王 斌張慧玲朱曉芳沈仁芳?

（1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

（2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

（3 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

水稻品種間鋁耐性差異的探究*

王 斌1，2張慧玲3朱曉芳1沈仁芳1?

（1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

（2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

（3 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

鋁毒是酸性土壤中限制植物生長的主要因子之一，探討植物耐鋁特性與機(jī)理對(duì)提高酸性土壤植物生產(chǎn)力具有重要意義。通過一系列生理和分子生物學(xué)試驗(yàn)，主要探究了Nipponbare和Kasalath兩個(gè)水稻品種的鋁耐性差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Kasalath相比，Nipponbare在鋁脅迫下不僅擁有較長的根伸長，且根尖鋁含量較少，表明Nipponbare是水稻鋁耐性品種，而Kasalath為鋁敏感品種。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，水稻根尖控制鋁吸收的NRAT1基因在Kasalath中表達(dá)量更高，表明，NRAT1基因的高表達(dá)量可能是導(dǎo)致鋁敏感品種Kasalath根尖鋁含量較高的主要原因。此外，鋁脅迫下，Nipponbare根系檸檬酸的分泌量顯著高于Kasalath。而且，水稻中控制檸檬酸分泌的OsFRDL4基因在鋁耐性品種Nipponbare中的表達(dá)量顯著高于Kasalath，由此證明，檸檬酸在這兩個(gè)品種水稻耐鋁途徑中可能起著重要的作用，并且，該品種水稻可以通過調(diào)控OsFRDL4基因的表達(dá)量來控制檸檬酸的分泌量。本研究中還分析了其他4個(gè)與鋁脅迫相關(guān)的基因，但并未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性，值得進(jìn)一步的探究。

水稻；鋁脅迫；鋁耐性；OsFRDL4；NRAT1

全世界約有39.5×108hm2酸性土壤，占世界可耕地土壤的40%，主要分布在熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)、尤其是發(fā)展中國家［1］。我國酸性土壤遍及南方15個(gè)省區(qū)，廣泛分布在我國東南部熱帶、亞熱帶地區(qū)，據(jù)資料統(tǒng)計(jì)分布面積可達(dá)14.8萬～20.3萬km2，約占全國陸地總面積的15.4%～21%［2-3］。Foy［4］和Kochian［1］認(rèn)為鋁毒害是酸性土壤上限制作物生長的主要因子之一。通常情況下，土壤中的鋁是以不溶態(tài)的鋁硅酸鹽或者氧化鋁的形式存在，對(duì)植物無毒，但當(dāng)土壤pH＜5.5時(shí)，鋁就會(huì)從礦物態(tài)解離為離子態(tài)（其中以三價(jià)的Al3+毒性最強(qiáng)），從而對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用［1，4］。因此，為了保障我國酸性土壤的糧食產(chǎn)量，不同作物耐鋁機(jī)制的研究就顯得格外重要。

水稻（Oryza sativa）是我國重要的糧食作物之一，廣泛種植于南方各個(gè)省區(qū)，也是受鋁毒影響較為普遍的作物之一。然而，不同基因型水稻品種間耐鋁差異非常大，其中的原因并不完全知曉。近年來，馬建鋒實(shí)驗(yàn)室對(duì)水稻耐鋁性做了一系列相關(guān)的研究，并取得了重大的研究成果：首次發(fā)現(xiàn)了與水稻鋁耐性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ART1，其特異表達(dá)在水稻根部細(xì)胞核中，且不受鋁的誘導(dǎo)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，水稻ART1突變體對(duì)鋁的敏感性增加，主要因?yàn)锳RT1能調(diào)控下游與鋁耐性相關(guān)的31個(gè)基因的表達(dá)［5］，并對(duì)其中多個(gè)基因進(jìn)行了深入的研究，包括NRAT1、OsFRDL4、ALS1、STAR1和STAR2等［6］。其中，NRAT1基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)體主要在水稻根尖細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，能將外界的鋁離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，從而增加細(xì)胞內(nèi)的鋁含量［7］。ALS1編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體主要在植物根部細(xì)胞的液泡膜上表達(dá)，其能將植物中的鋁轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中固定起來，從而減緩鋁毒害［8］。STAR1編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，能與同樣在水稻根部細(xì)胞的細(xì)胞膜表達(dá)的STAR2聯(lián)合運(yùn)輸二磷酸尿苷萄糖，用于修復(fù)破損的細(xì)胞壁，從緩解鋁毒害［9］。OsFRDL4基因編碼的蛋白質(zhì)主要在水稻根尖細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)檸檬酸，是影響水稻耐鋁性的重要基因，該基因在水稻鋁耐性品種中受鋁誘導(dǎo)的表達(dá)倍數(shù)要高于鋁敏感品種，且有機(jī)酸的分泌量與該基因的表達(dá)量成正比［10］。本文試圖研究這6個(gè)基因在兩個(gè)不同耐鋁水稻中表達(dá)量的差異，探究水稻品種的耐性差異是否與上述基因的表達(dá)量相關(guān)，為之后的水稻耐鋁品種篩選提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)選取的水稻品種如下：Kasalath（A）、IR26（B）、奧優(yōu)277（C）、揚(yáng)稻6號(hào)（D）、亞優(yōu)388（E）、楊輻秈2號(hào)（F）、南京16（G）、Koshihikari（H）和日本晴（Nipponbare）（I）。

選取各品種籽粒飽滿的種子，在25℃下用蒸餾水浸泡過夜，然后將種子放置在濕潤的濾紙上25℃避光催芽2～3 d，移至下含0.5 mmol L-1的CaCl2（pH 4.5）溶液的浮板上培養(yǎng)1 d。選取長勢(shì)相近的幼苗，分別在含有0 μmol L-1、30 μmol L-1和50 μmol L-1AlCl3的CaCl2（0.5 mmol L-1，pH 4.5）溶液中培養(yǎng)24 h。處理前后均用直尺量取根長，計(jì)算相對(duì)根長率，每處理10個(gè)重復(fù)。

1.2 根尖鋁含量測(cè)定

如上所述，水稻幼苗在0.5 mmol L-1的CaCl2（pH為4.5）溶液中培養(yǎng)1 d后，選取長勢(shì)相近的幼苗在含50 μmol L-1AlCl3的CaCl2（0.5 mmol L-1，pH 4.5）溶液中培養(yǎng)24 h。切取鋁處理后的根尖（0～1 cm）10個(gè)，用0.5 mmol L-1的CaCl2溶液沖洗3次后，放入1.5 ml的離心管中，加入1 ml 2 mol L-1的HCl溶液，中間間斷地?fù)u動(dòng)。放置至少24 h后，吸取全部上清液轉(zhuǎn)移至10 ml離心管中，定容至5 ml。用ICP-AES（IRIS-Advantage，ThermoElement，美國）測(cè)定溶液鋁含量，每處理重復(fù)4次［11］。

1.3 根系分泌物的收集與測(cè)定

用木村營養(yǎng)液培養(yǎng)水稻幼苗2周，該營養(yǎng)液含有0.18 mmol L-1（NH4）2SO4、0.27 mmol L-1MgSO4·7H2O、0.09 mmol L-1KNO3、0.18 mmol L-1Ca（NO3）2·4H2O、0.09 mmol L-1KH2PO4、6.7 μmol L-1MnCl2·4H2O、9.4 μmol L-1H3BO3、0.01 μmol L-1（NH4）6Mo7O24·4H2O、0.15 μmol L-1ZnSO4·7H2O、0.16 μmol L-1CuSO4·5H2O 和10 μmol L-1EDTA-Fe。選取長勢(shì)相近的水稻株系，放入1 L的容器中，置于pH4.5的0.5 mmol L-1CaCl2溶液中過夜，然后用含50 μmol L-1AlCl3的0.5 mmol L-1CaCl2溶液（pH4.5）處理24 h，收集其根系分泌物。

將收集溶液依次通過裝有5 g陽離子交換樹脂（Amberlite IR120 H+，Aldrich，美國）和裝有3 g陰離子交換樹脂（AG1-X8 Formate，Bio-Rad，美國）的離子吸附柱，再用15 ml的2 mol L-1HCl分3次洗脫陰離子吸附柱，洗脫液再用真空冷凍旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化 1000S，日本）旋轉(zhuǎn)蒸干，最后用1 ml超純水溶解蒸餾瓶中的產(chǎn)物，用超快速高分離液相色譜儀（島津 UFLC-20，日本）測(cè)定。測(cè)試條件：色譜柱（Agilent，SB-C18，250 nm × 4.6 nm，5 μm）、流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液（A，pH4.5）—甲醇（B），A（98%）—B（2%）、流速0.8 ml min-1、進(jìn)樣量20 μl、柱溫30℃。

1.4 根尖RNA的提取

如上所述，水稻幼苗在0.5 mmol L-1的CaCl2（pH為4.5）溶液中培養(yǎng)1 d后，選取長勢(shì)相近的幼苗，在含0 μmol L-1、50 μmol L-1AlCl3的CaCl2（0.5 m mol L-1，pH 4.5）溶液中培養(yǎng)24 h。切取鋁處理后的根尖（0～1 cm）10～20條，用蒸餾水漂洗后放入1.5 ml的離心管中，立即放入液氮中冷凍，每個(gè)處理重復(fù)3次。冷凍完全后將樣品倒入滅菌后的坩堝中碾碎，加入350 μl的裂解液（TIANGEN，中國），碾磨均勻后倒回1.5 ml的離心管中，在12 000 r min-1（ThmeroMicrocl17，德國）的條件下離心，吸取上清液用TGuige核酸自動(dòng)提取儀（TIANGENM16，中國）提取RNA，最終定容至60 μl體系。

1.5 RNA反轉(zhuǎn)錄

吸取14 μlRNA放入PCR小管中，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO，日本），加入4 μl的反轉(zhuǎn)錄緩沖液（5×RT Buffer），1 μl的酶混合液（EnzymeMix），1 μl的引物混合液（PrimerMix），共20 μl體系。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?7℃條件下15 min，98℃條件下5 min，4℃終止反應(yīng)，得到cDNA。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）

RT-PCR為10 μl體系：5 μl的Tip qPCR Mix（TRANSGEN，中國），4.5 μl 的滅菌水，0.2 μl的正向引物，0.2 μl的反向引物，0.1 μl的cDNA。

儀器采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Light-Cycler480II，Roch，瑞士）。運(yùn)作程序?yàn)槿椒ǎ?5℃下15 s，55℃下15 s，72℃下20 s，共45個(gè)循環(huán)。其中，ART1、NRAT1、OsFRDL4、ALS1四個(gè)基因用HistoneH3作為內(nèi)參基因，STAR1和STAR2兩個(gè)基因用Actin作為內(nèi)參基因。反應(yīng)的引物序列詳見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列表Table 1 Primer sequence for RT-PCR

1.7 數(shù)據(jù)處理

相對(duì)根伸長率（RRE）的計(jì)算公式如下［12］：

RRE=（RLAl，i-RLAl0）/（RLC，i-RLC0）×100%

式中，RLAl，i為鋁處理24 h后的根長；RLAl0為鋁處理前的根長；RLC，i為對(duì)照處理24 h后的根長；RLC0為對(duì)照處理前的根長。

本研究中，相對(duì)根伸長率測(cè)定結(jié)果為10次重復(fù)的平均值，根尖鋁含量測(cè)定結(jié)果為4次重復(fù)的平均值，其余均為3次重復(fù)的平均值。所得數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)不同處理在p＜0.05條件下的差異顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 不同水稻品種鋁脅迫下的相對(duì)根伸長

鋁脅迫下，植物的根伸長會(huì)受到顯著抑制。因此，測(cè)定相同條件下植物根長便可斷定該植株對(duì)鋁脅迫的耐性大小，而相對(duì)伸長率也成了篩選不同耐鋁植物的重要指標(biāo)［11］。由圖1可見，不同水稻品種在30 μmol L-1鋁溶液處理下，已經(jīng)受到了不同程度的抑制。尤其是Kasalath受抑制尤其明顯，根伸長率為32.27%。而Nipponbare則表現(xiàn)得相對(duì)較耐鋁，根伸長率68.17%。品種之間的耐性差值高達(dá)35%，差異顯著。在50 μmol L-1鋁處理下，植物的根伸長受到了進(jìn)一步的抑制。圖中表現(xiàn)為，Kasalath作為水稻敏感品種受抑制最明顯，根伸長率為27.95%。而Nipponbare仍然是耐性品種，根生長率為54.60%。敏感品種與耐性品種間差異高達(dá)26%，差異顯著。因此，根據(jù)本結(jié)果選取典型試驗(yàn)材料，Kasalath為相對(duì)鋁敏感品種，Nipponbare為相對(duì)鋁耐性品種。

圖1 30 μmol L-1和50 μmol L-1鋁處理24 h水稻相對(duì)根伸長Fig. 1 Relative root elongation（RRE）of the rice plants exposed to 30 μmol L-1and 50 μmol L-1aluminum（Al）for 24 h

2.2 不同水稻品種根尖鋁含量

根尖是根伸長最重要的部位，也是鋁毒害最為敏感的部位［13］。水稻是一種鋁排斥植物，鋁耐性的強(qiáng)弱往往與根尖鋁積累量的高低有關(guān)。從圖2中可見，Kasalath的根尖鋁積累量是Nipponbare的1.6倍，差異顯著。由此得出，Kasalath確實(shí)為鋁敏感品種，并且根尖鋁含量相對(duì)較高，Nipponbare為鋁耐性品種，根尖鋁含量相對(duì)較低。

2.3 不同水稻品種根系分泌檸檬酸含量

在植物耐鋁機(jī)制的研究中，植物根部可以通過分泌有機(jī)酸與環(huán)境中的鋁螯合，從而減輕鋁毒害［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，Nipponbare與Kasalath在鋁處理前兩者檸檬酸的分泌量無差異，而鋁處理后兩者檸檬酸分泌量顯著上升，說明檸檬酸的分泌受鋁脅迫響應(yīng)。同時(shí)，Nipponbare鋁處理后檸檬酸分泌量顯著高于Kasalath（圖3），推測(cè)水稻鋁耐性品種在鋁脅迫下會(huì)分泌更多的檸檬酸來緩解鋁毒。

圖2 50 μmol L-1鋁處理24 h水稻根尖鋁含量Fig. 2 Al content in the root tips of the rice plants exposed to 50 μmol L-1Al for 24 h

2.4 水稻耐Al相關(guān)基因表達(dá)

圖3 50 μmol L-1鋁處理24 h水稻根部檸檬酸分泌量Fig. 3 Secretion of citric acid from roots of the rice plants exposed to 50 μmol L-1Al for 24 h

由圖4可見，鋁處理后，ART1、ALS1和STAR2基因在不同鋁耐性品種水稻中的表達(dá)量無顯著差異，而STAR1雖然鋁處理后兩者存在顯著差異，但STAR1與SRAT2在功能上共同起作用，因此，該4個(gè)基因?qū)λ酒贩N間鋁耐性差異是否有關(guān)，值得進(jìn)一步的研究。其中，ART1基因在鋁處理前后，表達(dá)水平均未發(fā)生顯著變化。表明，該基因雖為水稻中眾多鋁耐性相關(guān)基因的調(diào)控因子，但本身并不受鋁誘導(dǎo)而發(fā)生表達(dá)量變化，而ALS1、STAR1和STAR2則受鋁誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著上升，表明這些基因受鋁誘導(dǎo)表達(dá)，與前人研究結(jié)果［5，9］一致。

圖4 50 μmol L-1鋁處理24 h相關(guān)基因根尖相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Expression levels of Al tolerance related genes in root tips of the rice plants exposed to 50 μmol L-1Al for 24 h

由圖5A可見，鋁處理后，Kasalath與Nipponbare中NRAT1的表達(dá)量均顯著上升，表明該基因受鋁誘導(dǎo)。其中，Kasalath中NRAT1表達(dá)量上調(diào)5倍，Nipponbare中NRAT1上調(diào)4倍。Kasalath中NRAT1的基因表達(dá)量顯著高于耐性品種Nipponbare。由于NRAT1能將外界的鋁轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，ALS1編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體又能將植物細(xì)胞內(nèi)的鋁轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中固定起來，因此，這兩者共同控制了水稻對(duì)鋁脅迫的響應(yīng)［8］。本研究中，鋁處理后，Kasalath與Nipponbare中ALS1的表達(dá)量并無顯著差異，因此，Kasalath中NRAT1表達(dá)量的提升，可引起更多的鋁積累在植物細(xì)胞內(nèi)部，導(dǎo)致鋁毒害的加深，從而抑制其根伸長。進(jìn)一步測(cè)定Kasalth和Nipponbare根尖細(xì)胞壁中的鋁含量發(fā)現(xiàn)，Kasalath根尖細(xì)胞壁中的鋁含量也顯著高于Nipponbare（圖5B）。

由圖5C可見，鋁處理后水稻中的OsFRDL4基因的表達(dá)量極顯著上升，上升倍數(shù)高達(dá)100倍～200倍。其中，鋁敏感品種Kasalath中OsFRDL4的上調(diào)倍數(shù)顯著低于鋁耐性品種Nipponbare的上調(diào)倍數(shù)。由此推測(cè)，OsFRDL4基因與這兩個(gè)水稻品種間的耐鋁差異有關(guān)。

3 討 論

圖5 50 μmol L-1鋁處理下相關(guān)基因根尖相對(duì)表達(dá)量（A，C）以及根尖細(xì)胞壁鋁含量（B）Fig. 5 Relative expression level of Al tolerance related genes in root tips（A，C）and Al content in root tip cell walls（B）of the rice plants exposed to 50 μmol L-1Al for 24 h

在近幾年的水稻耐鋁機(jī)理研究中，控制水稻耐鋁的相關(guān)基因逐步被發(fā)現(xiàn)，并且這些基因的功能以及緩解水稻鋁毒害的途徑也逐步被認(rèn)知，如ART1、FRDL4、NRAT1、ALS1、STAR1和STAR2等。其中ART1是水稻鋁耐性相關(guān)基因的調(diào)控因子，其調(diào)控水稻至少與鋁耐性相關(guān)的31個(gè)基因的表達(dá)［6］。水稻的耐鋁性是由多基因控制的，正因?yàn)槿绱?，水稻品種間鋁耐性的差異通常非常大。本研究希望通過比較不同鋁耐性的水稻品種中鋁耐性相關(guān)基因的表達(dá)量，探究鋁耐性相關(guān)基因與水稻品種間鋁耐性差異的關(guān)系，為水稻耐鋁品種篩選提供數(shù)據(jù)支持。

根尖是根伸長最重要的部位，也是鋁毒害最為敏感的部位，因此，在判定不同水稻品種間耐鋁性差異上起著重要作用［13］，其根部的鋁含量與受到的鋁毒害程度有明顯的正相關(guān)性［17-18］。研究發(fā)現(xiàn)，Kasalath無論在30 μmol L-1還是50 μmol L-1鋁濃度處理下，其根伸長受到的抑制作用最為明顯，判斷其為相對(duì)鋁敏感水稻品種。Nipponbare在相同鋁濃度處理下，其根伸長顯著高于其他水稻品種，判斷其為相對(duì)鋁耐性水稻品種（圖1）。并且，在相同濃度鋁處理下，Kasalath的根尖鋁含量顯著高于Nipponbare（圖2），進(jìn)一步證實(shí)了Kasalath確實(shí)為鋁敏感水稻品種，Nipponbare為鋁耐性水稻品種。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鋁處理后，ART1、ALS1和STAR2基因在Kasalath與Nipponbare中的表達(dá)量并無顯著差異，STAR1在鋁處理后存在顯著差異。其中，ART1是水稻鋁耐性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子，該基因不受鋁誘導(dǎo)，推測(cè)其表達(dá)量可能并不隨著水稻鋁耐性變化而變化。此外，ALS1基因的表達(dá)量在兩個(gè)品種間差異并不顯著，說明ALS1可能并不是這兩個(gè)水稻品種鋁耐性差異的主要原因。盡管STAR1在鋁處理后兩者存在顯著差異，但STAR1與SRAT2在功能上共同起作用，因此，這2個(gè)基因與該水稻品種間鋁耐性差異是否有關(guān)，值得進(jìn)一步的研究（圖4）。另一方面，NRAT1和OsFRDL4表達(dá)量具有顯著差異。鋁處理后，兩個(gè)水稻品種中NRAT1的表達(dá)量均顯著上升，并且Kasalath中NRAT1基因的表達(dá)量顯著高于Nipponbare，其根尖細(xì)胞壁鋁含量也顯著高于Nipponbare（圖5）。而Xia等［15］研究中，敏感水稻品種中NRAT1基因的表達(dá)量顯著低于耐性水稻品種，并且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，該基因的表達(dá)量與水稻品種的耐鋁性呈正相關(guān)，這與本研究結(jié)果不符，推測(cè)可能有以下兩個(gè)原因：（1）與水稻品種間的差異有關(guān)；（2）水稻的耐鋁性是由多基因控制的，NRAT1能將外界的鋁轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，若水稻內(nèi)部鋁解毒機(jī)制未協(xié)同跟上，也可能導(dǎo)致內(nèi)部鋁毒害的加深，從而抑制水稻的生長。Li等［16］的研究中發(fā)現(xiàn)，NRAT1過表達(dá)株系鋁耐性得到一定程度的提升，但同時(shí)使得植物細(xì)胞壁以及細(xì)胞液中的鋁含量上升，植物中ALS1的基因表達(dá)量也相應(yīng)上升。因此，進(jìn)一步測(cè)定Kasalth和Nipponbare根尖細(xì)胞壁中的鋁含量發(fā)現(xiàn)，Kasalath根尖細(xì)胞壁中的鋁含量確實(shí)顯著高于Nipponbare（圖5B），而Kasalath與Nipponbare中負(fù)責(zé)將鋁轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中固定起來的ALS1的表達(dá)量并無顯著差異，因此，Kasalath中NRAT1的高表達(dá)量可能會(huì)使更多的鋁積累在Kasalath內(nèi)部，導(dǎo)致鋁毒害加深。

OsFRDL4是影響水稻鋁耐性的重要基因，其編碼的蛋白質(zhì)與檸檬酸的轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。該基因在水稻鋁耐性品種中受鋁誘導(dǎo)的表達(dá)倍數(shù)通常高于鋁敏感品種，且有機(jī)酸的分泌量與該基因的表達(dá)量成正比［10］。研究發(fā)現(xiàn)，鋁處理后兩個(gè)水稻品種中OsFRDL4的表達(dá)量顯著增加，其中Nipponbare中OsFRDL4的表達(dá)量顯著高于Kasalath（圖5C），并且在鋁處理后，Nipponbare根部檸檬酸的分泌量也顯著高于Kasalath（圖3）。推測(cè)這兩個(gè)品種的水稻在鋁脅迫下，可以通過調(diào)節(jié)FRDL4的表達(dá)量，以控制根部檸檬酸分泌來螯合環(huán)境中的鋁，減少根尖細(xì)胞壁上鋁的吸附，從而緩解鋁毒。同時(shí)，水稻品種的耐鋁性越強(qiáng)，該基因的表達(dá)量也越高。由此推測(cè)，F(xiàn)RDL4基因與這兩個(gè)水稻品種間的耐鋁差異有關(guān)。

4 結(jié) 論

Kasalath為相對(duì)鋁敏感水稻品種，Nipponbare為相對(duì)耐鋁水稻品種。Kasalath在鋁處理下，根伸長受到的抑制更顯著，根尖鋁含量也顯著高于Nipponbare，主要?dú)w因于其根尖OsFRDL4的表達(dá)量相對(duì)較低，以及NRAT1基因的表達(dá)量相對(duì)較高。相應(yīng)地，其根系分泌的檸檬酸含量也相對(duì)較低，導(dǎo)致更多的鋁吸附在根尖細(xì)胞壁上。而ALS1基因的表達(dá)量在兩水稻品種間無顯著差異，表明有更多的鋁轉(zhuǎn)運(yùn)至Kasalath細(xì)胞內(nèi)，并對(duì)水稻產(chǎn)生毒害作用。因此，Kasalath的根尖鋁含量較高，其受到鋁的毒害作用也較強(qiáng)。

［1］ Kochian L V. Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plants. Annual Review of Plant Biology & Plant Molecular Biology，1995，46（1）：237—260

［2］ 李智燕，邢學(xué)峰，唐華，等. 鋁和酸脅迫對(duì)苜蓿根瘤菌生長和抗氧化酶系的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（3）：146—153

Li Z Y，Xing X F，Tang H，et al. Effects of aluminum and acid stresses on the growth and antioxidant enzyme activities of rhizobia isolated from Medicago lupulina and M. sativa（In Chinese）. Acta Prataculturae Sinica，2013，22（3）：146—153

［3］ 熊毅，李慶逵. 中國土壤. 北京：科學(xué)出版社，1987

Xiong Y，Li Q K. Soils of China（In Chinese）. Beijing：Science Press，1987

［4］ Foy C D. Plant adaptation to acid，aluminum-toxic soils. Communications in Soil Science & Plant Analysis， 1988，19（7/12）：959—987

［5］ Yamaji N，Huang C F，Nagao S，et al. A zinc finger transcription factor ART1 regulates multiple genes implicated in aluminum tolerance in rice. The Plant Cell，2009，21（10）：3339—3349

［6］ Delhaize E，Ma J F，Ryan P R. Transcriptional regulation of aluminium tolerance genes. Trends in Plant Science，2012，17（6）：341—348

［7］ Xia J X，Yamaji N，Kasai T，et al. Plasma membranelocalized transporter for aluminum in rice. Proceedings of the National Academy of Sciences，2010，107（43）：18381—18385

［8］ Huang C F，Yamaji N，Chen Z C，et al. A tonoplastlocalized half-size ABC transporter is required for internal detoxification of aluminum in rice. The Plant Journal，2012，69（5）：857—867

［9］ Huang C F，Yamaji N，Mitani N，et al. A bacterialtype ABC transporter is involved in aluminum tolerance in rice. The Plant Cell，2009，21（2）：655—667

［10］ Yokosho K，Yamaji N，Ma J F. An Al-inducible MATE gene is involved in external detoxification of Al in rice. The Plant Journal，2011，68（6）：1061—1069

［11］ Ahn S J，Sivaguru M，Osawa H，et al. Aluminum inhibits the H+-ATPase activity by permanently altering the plasma membrane surface potentials in squash roots. Plant Physiology，2001，126（4）：1381—1390

［12］ Zheng S J，Yang J L，He Y F，et al. Immobilization of aluminum with phosphorus in roots is associated with high aluminum resistance in buckwheat. Plant Physiology，2005，138（1）：297—303

［13］ 林咸永，章永松，羅安程. 不同小麥基因型耐鋁性的差異及篩選方法的研究. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2001，7（1）：64—70

Lin X Y，Zhang Y S，Luo A C. Study on the differences of aluminum tolerance in different wheat genotypes and the screening methods（In Chinese）. Plant Nutrition and Fertilizer Science，2001，7（1）：64—70

［14］ Miyasaka S C，Buta J G，Howell R K，et al. Mechanism of aluminum tolerance in snapbeans root exudation of citric acid. Plant Physiology，1991，96（3）：737—743

［15］ Xia J X，Yamaji N，Che J，et al. Differential expression of Nrat1 is responsible for Al-tolerance QTL on chromosome 2 in rice. Journal of Experimental Botany，2014，65（15）：4297—4304

［16］ Li J Y，Liu J P，Dong D K，et al. Natural variation underlies alterations in Nramp aluminum transporter（NRAT1）expression and function that play a key role in rice aluminum tolerance. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences，2014，111（17）：6503—6508［17］ Wang H H，Hua J J，Bi Y R. Nitrate reductasedependent nitric oxide production is involved in aluminum tolerance in red kidney bean roots. Plant Science，2010，179（3）：281—288

［18］ Zhu X F，Shi Y Z，Lei G J，et al. XTH31，encoding an in vitro XEH/XET-active enzyme，regulates aluminum sensitivity by modulating in vivo XET action，cell wall xyloglucan content，and aluminum binding capacity in Arabidopsis. The Plant Cell，2012，24（11）：4731—4747

［19］ Ma J F，Zheng S J，Matsumoto H. Specific secretion of citric acid induced by Al stress in Cassia tora L. Plant and Cell Physiology，1997，38（9）：1019—1025

［20］ Kochian L V，Pi?eros M A，Liu J P，et al. Plant adaptation to acid soils：The molecular basis for crop aluminum resistance. Annual Review of Plant Biology，2015，66：571—598

［21］ Yokosho K，Yamaji N，F(xiàn)ujii-Kashino M，et al. Retrotransposon-mediated aluminum tolerance through enhanced expression of the citrate transporter OsFRDL4. Plant Physiology，2016，172（4）：2327—2336

［22］ 吳韶輝，蔡妙珍，劉鵬，等. 低pH和鋁毒對(duì)蕎麥根邊緣細(xì)胞特性的交互作用研究，土壤學(xué)報(bào)，2008，45（2）：336—340

Wu S H，Cai M Z，Liu P，et al. Interactions between low pH and aluminum toxicity on characteristics of root border cells of buckwheat（In Chinese）. Acta Pedologica Sinica，2008，45（2）：336—340

［23］ Liu J，Magalhaes J V，Shaff J，et al. Aluminumactivated citrate and malate transporters from the MATE and ALMT families function independently to confer Arabidopsis aluminum tolerance. The Plant Journal，2009，57（3）：389—399

［24］ 張富林，張啟明，趙學(xué)強(qiáng)，等. 磷對(duì)植物鋁毒害作用研究中兩種磷鋁處理方法比較. 土壤學(xué)報(bào)，2010，47（2）：311—318

Zhang F L，Zhang Q M，Zhao X Q，et al. Comparison between two P-Al treatment methods in studying effect of phosphorus on aluminium toxicity to plants（In Chinese）. Acta Pedologica Sinica，2010，47（2）：311—318

［25］ 孫清斌，沈仁芳，尹春芹，等. 鋁毒脅迫下植物的響應(yīng)機(jī)制，土壤，2008，40（5）：691—697

Sun Q B，Shen R F，Yin C Q，et al. Response mechanisms of plants against Al stresses（In Chinese）. Soils，2008，40（5）：691—697

［26］ Ma J F，Chen Z C，Shen R F. Molecular mechanisms of Al tolerance in gramineous plants. Plant and Soil，2014，381（1/2）：1—12

［27］ 吳道銘，傅友強(qiáng)，于智衛(wèi)，等. 我國南方紅壤酸化和鋁毒現(xiàn)狀及防治，土壤，2013，45（4）：577—584

Wu D M，F(xiàn)u Y Q，Yu Z W，et al. Status of red soil acidification and aluminum toxicity in South China and prevention（In Chinese）. Soils，2013，45（4）：577—584

Differences in Aluminium Tolerance between Rice Varieties

WANG Bin1，2ZHANG Huiling3ZHU Xiaofang1SHEN Renfang1?
（1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture，Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210008，China）
（2 University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）
（3 College of Resources and Environmental Science，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

【Objective】Aluminum（Al）toxicity is an important factor that inhibits growth of plants in acid soils. Different plant species are often different in Al tolerance，and so are different varieties of the same species. Through a series of hydroponic experiments，this paper was to explore difference between two varieties of rice，Nipponbare and Kasalath in Al tolerance and mechanism responsible for the variation.【Method】 Plump seeds of the two varieties of rice were selected and placed in an incubator for germination at 25℃. Then seedlings similar in growing were divided into two groups，one undergoing treatment with 0.5 mmol L-1CaCl2and pH 4.5 for 24 h（Treatment CK）and the other with 50 μmol L-1AlCl3in addition to 0.5 mmol L-1CaCl2and pH 4.5 for 24 h，too（Treatment Al）. Root length was measured before and after thetreatment with a ruler. After the treatments，some roots tips（0～1 cm）of the seedling were cut down with a knife，and placed into plastic tubes containing 1 ml 2 mol L-1HCl，separately，for 24 h extraction. Then the solutions were analyzed for Al concentration with ICP. Besides，some root tips were put direct into liquid nitrogen for refrigeration at -80℃ for late-on RNA extraction. To compare the two varieties of rice in Alinduced citrate secretion from the root system，some two-week-old seedlings were treated as in Treatment Al for 24 h. Then solution from the treatment was diverted into a column containing 5 g of cation resin（Amberlite IR-120B resin）for adsorption and then into another column containing 3 g of anion resin（AG 1 × 8 resin）. The anion-resin column was then eluted with 2 mol L-1HCl and the eluate condensed into solid through evaporation in a rotary evaporator. Then，1 ml of milliQ water was used to dissolve the solid adhered to the evaporator for determination of content of organic acids with HPCL.【Result】It was found that under Al stress，Nipponbare was less inhibited than Kasalath，for it had longer roots and less Al in root tips，which indicates that Nipponbare is an Al tolerant variety of rice，while Kasalath an Al sensitive variety. It was also found in further studies that the expression of NRAT1，which is responsible for controlling Al uptake，was much higher in Kasalath than in Nipponbare，and the high expression is possibly the major cause leading to the high Al concentration in the root tips of Kasalath，an Al-sensitive variety of rice. Furthermore，it was also found that under Al stress，Nipponbare secreted more citric acids than Kasalath did and the expression of OsFRDL4，a gene controlling root secretion of citric acid，was significantly higher in level in the former than in the latter，which demonstrates that citric acid may possibly play a critical role in rice tolerating Al and the variety of rice controls secretion of citric acid by regulating expression level of OsFRDL4 gene. However，tests were also done on other four genes that may be related to Al tolerance，but no direct relationship was observed. So further studies need to be done.【Conclusion】 Nipponbare and Kasalath shows different Al tolerance in the present study. Nipponbare is an Al tolerant rice variety，while Kasalath an Al sensitive one. The difference in Al tolerance between the two varieties of rice may be attributed to the differences in expressions levels of NRAT1 and OsFRDL4.

Rice；Aluminum stress；Aluminum tolerance；OsFRDL4；NRAT1

Q945

A

（責(zé)任編輯：陳榮府）

10.11766/trxb201610280440

* 國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973 計(jì)劃）項(xiàng)目（2014CB441000）資助 Supported by the National Basic Research Program of China（973 Program）（No. 2014CB441000）

? 通訊作者 Corresponding author，E-mail：rfshen@issas.ac.cn

王 斌（1991—），男，浙江杭州人，碩士研究生，主要從事植物逆境生理的研究。E-mail：binw@issas.ac.cn

2016-10-28；

2017-02-20；優(yōu)先數(shù)字出版日期（www.cnki.net）：2017-03-15