周 鵬林 瑋周祥斌陳曉陽

（1.廣東生態(tài)工程職業(yè)學院，廣東 廣州510520；2.華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院/廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州510642）

刨花潤楠SRAP-PCR體系建立與優(yōu)化*

周 鵬1,2林 瑋2周祥斌2陳曉陽2

（1.廣東生態(tài)工程職業(yè)學院，廣東 廣州510520；2.華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院/廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州510642）

以刨花潤楠（Machilus pauhoi）1.5 a生小苗幼嫩葉片為試材，對影響刨花潤楠SRAP-PCR擴增的模板DNA量、引物、dNTP和Mg2+體積摩爾濃度、Taq DNA聚合酶、退火溫度6個主要因素進行優(yōu)化。結(jié)果表明，SRAP-PCR的最佳反應體系為：25 μL的SRAP-PCR反應體系中，2.5 μL 10×PCR buffer、模板DNA量60 ng、Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.225 mmol/L、引物0.3 μmol/L和Taq DNA聚合酶1.25 U。對優(yōu)化的反應體系和擴增程序的驗證結(jié)果表明，優(yōu)化的刨花潤楠SRAP-PCR反應體系和擴增程序是穩(wěn)定可行的。

刨花潤楠；SRAP-PCR；體系優(yōu)化

刨花潤楠（Machilus pauhoi），又名刨花楠、粘柴（福州市）、刨花（廣東?。?，屬樟科（Lauraceae）潤楠屬植物，為常綠大喬木，產(chǎn)于長江以南各省，主要分布在海拔300～1 200 m的山坡及溝谷地帶。刨花潤楠全身是寶，是一種極具經(jīng)濟價值和開發(fā)前景的闊葉樹種，其樹干通直，生長迅速，出材量大，6 a生林木可進行采伐利用，且其砍伐后萌芽力強，更新快。從該樹種葉片中提取的精油是優(yōu)良的天然香料，具有獨特藥用價值，而樹皮富含樹脂和橡膠，種子含油率高達50%，可作為優(yōu)良的工業(yè)潤滑油，或供制皂及制蠟用[1-2]。此外，刨花潤楠樹形高大美觀，枝繁葉茂，四季常青，嫩葉呈粉紅色或紅棕色，也是優(yōu)良的園林綠化樹種[3]。目前，對刨花潤楠的研究主要集中在生物量結(jié)構(gòu)、生長規(guī)律、育苗技術(shù)和觀賞性等方面[4-7]，有關(guān)刨花潤楠種質(zhì)資源保存與開發(fā)利用、種質(zhì)分子鑒別等方面尚未見報道。

SRAP分子標記是由美國加州大學Li與Quiros博士提出的一種研究DNA多態(tài)性的有效新型分子標記技術(shù)[8]。該分子標記穩(wěn)定可靠，信息量大，多態(tài)性及共顯性高，引物具有通用性，且該技術(shù)操作簡單，成本低廉[9]。目前在作物和蔬菜的遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、比較基因組學和品種分子鑒定等研究領域已得到廣泛應用[10-15]。近年來，逐步應用于林木的指紋圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析及指紋檢索等研究中[16-20]。本試驗通過摸索適于刨花潤楠SRAP-PCR擴增的技術(shù)條件，以期為SRAP分子標記技術(shù)應用于樟科潤楠屬植物的鑒別及遺傳多樣性的研究提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試的刨花潤楠種子采于廣西壯族自治區(qū)，在華南農(nóng)業(yè)大學啟林北苗圃播種育苗。隨機選取10個家系（分別為廣西賀州4個家系，廣西興安4個家系，廣西昭平2個家系），每個家系選取1株生長良好的幼苗，苗齡為1.5 a生，取幼嫩葉片，在–80 ℃下保存?zhèn)溆茫糜谔崛】侱NA。電泳檢測時選用DL2000 DNA Marker（M）進行比對參照物，所選用SRAP引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取及檢測 李榮華等[21]認為，在提取DNA過程中加入預冷異丙醇和24 : 1的氯仿:異戊醇混合液，可有效去除葉片中所含的多酚、蛋白質(zhì)、脂類、多酯的角質(zhì)等不利于DNA提取的干擾物質(zhì)，同時適當加大β-巰基乙醇的用量，可進一步減少褐變。本實驗對OMEGA試劑盒（EasyPure Plant Genomic DNA Kit）加以調(diào)整改進（在提取DNA過程中加入預冷異丙醇和24 : 1的氯仿:異戊醇混合液）后，提取基因組總DNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量后，稀釋至所需質(zhì)量體積濃度(25 ng /μL)，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的篩選 按照隨機抽樣方式從100對SRAP引物中選取10對進行PCR擴增，選擇條帶較為豐富的2對引物組合Me3(5'-TGAGTCCAAACCGGAAT-3')/Em4(5'-GACTGCGTACGAATTTGA-3')和Me4(5'-TGAGTCCAAACCGGACC-3')/Em4(5'-GACTGCGTACGAATTTGA-3')進行優(yōu)化實驗[22]。

1.2.3 SRAP-PCR的基礎擴增程序 PCR反應在多功能PCR儀中進行，循環(huán)程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后再72 ℃延伸10 min；10 ℃保存。擴增結(jié)果用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察和記錄。

1.2.4 SRAP-PCR反應體系的建立與優(yōu)化驗證選擇5個25 μL的PCR 擴增體系，采用模板2、4號樣本DNA（DNA樣品點樣點為2 μL），選用引物組合（Me3/Em4、Me4/Em4）進行擴增，從中篩選出1個較好的反應體系；在此體系的基礎上，針對影響PCR 反應的6個因素，分別對DNA模板用量、引物、dNTP和Mg2+摩爾體積濃度、Taq DNA聚合酶和退火溫度設置不同的梯度（表1）進行單因素試驗，在PCR擴增儀上進行擴增，對所產(chǎn)生的結(jié)果進行直觀分析，以確定最佳反應體系[23]。并運用不同引物組合（Me18/Em7、Me18/Em6和Me24/Em9）分別對刨花潤楠8個不同家系樣品（選取了上述10個家系中的8個，分別是廣西賀州4個家系，廣西興安中的2個家系，廣西昭平2個家系）進行反應體系的驗證。

表1 SRAP反應體系梯度設置

2 結(jié)果與分析

2.1 刨花潤楠葉片總DNA提取

由圖1可以看出，刨花潤楠總DNA的電泳圖譜清晰完整，片段大于20 kb，無降解拖尾現(xiàn)象產(chǎn)生，無明顯RNA存在，點樣孔附近無滯留物。經(jīng)估算，蛋白快速檢測儀檢測所提取DNA的OD260/ OD280值均為1.73～1.92，質(zhì)量體積濃度為20～80 ng/μL，符合SRAP-PCR模板要求。

2.2 刨花潤楠SRAP-PCR反應體系的優(yōu)化

2.2.1 DNA模板用量 模板DNA用量直接影響SRPA-PCR擴增結(jié)果的條帶。對刨花潤楠總DNA進行PCR擴增，電泳檢測擴增結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，DNA模板量對反應的影響相對較大，但DNA用量在10～80 ng時均可擴增出條帶,而以模板用量為60～80 ng時最為穩(wěn)定；模板用量低于60 ng時，擴增條帶較少。結(jié)合本試驗的結(jié)果，確定60 ng為最佳DNA模板用量。

圖1 刨花潤楠10株不同幼苗基因組總DNA提取電泳圖

圖 2 基因組DNA模板量對刨花潤楠SRAP-PCR反應的影響

2.2.2 Taq DNA聚合酶濃度 Taq DNA聚合酶的活性和用量對SRAP-PCR反應影響較大。由圖3可以看出，0.25～2.00 U都可以得到擴增條帶，聚合酶用量過低時，PCR反應無法完全進行，條帶較為模糊；1.25～1.50 U時效果最好，擴增結(jié)果穩(wěn)定性好、多態(tài)性高；隨著酶用量增大，易產(chǎn)生部分非特異性產(chǎn)物且出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。據(jù)此，本試驗最終采用的Taq酶適宜用量為1.25 U。

2.2.3 Mg2+濃度 Mg2+摩爾體積濃度是影響SRAPPCR反應的主要因素之一。本研究中對不同摩爾體積濃度的Mg2+進行PCR 擴增，結(jié)果（圖4）表明，Mg2+摩爾體積濃度對反應的影響較為明顯，當Mg2+為0時無擴增條帶出現(xiàn)；隨著Mg2+的增加，擴增條帶亮度明顯增大；當增至2.0 mmol/L時，條帶清晰，此時效果最佳；當Mg2+為3.6 mmol/L，產(chǎn)生的擴增條帶模糊且特異性差。故選擇2.0 mmol/L為最佳。

圖 3 TaqDNA聚合酶量對刨花潤楠SRAP-PCR反應的影響

圖 4 Mg2+摩爾體積對刨花潤楠SRAP-PCR反應的影響

2.2.4 dNTP濃度 dNTP是SRAP-PCR擴增反應的原料。由圖5 可知，當dNTP為0.125～0.325 mmol/ L時，都能擴增出條帶, dNTP介于0.125～0.225 mmol/L之間時，擴增條帶相對較少且較為模糊，當dNTP為0.225 mmol/L時，此時擴增條帶最多且最為清晰；dNTP大于0.225 mmol/L，隨著摩爾體積濃度增加，擴增條帶逐漸減弱。據(jù)此，本試驗最終確定dNTP的摩爾體積濃度為0.225 mmol/L。

2.2.5 引物濃度 引物的濃度直接影響PCR擴增效果。由圖6可知，當引物低于0.2 μmol/L，擴增產(chǎn)物較少；當引物在0.3～0.5 μmol/L時，擴增產(chǎn)物條帶多且條帶清晰穩(wěn)定。之后，隨著引物增加，擴增條帶清晰度降低。根據(jù)該試驗結(jié)果，將適宜的引物摩爾體積確定為0.3 μmol/L。

圖 5 dNTP摩爾體積濃度對刨花潤楠SRAP-PCR反應的影響

圖 6 引物摩爾體積對刨花潤楠SRAP-PCR反應的影響

2.2.6 退火溫度 退火溫度直接影響引物與模板DNA的特異性結(jié)合能力。由圖7可知，本試驗中，當退火溫度為54.7～56.9 ℃時，擴增出的譜帶多且清晰明亮，故確定PCR反應體系中退火溫度為56 ℃。在引物篩選時，針對不同引物退火溫度可做適當?shù)恼{(diào)整。

2.2.7 SRAP-PCR最佳反應體系的驗證 綜合以上各試驗及所獲結(jié)果，從擴增產(chǎn)物條帶穩(wěn)定性和節(jié)約成本角度考慮，刨花潤楠SRAP-PCR最佳反應體系為：25 μL的SRAP-PCR反應體系中，2.5 μL 10×PCR buffer、模板DNA量60 ng、Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.225 mmol/L、引物0.3 μmol/L和Taq DNA聚合酶1.25 U。運用不同引物組合（Me18/Em7、Me18/Em6和Me24/Em9）分別對刨花潤楠8個家系樣品進行驗證（圖8），檢驗結(jié)果表明引物能對絕大多數(shù)的個體擴增出清晰譜帶，說明優(yōu)化的刨花潤楠SRAP-PCR反應體系和擴增程序是穩(wěn)定可行的。

圖 7 退火溫度對刨花潤楠SRAP-PCR反應的影響

圖8 應用SRAP-PCR優(yōu)化體系對刨花潤楠不同樣本進行多態(tài)性檢測

3 結(jié)論與討論

本試驗使用omega試劑盒，采用改良CTAB法提取刨花潤楠的基因組DNA，試驗中發(fā)現(xiàn)，在提取過程中，加入24 : 1的氯仿:異戊醇混合液充分振蕩混勻后，在18～20 ℃環(huán)境中離心，可有效提高DNA得率及質(zhì)量。

對于不同的林木材料，擴增體系所用的DNA模板量、Taq 聚合酶、Mg2+、dNTP、引物摩爾體積濃度差異均很大，本試驗所得到的SRAP-PCR擴增體系與麻瘋樹（Jatropha carcas）[24]、石斛（Dendrobium nobile）[25]、楊樹（Populussp.）[26]、油茶（Camellia oleifera）[27]等的擴增體系及循環(huán)條件都有所不同，這可能與不同材料的基因組和材料本身的特殊性以及對試驗結(jié)果條帶的判斷具有主觀性等有關(guān)，因而需要對PCR體系進行不斷優(yōu)化。PCR循環(huán)條件中的退火溫度對反應影響較大，該反應中退火溫度相比其他已報道麻瘋樹、石斛、油茶、楊樹等植物偏高，篩選出的適宜退火溫度（56 ℃）與理論退火溫度（50 ℃）[28]存在較大差異。但同時退火溫度過高或過低都不能得到良好的擴增產(chǎn)物；擴增體系中DNA模板量和Mg2+濃度對反應的影響相對較大，微量變化就有可能導致SRAP-PCR的結(jié)果發(fā)生較大變化，合理調(diào)整DNA模板和Mg2+摩爾體積濃度對反應的擴增很重要。

利用本試驗優(yōu)化所得的SRAP-PCR反應體系，對刨花潤楠23個種源進行SRAP擴增，擴增結(jié)果表明在不同種源的刨花潤楠中均能獲得清晰穩(wěn)定的條帶，不同種源間表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性[29]。由此可見，該反應體系可用于刨花潤楠的遺傳多樣性分析。

[1] 胡希華. 刨花潤楠的優(yōu)良特性及育苗栽培技術(shù)[J]. 湖南林業(yè)科技, 2006, 33(1): 65-66.

[2] 吳振伙, 吳兆平, 全尚龍. 刨花潤楠綜合利用價值及其育苗技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2008(20): 55.

[3] 鐘智群, 譚梓峰, 楊志玲, 等. 刨花楠生長發(fā)育特點及開發(fā)前景分析[J]. 湖南林業(yè)科技, 1997, 24(2): 50-51.

[4] 程棟梁, 靳冰潔, 徐朝斌, 等. 年齡對刨花楠胸徑生長速率的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報, 2013, 40(1) : 28 -31.

[5] 徐朝斌, 鐘全林, 程棟梁, 等. 江西4刨花楠種源苗木葉片表型性狀與生物量分配的比較[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報, 2012, 39(6) : 920 -924.

[6] 張冬生, 謝金蘭, 葉雪蘭, 等. 基于層次分析法與熵技術(shù)法的野生刨花潤楠觀賞性評價[J]. 林業(yè)與環(huán)境科學, 2016, 32(1): 23-30.

[7] 羅阿水.刨花楠容器育苗技術(shù)研究[J].福建林業(yè)科技, 2012, 39(3) : 126-129.

[8] LI G, QUIROS C F. Sequence-related amplifed polymorpgism (SRAP) a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and genetagging in Brassica[J]. TAG Teoretical and Applied Genetics, 2001, 103: 455-461.

[9] 王國澤, 左福元, 曾兵. SRAP分子標記的研究進展及在植物上的應用[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2013, 45(9): 92-95.

[10] LI G, GAO M, YANG B, et al. Gene for genealignment between the Brassica and Arabidopsis genomes by direct transcriptome mapping[J]. TAG Theoretical and Applied Genetics, 2003, 107(1): 168-180.

[11] 井趙斌, 徐明, 雷玉山. 獼猴桃SRAP-PCR體系的建立及品種資源親緣關(guān)系研究[J]. 園藝學報, 2016, 43(2): 337-346.

[12] 李達, 熊興耀, 于曉英, 等. 紅花檵木SRAP反應體系的建立及優(yōu)化[J]. 中南林業(yè)科技大學學報, 2008, 28 (5) : 22-27.

[13] 劉君, 李東, 曾林, 等. SRAP分子標記分析辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[J]. 中國調(diào)味品, 2015, 12(40): 48-51.

[14] 王燕, 龔義勤, 趙統(tǒng)敏, 等. 番茄SRAP-PCR體系優(yōu)化與品種分子鑒定[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報, 2007, 30(1): 23-29.

[15] 李懷志, 張峻, 李翔, 等. 應用SRAP標記對茄子品種進行遺傳多樣性分析與指紋圖譜構(gòu)建[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報, 2011, 34(4): 18-22.

[16] 艾鵬飛, 蘇姍, 靳占忠. 仁用杏品種SRAP遺傳多樣性分析及指紋檢索系統(tǒng)的開發(fā)[J]. 園藝學報, 2014, 41(6): 1191-1197.

[17] 廖柏勇, 王芳, 陳麗君, 等. 基于SRAP分子標記的苦楝種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[J]. 林業(yè)科學, 2016, 52(4): 48-58.

[18] 李培, 闕青敏, 歐陽昆唏, 等. 不同種源紅椿SRAP標記的遺傳多樣性分析[J]. 林業(yè)科學, 2016, 52(1): 62-70.

[19] 楊會肖, 劉天頤, 羅銳, 等. 用SRAP標記構(gòu)建松樹良種指紋圖譜方法的研究[J]. 廣東林業(yè)科技, 2012, 28(5): 1-8.

[20] 劉振, 趙洋, 楊培迪, 等. SSR、SRAP、ISSR分子標記在茶樹品種親本鑒定上的比較分析[J]. 茶葉科學, 2014(6): 617-624.

[21] 李榮華, 夏巖石, 劉順枝, 等. 改進的CTAB法提取植物DNA的方法[J]. 實驗室研究與探索, 2009, 28(9): 14-16.

[22] 李建軍, 劉志堅, 肖層林, 等. SRAP技術(shù)在遺傳的研究進展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展, 2007, 7(5): 783-786.

[23] 劉玉香, 宋曉琛, 江香梅. 潤楠ISSR-PCR優(yōu)化反應體系建立及引物篩選[J]. 林業(yè)科技開發(fā), 2013, 27(5): 24-28.

[24] 仲叢來, 丁貴杰, 沈凌. 麻瘋樹SRAP-PCR反應體系的優(yōu)化[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學, 2010, 38(4): 19-22.

[25] 樊洪泓, 李廷春, 邱婧, 等. 石斛屬植物SRAP反應體系的建立與優(yōu)化[J]. 分子植物育種, 2006, 4(6S): 153-156.

[26] 譚碧玥, 王源秀, 徐立安. 楊樹基因組SRAP擴增體系的建立與優(yōu)化[J]. 林業(yè)科技開發(fā), 2009, 23(2): 25-29.

[27] 祝全東, 張黨權(quán), 李曉云, 等. 油茶SRAP標記的PCR體系建立與優(yōu)化[J]. 中南林業(yè)科技大學學報, 2010, 30(3): 57-62.

[28] 盧盛棟. 現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù)[M].北京: 中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社, 1999: 458-463.

[29] 周鵬, 林瑋, 朱芹, 等. 基于SRAP分子標記的刨花潤楠遺傳多樣性分析[J] . 北京林業(yè)大學學報, 2016, 38(9): 16-24.

Establishment and Optimization of SRAP-PCR System forMachilus pauhoi

ZHOU Peng1,2LIN Wei2ZHOU Xiangbin2CHEN Xiaoyang2
(1.Guangdong Eco-engineering Polytechnic, Guangzhou，Guangdong 510520, China; 2. College of Forestry and Landscape Architecture, Sourth China Agricultural University/Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm, Guangzhou, Guangdong 510642, China)

Machilus pauhoiis a tree specie with variety of economic value and development prospects. This study aimed to establish an optimized SRAP-PCR system forM. pauhoi,and the young leaves of the 1.5 years old seedlings were used as test materials. Six quality factors including the template DNA, primer concentration, dNTP concentration, Mg2+concentration, Taq DNA polymerase, and annealing temperature were optimized forM. pauhoiSRAP-PCR assay. The obtained results suggested a optimized reaction system of SRAP-PCR (total 25 μL) involving 2.5 μL 10×PCR buffer, 60 ng DNA, 2.0 mmol/ L Mg2+, 0.225 mmol/L dNTP, 0.3 μmol/L primer, 1.25 U Taq DNA polymerase. The verification results showed that the optimized SRAP-PCR reaction system and amplifcation program were stable and feasible.

Machilus pauhoi；SRAP-PCR；system optimization

S718.43，S792.23

：A

：2096-2053（2017）04-0029-05

“十二五”國家科技支撐項目“刨花潤楠和黃樟良種選育研究”（2012BAD01B04）；廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目“楝科、樟科優(yōu)質(zhì)速生樹種良種選育和高效栽培技術(shù)研究與示范”（2011KJCX002）。

周鵬（1989— ），男，助教，主要從事林木遺傳育種研究，E-mail：zhoupeng_0119@163.com。

陳曉陽（1958— ），男，教授，主要從事林木良種選育與生物技術(shù)研究，E-mail：xychen@scau.edu.cn。