張竹青， 盧書明， 王花麗， 徐夢杳， 李春艷， 辛 悅， 趙俊軍

(1 大連市中心醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116033；2 大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 a. 消化內科；b. 病理科，遼寧 大連 116011)

microRNA-222在肝細胞癌組織中的表達及意義

張竹青1， 盧書明2a， 王花麗2b， 徐夢杳2a， 李春艷2a， 辛 悅1， 趙俊軍1

(1 大連市中心醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116033；2 大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 a. 消化內科；b. 病理科，遼寧 大連 116011)

目的 檢測microRNA-222(miRNA-222)在肝細胞癌(HCC)組織中的表達，并探討其臨床意義。方法 收集2012年1月-2014年12月于大連市中心醫(yī)院、大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院手術切除的HCC組織103例，采用實時定量PCR方法檢測HCC、近癌旁肝硬化組織及遠癌旁肝組織中miRNA-222的表達水平，分析miRNA-222表達與HCC臨床病理特征之間的關系。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett′s T3法；兩組間比較采用t檢驗。結果 miRNA-222在HCC、近癌旁肝硬化組織及遠癌旁肝組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義(F=27.167，P<0.001)，其在HCC組織中的相對表達量(4.543±2.029)明顯高于在近癌旁肝硬化組織(3.072±0.844)及遠癌旁肝組織(1.559±0.695)中的相對表達量(P值均<0.01)；近癌旁肝硬化組織中miRNA-222的相對表達量顯著高于遠癌旁肝組織(P<0.01)。miRNA-222的表達與HCC的大小、分化程度、門靜脈瘤栓、侵襲轉移均有關聯(lián)(t值分別為7.256、9.900、2.345、4.225，P值均<0.05)；而與性別、年齡、合并病毒性肝炎及AFP升高無關(P值均>0.05)。結論 miRNA-222在HCC組織中異常高表達，檢測miRNA-222有助于HCC臨床進展及預后的判斷。

癌， 肝細胞； 微RNAs

最新報道[1]顯示我國肝細胞癌(HCC)的發(fā)病率在惡性腫瘤中居第4位，病死率在癌癥相關死亡中居第3位，但目前HCC的具體發(fā)病機制仍不清楚。近年來研究[2]發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)作為一類非編碼單鏈小分子RNA，通過互補配對的方式與靶基因序列特異性結合，在細胞增殖、分化、凋亡等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，發(fā)揮類似癌基因和抑癌基因的功能。miRNA-222屬于miRNA-221/222家族，定位于X染色體P11.3區(qū)約1 kb的區(qū)域內，在腫瘤細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用，且在胃癌、結直腸癌、膀胱癌等惡性腫瘤異常表達，并與腫瘤的轉移、分期關系密切[3-5]。本研究通過檢測miRNA-222在HCC、近癌旁肝硬化組織及遠癌旁肝組織中的表達，分析miRNA-222與HCC臨床病理特征的關系，探討其在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2012年1月-2014年12月于大連市中心醫(yī)院、大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院手術切除的HCC組織103例，其中男90例，女13例，年齡39～74歲，平均(57.59±8.49)歲，年齡<60歲60例，≥60歲43例；有病毒性肝炎病史者78例，無肝炎病史者25例；腫瘤大?。?5 cm者75例，≥5 cm者28例；分化程度：高中分化66例，低分化37例；出現(xiàn)門靜脈瘤栓者16例，未出現(xiàn)門靜脈瘤栓者87例；發(fā)生侵襲轉移39例，未見侵襲轉移64例；AFP水平升高者60例，正常者43例。所有病例均經(jīng)術后病理切片確診，術前均未接受放療和化療。選擇HCC手術切除后近癌旁肝硬化組織32例、遠癌旁肝組織標本(距離腫瘤邊緣至少5 cm，且病理顯示無肝硬化形態(tài)表現(xiàn))18例，所有組織均經(jīng)病理學證實。

1.2 主要試劑 石蠟包埋組織miRNA快速提取試劑盒購自上海吉瑪制藥技術有限公司，TaqMan MicroRNA反轉錄試劑盒、TaqMan univsersal PCR Master MixⅡ、TaqMan MicroRNA分析試劑盒購自美國Life Technologies公司。目的基因序列在GenBank中查找，使用Primer-Express3.0軟件設計引物，其中miRNA-222擴增片段為155 bp，上游引物為5′-CTGGGTCTCTGATGGCATCT-3′，下游引物為5′-TGTGTGTGAGTGTGTGTGTG-3′；選擇U6基因作為內參，擴增長度為96 bp，其上游引物為5′-CTCGCTTCG-GCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCGT-3′。引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.3 實時定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)反應

1.3.1 RNA提取 HCC、近癌旁肝硬化及遠癌旁肝組織中總RNA的提取采用石蠟包埋組織miRNA快速提取試劑盒，按照試劑盒說明書進行。采用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，A260/A280比值在1.8～2.1，提示RNA純度較好，可用于下一步PCR操作。

1.3.2 qRT-PCR反應 逆轉錄反應：總反應體系為15 μl，包括無RNA酶水4.16 μl，dNTP 0.15 μl，反轉錄酶1.0 μl，10×RT緩沖液1.5 μl，RNA酶抑制劑0.19 μl，逆轉錄引物(miRNA-222，U6)3 μl，RNA樣本5 μl；其中總RNA為10 ng(稀釋成2 ng/μl)。反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，收集cDNA產(chǎn)物常規(guī)置于-20 ℃保存。

PCR反應：總反應體系為20 μl，Master MixⅡ 10 μl，Small RNA Assay 1 μl，模板cDNA 1.33 μl，無RNA酶水7.67 μl。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min條件下擴增40個循環(huán)。miRNA表達水平用2-△△Ct表示，其中△△Ct=(CtmiRNA-222-CtU6)實驗組-(CtmiRNA-222-CtU6)對照組，得到miRNA-222在各組中的相對表達量。

2 結果

2.1 miRNA-222在HCC、近癌旁肝硬化組織及遠癌旁肝組織中的表達 qRT-PCR檢測顯示，miRNA-222在HCC、近癌旁肝硬化組織及遠癌旁肝組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義(F=27.167，P<0.001)。進一步兩兩比較顯示，miRNA-222在HCC組織中的相對表達量(4.543±2.029)明顯高于其在近癌旁肝硬化組織(3.072±0.844)及遠癌旁肝組織(1.559±0.695)中的相對表達量(P值均<0.01)；近癌旁肝硬化組織中miRNA-222的相對表達量顯著高于遠癌旁肝組織(P<0.01)(圖1)。

2.2 miRNA-222的表達與HCC患者臨床病理參數(shù)之間的關系 HCC腫瘤≥5 cm、低分化、有門靜脈瘤栓、發(fā)生侵襲轉移組中miRNA-222的相對表達量均高于相應的腫瘤<5 cm、高中分化、無門靜脈瘤栓、未發(fā)生侵襲轉移組中miRNA-222的相對表達量，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表1)。

圖1 miRNA-222在HCC、近癌旁肝硬化及遠癌旁肝組織中表達的比較 與近癌旁肝硬化組織比較， *P<0.01； 與遠癌旁肝組織比較，#P<0.01

表1 不同HCC臨床病理參數(shù)之間miRNA-222的表達差異

3 討論

miRNAs可通過調控轉錄后基因表達參與肝癌細胞的增殖、凋亡、侵襲與轉移[6]，一些miRNAs可作為早期診斷HCC及判斷預后的指標[7-8]。本研究結果顯示，miRNA-222在HCC組織中的表達明顯高于其在近癌旁肝硬化組織及遠癌旁肝組織中的表達，且近癌旁肝硬化組織中miRNA-222的表達也顯著高于遠癌旁肝組織，提示在肝硬化階段miRNA-222即表達增高，而在HCC組織中表達水平最高。研究[9]發(fā)現(xiàn)miRNA-222的表達從肝硬化至早期HCC及晚期HCC呈逐步增加態(tài)勢，提示miRNA-222高表達與HCC的發(fā)生密切相關。而有研究[10]顯示miRNA-222在HCC組織中表達明顯增高，而在肝內膽管癌組織中卻明顯降低，這些發(fā)現(xiàn)提示miRNA-222在不同腫瘤中的表達具有組織特異性，未來可用于HCC的診斷。Zhang等[11]和Fiorino等[12]研究顯示miRNA-222在慢性HBV感染時表達增高，在HBV和HCV相關性HCC患者血清中表達水平也顯著增高，表明miRNA-222可作為診斷肝炎相關HCC可能的生物學指標。

研究[3-4]顯示miRNA-222的表達與胃癌、結腸癌的臨床分期、淋巴結轉移顯著相關，可作為腫瘤的預后指標，且miRNA-222的表達與HCC腫瘤分化程度密切有關，并與HCC患者生存期顯著相關[13]，miRNA-222高表達的HCC患者中位生存期明顯低于低表達組[9]。也有報道[10,14]顯示miRNA-222與HCC的數(shù)目、大小、分期、Child-Pugh分級及預后并無相關性。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-222的表達水平與HCC腫瘤大小、分化程度、有無門靜脈瘤栓及發(fā)生侵襲轉移有關聯(lián)，提示miRNA-222表達越高，HCC惡性程度就越高，越易發(fā)生侵襲轉移，患者預后越差。故檢測miRNA-222有助于HCC臨床進展及預后的判斷。

研究[9,15]報道m(xù)iRNA-222可下調α抑制活性多肽、激活AKT信號轉導通路，影響HCC的發(fā)生與轉移，在肝癌細胞系中miRNA-222可直接抑制PTEN蛋白的表達，導致PI3K/AKT/mTOR通路激活[16]，而上調miRNA-222可抑制PTEN蛋白的表達，使HepG2細胞的增殖和侵襲能力大大增強[17]。抑制miRNA-222的表達可增加口腔鱗狀細胞癌對順鉑的化療敏感性[18]。最新研究[19]顯示miRNA-222通過調控PTEN/AKT/FOXO1信號通路參與乳腺癌細胞的阿霉素耐藥，而抑制miRNA-222能夠改善乳腺癌患者的預后。此外，miRNA-222還能夠調節(jié)HCC對索拉非尼的耐藥性[20]。因此未來通過調控HCC細胞miRNA-222的表達可能應用于治療HCC。

綜上所述，miRNA-222在HCC組織中的表達明顯增高，且與HCC腫瘤分化程度、侵襲及轉移等密切相關，檢測miRNA-222有助于HCC臨床進展及預后的判斷，其可能成為HCC重要的診斷檢測指標及治療靶點，但需要今后更深入的研究。

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引證本文：ZHANG ZQ, LU SM, WANG HL, et al. Expression of microRNA-222 in hepatocellular carcinoma tissue and its clinical significance[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(8): 1502-1505. (in Chinese) 張竹青， 盧書明， 王花麗， 等. microRNA-222在肝細胞癌組織中的表達及意義[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(8): 1502-1505.

(本文編輯：葛 俊)

Expression of microRNA-222 in hepatocellular carcinoma tissue and its clinical significance

ZHANGZhuqing,LUShuming,WANGHuali,etal.

(DepartmentofPathology,DalianCentralHospital,Dalian,Liaoning116033,China)

Objective To investigate the expression of microRNA-222 (miRNA-222) in hepatocellular carcinoma (HCC) tissue and its clinical significance. Methods A total of 103 HCC tissue samples were collected from the patients who underwent surgical resection in Dalian Central Hospital and The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University from January 2012 to December 2014. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of miRNA-222 in HCC tissues, adjacent cirrhotic tissues, and distal liver tissues, and the association between miRNA-222 expression and the clinicopathological features of HCC was analyzed. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups, and the Dunnett′s T3 test was used for further comparison between any two groups; thet-test was used for comparison between two groups. Results There was a significant difference in the expression of miRNA-222 between HCC tissues, adjacent cirrhotic tissues, and distal liver tissues (F=27.167,P<0.001); the HCC tissues had significantly higher relative expression of miRNA-222 than the adjacent cirrhotic tissues (4.543±2.029 vs 3.072±0.844,P<0.01) and the distal liver tissues (4.543±2.029 vs 1.559±0.695,P<0.01), and the adjacent cirrhotic tissues had significantly higher relative expression of miRNA-222 than the distal liver tissues (P<0.01). The expression of miRNA-222 was significantly associated with tumor size, degree of tumor differentiation, tumor thrombus in the portal vein, and invasion/metastasis (t=7.256, 9.900, 2.345, and 4.225, allP<0.05), while it was not associated with sex, age, the presence of viral hepatitis, or increased alpha-fetoprotein level (allP>0.05). Conclusion

The expression of miRNA-222 is abnormally upregulated in HCC tissue, and miRNA-222 measurement may help to evaluate the clinical progression and prognosis of HCC.

carcinoma, hepatocellular; microRNAs

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.08.018

2017-02-28；

2017-03-30。

國家自然科學基金項目(81502274)；遼寧省自然科學基金資助項目(2015020324)；大連市衛(wèi)生局課題

張竹青(1978-)，女，主要從事消化道惡性腫瘤發(fā)生機制研究。

R735.7

A

1001-5256(2017)08-1502-04