蛋白的表達(dá)表示,轉(zhuǎn)染各組蛋白的相對表達(dá)依次為0.78±0.05,0.27±0.01,0.96±0.01,0.97±0.01。與對照組相比,siAT2001 組、siAT2002組AT2蛋白表達(dá)降低,尤其是siAT2002 組明顯低于對照組(n=5,P<0.05),而siAT2003組及NC-siRNA組AT2蛋白表達(dá)與對照組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=5,P>0.05,見圖3A)。

SiAT2001組、siAT2002組、siAT2003組及NCsiRNA組AT2基因干擾效率分別為(19.56±5.79)%、(76.02±0.78)%、(4.48±0.68)%、(3.76±0.69)%。與對照組干擾效率(0%)相比,siAT2001組及si-AT2002組干擾效率顯著增加(n=5,P<0.05),而siAT2003組及NCsiRNA組干擾效率無顯著增加(n=5,P>0.05,見圖3B)。

與對照組相比,*P<0.05;與NC-siRNA,△P<0.05圖3 SiRNA干擾抑制了CMVEC中AT2受體蛋白的表達(dá)(n=5)Figure 3 The siRNA targeting the AT2 gene specifically decreases the expression of AT2 protein in CMVEC(n=5)

2.5 siRNA干擾AT2受體使CMVEC中eNOS活性降低、NO含量減少

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h,各組均加AngⅡ(1×10-6mol/L)孵育24 h,再加入rhACE2作用30 min,與對照及NCsiRNA組相比,轉(zhuǎn)染AT2 siRNA組中siAT2002組的eNOS活性降低(n=5,P<0.05),與對照組相比,NCsiRNA組中的eNOS活性無顯著差異(n=4,P>0.05,見圖4A)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h,與對照及NCsiRNA組相比,siAT2002組中的NO熒光強(qiáng)度值降低(n=4,P<0.05),與對照組相比,NCsiRNA組中的NO熒光強(qiáng)度值無顯著差異(n=4,P>0.05,見圖4B)。

與對照組相比,*P<0.05;與NC-siRNA相比,△P<0.05圖4 siRNA干擾AT2受體后eNOS活性及NO含量的變化Figure 4 The eNOS activity and NO generation in CMVEC after transfection with siRNA targeting the AT2 gene

3 討論

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種快速、高效、特異的基因阻斷技術(shù),它通過正、反義RNA片段形成雙鏈RNA,由雙鏈RNA特異性地引起同源靶基因mRNA降解,使其基因表達(dá)受到抑制[6，7]。在RNAi過程中,雙鏈 RNA被特異性核酸內(nèi)切酶切割加工成21-23 nt的siRNA,siRNA與核酶復(fù)合體結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物,其特異性地和互補(bǔ)靶基因堿基互補(bǔ)配對,剪切mRNA、降解RNA分子,產(chǎn)生高效、特異的干擾作用[8]。本實(shí)驗(yàn)選擇使用操作簡便、可控、轉(zhuǎn)染效率較高且對細(xì)胞毒副作用小的化學(xué)合成siRNA。

近年來有研究顯示,Ang(1-9)并非早期人們認(rèn)為的那樣無生理活性,且只是Ang(1-7)的前期形式,相反,它與Ang(1-7)一樣,同樣具有心血管保護(hù)效應(yīng)。Flores等[9]的研究報(bào)道讓人們對這一RAS新組分產(chǎn)生了新的認(rèn)識,也激起學(xué)者的濃厚興趣。這可以說是RAS與心血管疾病研究領(lǐng)域在近年來的重大進(jìn)展。

Flores等[9]通過放射性配體結(jié)合試驗(yàn),首次提出AngⅡ的2型受體AT2,是Ang(1-9)的特異性受體,Ang(1-9)與AT2的特異性結(jié)合同樣發(fā)揮拮抗AngⅡ經(jīng)由AT1所介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。如收縮血管,升高血壓,促進(jìn)心肌肥厚、心臟纖維化以及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生等。由于AngⅡ的1型受體-AT1,介導(dǎo)AngⅡ的絕大多數(shù)生物學(xué)效應(yīng),而AT2所介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)則一直不是很明確,因此,AT2的作用一直不被學(xué)者們所關(guān)注。Ocaranza等[10]研究發(fā)現(xiàn)Ang(1-9)具有調(diào)節(jié)心肌肥厚作用,并且對于體外心肌細(xì)胞培養(yǎng),Ang(1-9)具有抑制AngⅡ所致心肌細(xì)胞增殖效應(yīng);目前最新的研究[11]報(bào)道體外培養(yǎng)兔心肌細(xì)胞,觀察腺病毒表達(dá)Ang(1-9)及Ang(1-7)干預(yù)對AngⅡ刺激所致的心肌細(xì)胞肥大的作用,發(fā)現(xiàn)Ang(1-9)與Ang(1-7)可分別經(jīng)由各自的特異性受體AT2以及Mas,產(chǎn)生抑制心肌細(xì)胞肥大的作用,并且兩種途徑具有相同的效應(yīng)。Rehman等[12]最新研究結(jié)果顯示AT2的受體激動(dòng)劑C21能夠減低休克前自發(fā)性高血壓大鼠動(dòng)脈血管的損傷,心肌纖維化。上述研究報(bào)道,無疑在該領(lǐng)域提出了新的研究方向,使人們對AT2產(chǎn)生新的認(rèn)識,同時(shí)也對RAS這一新的代謝通路Ang(1-9)/ACE2/AT2通路在心血管疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制產(chǎn)生濃厚興趣。

本研究結(jié)果顯示,①AngⅡ干預(yù)組NO的含量明顯低于正常對照組,而rhACE2各亞組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量均高于AngⅡ干預(yù)組,其中以30 min含量最高。②eNOS mRNA表達(dá)水平檢測顯示AngⅡ干預(yù)組eNOS mRNA相對表達(dá)量低于正常對照組,rhACE2各亞組細(xì)胞eNOS mRNA相對表達(dá)量與AngⅡ干預(yù)組相比,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。③AngⅡ干預(yù)組磷酸化eNOS蛋白相對表達(dá)量明顯低于正常對照組,而rhACE2各亞組細(xì)胞磷酸化eNOS蛋白相對表達(dá)量與AngⅡ干預(yù)組相比,均明顯升高(P<0.05)。其中rhACE2 30 min的相對表達(dá)量最高。加用AT2受體抑制劑PD123319后,磷酸化eNOS蛋白相對表達(dá)量下降,明顯低于rhACE2干預(yù)組(P<0.05)。

在內(nèi)皮細(xì)胞中,eNOS是NO合成的限速酶,對調(diào)節(jié)NO合成起著重要作用。eNOS活性增加將引起內(nèi)皮細(xì)胞NO合成增多, Ang Ⅱ通過其AT1受體抑制內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性從而使NO合成減少。ACE2 基因轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中由Ang Ⅱ?qū)σ葝u素誘導(dǎo)eNOS磷酸化的抑制效應(yīng), 同時(shí)伴NO水平明顯上升, 但其機(jī)制尚不明確。研究結(jié)果提示,rhACE2作用后可提高NO的含量,不同時(shí)間點(diǎn)的磷酸化eNOS蛋白相對表達(dá)量升高。

本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)想在CMVEC中沉默AT2受體基因后是否會對NO生成及eNOS的活性產(chǎn)生影響?本研究首先采用脂質(zhì)體法將設(shè)計(jì)好的siRNA包裹轉(zhuǎn)染到CMVEC中,并使用Cy3標(biāo)記的 siRNA轉(zhuǎn)染48 h,在熒光顯微鏡下可以看見幾乎每個(gè)細(xì)胞都發(fā)出紅色熒光,說明轉(zhuǎn)染率很高。對轉(zhuǎn)染后的AT2受體蛋白表達(dá)定量分析結(jié)果表明沉默AT2受體基因可有效抑制AT2受體蛋白表達(dá)。進(jìn)一步的結(jié)果顯示,AT2受體基因沉默組eNOS活性與NO含量都降低,表明AT2在NO生成中起著關(guān)鍵作用。

綜上所述,rhACE2作用于AngⅡ干預(yù)的CMVEC,可明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞NO的釋放。在這個(gè)過程中,rhACE2通過增加eNOS蛋白第1179位絲氨酸的磷酸化而增加了eNOS的活性,并且這一過程可被AT2受體特異性的抑制劑PD123319所阻斷。AT2為Ang(1-9)的特異性受體,提示Ang(1-9)信號通路參與了這一過程,并具有重要意義。同時(shí)通過 RNAi 沉默 CMVEC中AT2受體的表達(dá),成功構(gòu)建了CaR基因 siRNA,進(jìn)一步證實(shí)了AT2在CMVEC的NO生成中的重要作用。AT2在各種不同組織細(xì)胞中介導(dǎo)的功能尚有待發(fā)現(xiàn)和證實(shí),對于AT2功能的進(jìn)一步研究不僅對深入了解血管生理和病理生理有重要意義,而且有助于以ACE2/Ang(1-9)/AT2所介導(dǎo)的血管保護(hù)作用為治療靶點(diǎn)。

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The siRNA silencing AT2 receptor inhibits production of NO in cardiac microvascular endothelial cells by Ang(1-9)-ACE2-AT2 pathway

ZHANG Yan,LI Yongqin*,WANG Congxia,ZHANG Chunyan,HU Yanchao,KOU Huijuan,MA Weidong,LIU Xiaohuan

(DepartmentofCardiology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;*Correspondingauthor,E-mail:wsxlyq@163.com)

ObjectiveTo explore the effect of recombinant human angiotensin converting enzyme 2(rhACE2) on NO formation in the cardiac microvascular endothelial cells(CMVEC), and the role of Ang(1-9)-ACE2-AT2 pathway in the process.MethodsHuman cardiac microvascular endothelial cells(CMVEC) were culturedinvitroand randomized into control group, AngⅡgroup,AngⅡ+rhACE2 group, AT2 receptor inhibitor group, AT2 siRNA transfection group and negative control siRNA group. Griess reagent measurement was applied to detect NO content in cell culture supernatant. RT-PCR was used to detect the expression of eNOS mRNA in HUVEC. Western blot was used to detect the expression of phospho-eNOS. NO fluorescent probe DAF-FM DA was loaded to detect the intracellular NO formation and the activity of endothelial NO synthase(eNOS).ResultsThe content of NO in AngⅡ group was significantly lower than that in control group [(3.495 ± 0.362)nmol/Lvs(11.513 ± 0.392)nmol/L,P<0.05]. NO contents and the phospho-eNOS expression levels of cultured cell liquid in AngⅡ+rhACE2 group were significantly higher than those in AngⅡ group(P<0.05), however, the protein expression levels of eNOS mRNA and non-phospho-eNOS showed no significant difference between two groups(P>0.05). The expression levels of phospho-eNOS were significantly lower in AT2 receptor inhibitor group than in AngⅡ+rhACE2 group after treatment for 30 min(P<0.05). Western blot results showed that the protein expression of AT2 receptor decreased in AT2 siRNA transfection group after transfection with siRNA for 48 h(P<0.05). Compared with AT2 receptor inhibitor group and negative control siRNA group, the eNOS activity and NO levels were significantly reduced in AT2 siRNA transfection group.ConclusionThe rhACE2 can increase eNOS activity and NO production in human cardiac microvascular endothelial cells, and Ang (1-9)-ACE2-AT2 signaling pathway is involved in the process.

siRNA; AT2 receptor; rhACE2; Ang (1-9)-ACE2-AT2 pathway; microvascular endothelial cells

張巖,女,1985-05生,碩士,主治醫(yī)師,E-mail:zy1985525@126.com

2017-01-20

R331.3

A

1007-6611(2017)08-0757-07

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.08.001