韓嬌嬌，張濤，林青，霍向東，史應(yīng)武，高雁

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091)

新疆低階煤溶煤菌的分離與鑒定

韓嬌嬌1,2，張濤2，林青2，霍向東2，史應(yīng)武2，高雁2

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091)

【目的】從采集的煤、腐木和土壤樣品中分離、鑒定出能夠高效降解新疆低階煤的菌株，研究細(xì)菌對新疆低階煤的轉(zhuǎn)化能力?！痉椒ā坑门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基分離、純化菌株；通過初步篩選，選出發(fā)酵之后CZAPECK DOX-medium培養(yǎng)基變成深褐色或者黑色的菌株，之后利用液體培養(yǎng)基對菌株的溶煤率進(jìn)行測定；構(gòu)建溶煤菌株的16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹并對菌株進(jìn)行生物學(xué)鑒定?！窘Y(jié)果】從采集的樣品中共分離出191株細(xì)菌，從煤樣品、腐木樣品和土壤樣品中分別分離出25、61和105株菌，分別占總數(shù)的13%、32%、54%。通過初步篩選，選出28株具有溶煤功能的菌株，其中NH-6、NF-1、NH-3、YF-3、NG-4的溶煤率分別為35.06%、34.72%、25.23%、28.03%、35.89%，對新疆低階煤具有較好的降解能力。經(jīng)過初步鑒定NG-4、NF-1、YF-3均屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)；NH-3、NH-6屬于假單孢菌屬(Pseudomonas)?！窘Y(jié)論】篩選得到的幾株芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單孢菌屬(Pseudomonas)的菌株對新疆低階煤具有較高的降解能力，補(bǔ)充了新疆低階煤降解菌資源。

低階煤；細(xì)菌；降解

0 引 言

【研究意義】新疆煤炭資源豐富，其中低階煤占了相當(dāng)高的比例。近年來通過物理、化學(xué)等手段處理煤炭，雖然可以實(shí)現(xiàn)煤炭的轉(zhuǎn)化，但是存在二次環(huán)境污染、成本高等問題[1]。利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)來處理煤炭不但能克服物理、化學(xué)轉(zhuǎn)化的缺點(diǎn)，而且具有零污染、低能耗、工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1982 年，Gabriele和Cohen[2]兩位教授發(fā)現(xiàn)了兩株白腐菌Polyporusversicolor和Poriamonticolor能夠?qū)⒑置阂夯?，將其轉(zhuǎn)化成黑色小液滴。隨后Quigley[3-5]，Cohen[6]等相繼提出微生物產(chǎn)生的堿性物質(zhì)降解，螯合劑降解等降解煤機(jī)理。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)[7-8]、中國礦業(yè)大學(xué)[9]、大連理工大學(xué)[10]等高校都相繼在低階煤降解菌菌種的選育及其降解產(chǎn)物的應(yīng)用等方面開展研究，并取得一定的研究成果。主要是選育出與低階煤相匹配的且能將其轉(zhuǎn)化成易溶于水的物質(zhì)的菌株，并從降解產(chǎn)物中提取有價(jià)值的物質(zhì)，將其應(yīng)用于工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，例如：生長促進(jìn)劑、清潔燃料、工業(yè)添加劑等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】林啟美等[11]發(fā)現(xiàn)不同菌株對煤中不同組分的轉(zhuǎn)換能力不同，可見微生物與煤的降解兩者之間是存在匹配關(guān)系的[12]，而關(guān)于新疆低階煤相匹配的菌株的報(bào)道較少。研究細(xì)菌對新疆低階煤的轉(zhuǎn)化能力?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從不同環(huán)境中選育出低階煤的高效降解菌株，補(bǔ)充新疆低階煤降解菌資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集

樣品共12種，為4種煤樣品，4種腐木樣品，4種土壤樣品。煤樣品是新疆雙龍腐植酸有限公司提供的粉末狀煤樣；腐木樣品分別來自基達(dá)勒、可可托海、農(nóng)大校園；土壤樣品來自可可托海、呼圖壁縣、克拉瑪依市、烏魯木齊市，主要選取地表以下5～10 cm的土壤。列出樣品種類。表1

表1 樣品種類
Table 1 Sample types

樣品Sample采樣地點(diǎn)Thelocationofthesamples樣品編號Samplenumber風(fēng)化煤樣品Dantysamples1一號風(fēng)化煤公司提供M12二號風(fēng)化煤公司提供M23三號風(fēng)化煤公司提供M34四號風(fēng)化煤公司提供M4腐木樣品Rottingwoodsamples5紅松腐木基達(dá)勒F16樺樹腐木基達(dá)勒F27柳樹腐木新農(nóng)大校園F38未知腐木可可托海F4土壤樣品Soilsamples9腐木根際土壤可可托海T110苜蓿根際土壤呼圖壁縣T211油田土壤克拉瑪依T312垃圾廠附近土壤烏魯木齊市T4

1.1.2 培養(yǎng)基1.1.2.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)

按照參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行配制。

1.1.2.2 細(xì)菌降解培養(yǎng)基為改良的CZAPECK DOX-medium培養(yǎng)基

按照參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行配制。

1.2 方 法

1.2.1 低階煤降解細(xì)菌的分離、篩選1.2.1.1 菌株的分離純化

分別稱取5 g樣品，用滅菌的研缽磨碎后加入到裝有50 mL無菌水的錐形瓶中 ，于30℃、150 r/min的搖床上震蕩搖勻。將處理過的煤樣、腐木樣稀釋至10-2、10-3、10-4，將土壤樣品稀釋至10-3、10-4、10-5，將稀釋后的不同梯度的樣品溶液各取200 μL，用涂布棒均勻地涂在NA培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24～36 h，挑取平板上不同形態(tài)菌株的單菌落，反復(fù)劃線直到獲得純菌株。

1.2.1.2 溶煤菌株的篩選

將純化后的菌株去重后，全部接種到裝有10 mL CZAPECK DOX-medium培養(yǎng)基的試管中，在30℃、150 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24～36 h(此時(shí)菌株處于對數(shù)生長期)。以三號風(fēng)化煤為降解對象，稱取粉碎的原煤0.3 g加到菌液中，于30℃、150 r/min的搖床上培養(yǎng)10 d。觀察培養(yǎng)基顏色變化，選出發(fā)酵后培養(yǎng)基顏色呈深褐色或黑色的菌株。

1.2.1.3 降解細(xì)菌溶煤率測定

量取150 mL CZAPECK DOX-medium培養(yǎng)基，加入到500 mL的錐形瓶中。培養(yǎng)基滅菌后，將初步篩選得到的溶煤菌株加入到錐形瓶中，在30℃，150 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24～36 h，此時(shí)菌株處于生長對數(shù)期。在超凈工作臺中將滅菌處理過的煤粉稱取3 g分別加入到菌液中，在30℃、150 r/min的條件下混合振蕩培養(yǎng)15 d。發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵液的pH以及煤的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行測定，轉(zhuǎn)化率按以下方法測定：

發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液在10 000 r/min的條件下離心10 min，離心后再將發(fā)酵液通過微孔濾膜過濾，以徹底清除發(fā)酵液中的菌絲和剩余的煤。在發(fā)酵液中加入濃鹽酸，直到發(fā)酵液的pH一直保持在2以下。加入酸后發(fā)酵液會產(chǎn)生絮狀沉淀，再通過離心和過濾的方式獲得沉淀(沉淀即為降解產(chǎn)物)，將沉淀在60℃的烘箱中烘干至恒重，并記錄數(shù)據(jù)。菌株的降解率是降解產(chǎn)物的質(zhì)量與加入煤樣質(zhì)量之比[10]，即η=(M1/M0)×100%。

注：M0：煤樣的質(zhì)量(g)；M1：煤降解產(chǎn)物的質(zhì)量(g)。

1.2.2 降解細(xì)菌的分類鑒定

1.2.2.1 16S rDNA基因的擴(kuò)增與測序

將菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)1 d，挑取適量菌體于ep管中，基因組DNA的提取按照參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。16S rDNA基因用兩個(gè)引物(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGR-3′;1 492R:5′-CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3′)來擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：DNA 模板1 μL，2XMix 25 μL，27F (10 μM) 1 μL，1 492R (10 μM)1 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。擴(kuò)增條件：按照參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送至上海生工測序。

1.2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將得到的溶煤菌株的DNA序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，獲取相關(guān)種屬的16S rDNA基因序列[15]，利用ClustaIX軟件將序列進(jìn)行排列后采用鄰接法構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

通過平板分離，從采集的12種樣品中共分離出細(xì)菌191株。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，不同樣品微生物的數(shù)量級存在差異，其中煤樣品的生物量整體較小，CFU平均值為6.1×104，土壤樣品的生物量整體較大，CFU平均值為5.8×105，從4種煤樣品中只分離出25株細(xì)菌，占總數(shù)的13%，從4種腐木樣品和4種土壤樣品中分別分離出61株、105株細(xì)菌，占總數(shù)的32%、54%。表2

2.2 降解細(xì)菌的篩選

將分離得到的191株細(xì)菌全部接種到裝有10 mL CZAPECK DOX-medium培養(yǎng)基的試管中。通過篩選試驗(yàn)，有28株菌株在發(fā)酵后培養(yǎng)基顏色變深。初步斷定這些菌株具有降解低階煤的能力。圖1

2.3 降解細(xì)菌溶煤率測定

通過初篩，得到28株具有溶煤功能的細(xì)菌，將菌株接種到CZAPECK DOX-medium培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，驗(yàn)證菌株的溶煤功能并計(jì)算溶煤率。結(jié)果顯示，發(fā)酵15 d后的發(fā)酵液離心去除煤渣和菌絲后，發(fā)酵液呈現(xiàn)深褐色或黑色，且pH值與發(fā)酵前相比有所提高。在發(fā)酵液中加入過量的濃鹽酸會有絮狀沉淀產(chǎn)生。離心、烘干沉淀后計(jì)算菌株的溶煤率。其中有5株細(xì)菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的溶煤能力，其菌株編號為NH-6、NF-1、NH-3、YF-3、NG-4。表3

表2 樣品含菌量及菌株分離
Table 2 Content of bacteria and strain separation

樣品編號Samplenumber菌落形成單位Colonyformingunit(CFU/g)分離出的菌株數(shù)NumberofstrainsM13×1045M23.45×1045M31.6×1058M41.95×1047F11.9×10514F22.35×10521F31.6×10513F49.45×10513T13.25×10518T25.93×10519T34.55×10526T42.63×10542

2.4 降解細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)溶煤菌株的16S rDNA基因的有效序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。分支節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字代表經(jīng)過1 000次自舉(Bootstrap)分析的結(jié)果。進(jìn)化樹結(jié)果表明，所選的菌株在進(jìn)化樹上的位置是可靠的[15]?？赏茢喑鯪G-4、NF-1、YF-3均屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)；NH-3、NH-6屬于假單孢菌株(Pseudomonas)。圖2

圖1 降解細(xì)菌初篩
Fig.1 The results of the preliminary screening degradation bacteria表3 篩選出的部分降解細(xì)菌
Table 3 Part of the degradation bacteria screened out

菌株Strain初始pHTheinitialpH最終pHThefinalpH沉淀質(zhì)量Precipitationquality(g)溶煤率Solventratio(%)NH-67100.701135.06NF-1790.694334.72NH-37100.504625.23YF-37100.560628.03NG-47100.717835.89

圖2 篩選出5株細(xì)菌的進(jìn)化樹
Fig.2 Select the evolutionary tree of 5 strains of bacteria

3 討 論

煤的生物加工研究主要在兩個(gè)方面：一是煤的凈化，二是煤的生物轉(zhuǎn)化，前者主要是利用微生物(細(xì)菌、真菌、放線菌等)對煤中的硫等物質(zhì)進(jìn)行脫除。后者主要是利用微生物對煤炭進(jìn)行轉(zhuǎn)化以實(shí)現(xiàn)煤的溶解與液化[17]，并將其降解產(chǎn)物應(yīng)用于生產(chǎn)。煤的凈化研究工作開展的比較早，研究成果也較多，具有較為樂觀的前景。煤的生物轉(zhuǎn)化的研究于20世紀(jì)80年代，現(xiàn)今越來越多具有溶煤功能的菌種被發(fā)現(xiàn)。有從煤、洗煤廢水以及礦區(qū)煤泥等與煤有關(guān)的環(huán)境中篩選得到溶煤菌株。也有從腐木、土壤等其它環(huán)境中篩選出溶煤菌株。煤的微生物降解領(lǐng)域的研究工作已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。另有研究表明，微生物與煤的降解兩者之間是存在匹配關(guān)系的[12，16]。因此，針對不同煤種篩選出與之相匹配的溶煤微生物顯得尤為重要。雖然新疆煤炭資源豐富，但是關(guān)于新疆煤種相匹配的降解微生物的報(bào)道很少。

研究從樣品中分離出28株能降解低階煤的細(xì)菌，從中挑選出了5株降解效果較好的菌株(分別編號為NG-4、NF-1、YF-3、NH-3、NH-6)。通過16S rDNA基因序列分析，初步判定NG-4、NF-1、YF-3均屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)；NH-3、NH-6屬于假單孢菌屬(Pseudomonas)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)可知芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單孢菌屬(Pseudomonas)中的一些微生物對煤確實(shí)具有降解作用，研究對這一點(diǎn)進(jìn)行了證實(shí)。

目前對芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單孢菌屬(Pseudomonas)降解煤的機(jī)制及其應(yīng)用已經(jīng)有一系列的報(bào)道，例如，1981年，F(xiàn)akoussa研究表明某些假單胞菌能夠利用低階煤中的有機(jī)物作為其唯一碳源，并可以將部分天然煤降解，形成有色液滴。安徽理工大學(xué)的張明旭等[18]，研究了多帖類芽孢桿菌和球紅假單胞菌對褐煤的降解作用。對多貼類芽孢桿菌進(jìn)行馴化并測定其對褐煤的降解能力。結(jié)果表明，在對褐煤進(jìn)行預(yù)處理的情況，菌株對褐煤的降解率為28.88%?？梢娫搶僭诿航到夥矫姘l(fā)揮了重要的作用，研究對該屬的降解菌群進(jìn)行了補(bǔ)充。

4 結(jié) 論

從采集的4種煤樣品，4種腐木樣品，4種土壤樣品中進(jìn)行菌株的分離純化培養(yǎng)，從篩選出的28株具有降解功能的菌株中，挑選出5株降解效果較好的菌株，其對煤的轉(zhuǎn)化率：NG-4為35.89%、NF-1為34.72%、YF-3為28.03%、NH-3為25.23%、NH-6為35.06%。通過16S rDNA基因序列分析，初步判定NG-4、NF-1、YF-3均屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)；NH-3、NH-6屬于假單孢菌株(Pseudomonas)；研究對芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單孢菌屬(Pseudomonas)中的低階煤降解菌群進(jìn)行了補(bǔ)充。

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Bacteria Isolation and Identification of Xinjiang Low-rank Coal Solvent

HAN Jiao-jiao1,2, ZHANG Tao2, LIN Qing2, HUO Xiang-dong2, SHI Ying-wu2, GAO Yan2

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，XinjiangUniversity，Urumqi830046，China;2.ResearchInstituteofAppliedMicrobiology，XinjiangAcademyofAgriculturalSciences，Urumqi830091，China)

【Objective】 This project aims to identify the strains that can degrade the low rank coal from the collected samples of coal, rotten wood and soil samples in Xinjiang and study the transformation ability of bacteria to the low rank coal.【Method】The strains were isolated and purified with beef extract peptone culture medium; Through the preliminary screening, the CZAPECK DOX -medium selected became a dark brown or black strain. Then the liquid medium was used to determine the dissolution rate. The phylogenetic tree of 16S rDNA gene was thus constructed for biologically identifying the strains.【Result】191 strains of bacteria were isolated from the samples collected, that was 25 strains, 61 strains and 105 strains were isolated from the samples of coal, rotten wood and soil, which accounted for 13%, 32%, 54% of the total, respectively. Through the preliminary screening, 28 strains with the function of solubilization of coal were selected, among which, the dissolution rates of NH-6, NF-1, NH-3, YF-3 and NG-4 were 35.06%, 34.72%, 25.23%, 28.03% and 35.89%, respectively. After preliminary identification, NG-4, NF-1 and YF-3 all belonged toBacillusgenus(Bacillus) and NH-3, NH-6 belonged to fake single spore strains(Pseudomonas).【Conclusion】The selected strains ofBacillussp. (Bacillus) andPseudomonassp. (Pseudomonas) have a higher degradation ability to Xinjiang low rank coal, which supplement the low rank coal degradation bacteria resources in Xinjiang.

low-rank coal; bacteria;degradation

GAO Yan (1979-),Female,native place: Xinjiang.associate professor,research field: Microbiology.(E-mail)47795411@qq.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.06.021

2016-11-21

自治區(qū)科技支撐項(xiàng)目“新疆低階煤的微生物溶解及液化機(jī)理研究”(2016D03018)

韓嬌嬌(1992-)，女，新疆人，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸铮?E-mail)hjj4546@163.com

高雁(1979-)，女，新疆人，副研究員，博士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)，(E-mail)47795411@qq.com

S188

A

1001-4330(2017)06-1130-07

Supported by: Autonomous Region Key Technology R&D Program"Study on Microorganism Liquefaction of Low-rank Coal in Xinjiang special environment"(2016D03018)