朱靜，房世杰，唐琦勇，張麗娟，王瑋，王博，宋素琴，顧美英，張志東

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研管理處，烏魯木齊 830016)

耐輻射短梗霉發(fā)酵黑色素動力學(xué)模型

朱靜1，房世杰2，唐琦勇1，張麗娟1，王瑋1，王博1，宋素琴1，顧美英1，張志東1

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研管理處，烏魯木齊 830016)

【目的】研究耐輻射短梗霉MF1黑色素分批發(fā)酵動力學(xué)。【方法】描述短梗霉分批發(fā)酵黑色素過程中細胞生長、產(chǎn)物積累、糖消耗的變化規(guī)律?；贚ogistic方程和Luedeking-Piret方程分別建立黑色素發(fā)酵過程菌體生長、黑色素產(chǎn)生及葡萄糖消耗隨時間變化的數(shù)學(xué)模型，對實驗值與模型進行了驗證比較?！窘Y(jié)果】動力學(xué)模型計算值結(jié)果與實驗值擬合良好，較好地反映了短梗霉黑色素分批發(fā)酵過程的動力學(xué)特征。計算獲得菌體最大黑色素生產(chǎn)能力為1.523×10-4g/g葡萄糖·g干菌體·h?！窘Y(jié)論】該動力學(xué)模型為天然菌株黑色素的中試放大，大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

黑色素；出芽短梗霉；發(fā)酵動力學(xué)；數(shù)學(xué)模型

0 引 言

【研究意義】隨著近年來物理、化學(xué)以及生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的農(nóng)藥光保護劑被研究發(fā)現(xiàn)，其保護機理主要包括光吸收作用及抗氧化作用[1-3]。光保護劑能有效的保護生物農(nóng)藥的光破壞特別是紫外光的破壞，且多數(shù)為生物安全和環(huán)境友好性助劑，但其提取和合成成本高昂，而且在農(nóng)藥使用中，一般需添加農(nóng)藥的1%以上才會起到較好的效果[2]，極大提高生物農(nóng)藥的銷售價格及防治成本。天然黑色素(melanin)是一種廣泛存在于動植物和微生物中的非均質(zhì)類多酚聚合體，是一類高分子量褐色-黑色素的總稱[4]。黑色素作為生物體中廣泛存在的保護性色素，具有良好的光吸收作用，較強的清除自由基、抗氧化等功能[5,6]。黑色素能作為良好的生物農(nóng)藥的光保護劑、紫外吸收劑、抗氧化劑、自由基清除劑、抗病毒藥物及食用色素和化工染料等，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)、日用化妝品工業(yè)、醫(yī)藥化工等眾多領(lǐng)域[7-11]?！厩叭搜芯窟M展】微生物來源的黑色素種類多樣，自然界中多種微生物可產(chǎn)黑色素，包括大腸桿菌、鏈球菌、鏈霉菌等，霉菌如黑曲霉、鏈格孢霉及出芽短梗霉等[12]。一般認為黑色素不是微生物生長、代謝、繁殖所必須的物質(zhì)，但黑色素能提高微生物抗重金屬毒害，抗紫外線及射線損害，抗氧化，從而增強其生存能力[4,8]。微生物生產(chǎn)黑色素還具有不受地域、季節(jié)限制，易于工業(yè)化的特點。出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)是一種具有酵母型和菌絲型形態(tài)的多形真菌，其厚垣孢子積累黑色素[13]，可抵抗紫外線、高滲脅迫及重金屬毒害等多種逆境[14,15]，還可作為單細胞蛋白、細胞壁多糖、胞外多糖、果膠酶、色素等的生產(chǎn)菌株[16]。目前對真菌耐輻射特性和機理方面研究發(fā)現(xiàn)，黑色素的產(chǎn)生對真菌的耐輻射作用至關(guān)重要，可令其具有較高耐γ-射線輻照的能力[17]，部分真菌黑色素甚至可以俘獲離子輻射能量作為能源[18,19]。目前大部分的報道都是針對短梗霉多糖的發(fā)酵特性和發(fā)酵動力學(xué)的研究，而對短梗霉黑色素的發(fā)酵動力學(xué)報道很少?！颈狙芯壳腥朦c】前期從新疆輻射污染土樣中分離篩選出一株短梗霉菌株MF1，該菌在發(fā)酵中大量產(chǎn)生水溶性黑色素?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究在前期發(fā)酵優(yōu)化的基礎(chǔ)上[20]，對其分批發(fā)酵的菌體生長、黑色素產(chǎn)生及基質(zhì)消耗動力學(xué)過程進行研究，并建立動力學(xué)模型，對后期小試放大及發(fā)酵優(yōu)化控制具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種及試劑

實驗菌株MF1分離自新疆輻射污染環(huán)境土壤，經(jīng)系統(tǒng)鑒定為出芽短梗霉變種(Aureobasidiumpullulansvarsp.)，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所提供。該菌株可以在60Coγ射線20kGry劑量照射下存活[10]。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，Agar 15 g，H2O 1 000 m。

種子培養(yǎng)基(MEA培養(yǎng)基)：麥芽浸粉 30 g，大豆蛋白胨 3 g，純凈水1 000 mL，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 30 g，酵母浸膏 2.02 g，硫酸銨2.0 g，NaCl 0.5 g，CuSO40.16 mg，純凈水1 000 mL，pH自然。

1.1.3 儀器與設(shè)備

PL203電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SPX-150B生化培養(yǎng)箱，寧波東南儀器有限公司；HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司； Eppendorf 5424離心機，德國 Eppendorf股份公司； UV-2550 紫外分光光度計，日本島津儀器(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 黑色素的發(fā)酵

從新鮮斜面挑取一環(huán)菌苔，接種于液體種子培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)36 h，取2 mL接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)，并定期取樣測定發(fā)酵過程各指標(biāo)。

1.2.2 生物量測定

由于發(fā)酵早期菌量較少，研究采用比濁度和細胞干重相結(jié)合的方法，根據(jù)菌懸液在600 nm處吸光度與菌體干重的關(guān)系曲線，將吸光度轉(zhuǎn)化為菌體干重；后期由于發(fā)酵菌量較多，且黑色素的產(chǎn)生會對比濁測定造成影響，因此，取發(fā)酵液在10 000 r/min離心10 min，收集菌體，在100℃下烘干至恒重，稱量測定。

1.2.3 葡萄糖的測定

取發(fā)酵液在10 000 r/min離心10 min后去菌體，取上清發(fā)酵液進行適當(dāng)稀釋后，采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法[21]測定葡萄糖，并計算發(fā)酵液中殘?zhí)呛俊?/p>

1.2.4 黑色素的測定

將發(fā)酵液離心取上清，2倍無水乙醇沉淀，9 000 r/min離心5 min后，棄上清液，沉淀于80 ℃烘干24 h后，所得產(chǎn)物為黑色素粗提物。再經(jīng)DMSO溶解, 5 000 r/min離心10 min，用酸性甲醇(pH=2)做沉淀劑重復(fù)2次，最后的沉淀用丙酮洗滌3次，烘干備用。

黑色素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取0.015 g的黑色素提取物，定容于100 m，配制成黑色素標(biāo)準(zhǔn)母液。取一定量的標(biāo)準(zhǔn)母液進行梯度稀釋后，分別于400 nm下測定其光吸收值，并繪制黑色素溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。

黑色素的測定：將發(fā)酵液離心去菌體，上清經(jīng)適當(dāng)稀釋后，以未接菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，于400 nm下測定其光吸收值，并計算發(fā)酵液中黑色素的產(chǎn)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)的平均值及誤差由DPS 9.5分析，采用Origin 8.0 Pro 進行模型數(shù)據(jù)擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 分批發(fā)酵動力學(xué)曲線

研究表明，菌株MF1生長情況為菌株發(fā)酵延遲期為0～16 h，對數(shù)生長期為16～166 h，之后為穩(wěn)定期。從菌體生長與產(chǎn)物形成的關(guān)系看，在菌體主要生長階段，即菌株的對數(shù)生長期時，菌體量迅速增加，菌株不產(chǎn)生黑色素；當(dāng)進入對數(shù)末期及穩(wěn)定期時，黑色素開始大量生成。研究使用的菌株發(fā)酵生產(chǎn)黑色素的發(fā)酵過程屬于動力學(xué)二型，即產(chǎn)物形成與菌體生長部分偶聯(lián)型[22]。圖1

圖1 菌株黑色素發(fā)酵動力學(xué)曲線
Fig.1 Kinetic cuives of glucose concentratiom. yield of melanin and dry cell weight during fermentation

2.2 黑色素發(fā)酵動力學(xué)模型的建立

在發(fā)酵過程中，同時存在著菌體生長和產(chǎn)物形成兩個過程，它們都需要消耗培養(yǎng)基中的基質(zhì)，因此有各自的動力學(xué)表達式，但它們之間是相互聯(lián)系的，都是以菌體生長動力學(xué)為基礎(chǔ)的。在分批發(fā)酵中，菌體濃度X、產(chǎn)物濃度P和限制性基質(zhì)濃度S均隨時間t變化，通過數(shù)學(xué)模型建立能更好地了解發(fā)酵過程中三者隨時間的變化，對發(fā)酵過程的改進及發(fā)酵規(guī)模放大有重要的指導(dǎo)意義。

2.2.1 菌體生長模型

細胞生長動力學(xué)最常用方程有Logistic方程[23]和Monod方程[24]，但Monod方程更適合發(fā)酵中底物及菌體濃度對生長無限制作用的發(fā)酵過程擬和, 不宜用Monod方程來描述分批發(fā)酵菌體生長模型。Logistic模型是一個典型的S型曲線，能很好地反映分批發(fā)酵過程中普遍存在的菌體濃度增加對自身生長的抑制作用。因此，研究采用該方程對菌株的生長曲線擬和和動力學(xué)參數(shù)求解。

Logistic 模型方程：

(1)

式中：μm為發(fā)酵過程中菌體最大生長速率；Cx為發(fā)酵過程中菌體濃度(g干重/L)，Cx, max為發(fā)酵過程最大菌體濃度(g干重/L)，當(dāng)發(fā)酵最初時t=0，Cx=Cx,0，經(jīng)積分后方程為：

(2)

利用Origin 8.0軟件非線性方程擬和，輸入上述方程，將實驗測得結(jié)果進行模型擬和，其中C0=0.028 3 (g/L)，Cx,max=7.364 (g/L)。經(jīng)軟件曲線擬和求出μm=0.069 39 h-1，R2=0.998，曲線擬和非常好，能很好描述菌體生長過程，生長動力學(xué)方程及曲線擬和如下。

圖2 菌株細胞生長動力學(xué)曲線擬合
Fig.2 Comparison between predictive values of cell growth model and experimental data

2.2.2 黑色素生成動力學(xué)

微生物的產(chǎn)物形成過程非常復(fù)雜，根據(jù)產(chǎn)物形成與菌體生長關(guān)系將產(chǎn)物形成分成3類：生長偶聯(lián)型、部分偶聯(lián)型、非生長偶聯(lián)型[25]。Luedeking-Piret 方程可較好的描述產(chǎn)物形成與細胞生長的關(guān)系，方程如下：

(3)

將菌體方程1和2代入本方程，進行積分可Cp(t)=αA(t)+βB(t)+Cp, 0，其中A(t)和B(t)為：

A(t)=cx-cx,0=

利用Origin 8.0軟件非線性方程擬和，輸入上述方程，其中Cx,0、Cx,max、μm為已知數(shù)，對實測結(jié)果直接進行擬合，求得α= -0.040 8；β=8.738 4E-4，R2=0.979，擬合曲線可以基本反映黑色素生產(chǎn)動力學(xué)過程，動力學(xué)方程如下：

圖3 黑色素產(chǎn)量動力學(xué)方程擬合曲線
Fig.3 Comparison between predictive values of melanin production model and experimental data

但通過對黑色素實際發(fā)酵動力學(xué)結(jié)果分析，在發(fā)酵過程的前63 h，黑色素產(chǎn)量幾乎始終保持恒值(Cp,0)。隨后黑色素逐漸積累，此時菌體生長處于對數(shù)期中后期，產(chǎn)物生成與菌量應(yīng)符合方程3。因此，嘗試采取分段擬和，即t<63，采取線性擬合；當(dāng)t>63時，采用Cp(t)=αA(t)+βB(t)+Cp, 63方程擬和，求得α=-0.048 7；β=8.768E-4，R2=0.995，較直接擬合準(zhǔn)確度更好，方程如下：

Cp(t)=Cp,0=0.005(t<63)，R2=0.999；

兩者擬和曲線分段數(shù)據(jù)擬合能更好的反映發(fā)酵過程中黑色素產(chǎn)生的絕大部分數(shù)據(jù)，僅對最后產(chǎn)量預(yù)測出現(xiàn)較大誤差，但這一結(jié)果常見于大多數(shù)產(chǎn)物動力學(xué)模型擬合中，其原因可能為后期發(fā)酵出現(xiàn)限制因素，如營養(yǎng)缺乏、產(chǎn)物抑制以及細胞活力下降等因素造成。圖3

2.2.3 基質(zhì)消耗動力學(xué)

在發(fā)酵過程中，基質(zhì)(葡萄糖)主要用于發(fā)酵過程中細胞生長、細胞維持消耗、產(chǎn)物代謝等。作為唯一碳源，同時也是假設(shè)重要限制因素，菌體生長代謝消耗的基質(zhì)可以歸結(jié)在菌體生長消耗之內(nèi)，菌株發(fā)酵過程中的基質(zhì)葡萄糖消耗可簡化為菌體生長消耗和生成黑色素消耗兩部分，其動力學(xué)模型簡化為：

(4)

將式(1)、(3)代入式(4)并積分得：S(t)=S0 -(K1+K2)A(t)-K2B(t)，其中：

A(t)=cx-cx,0=

分別利用直接擬和分段擬合可知，求得直接擬合方程中k1=2.496 3，k2=0.004 3，動力方程為：

間接擬合仍以發(fā)酵63 h為節(jié)點，即t<63時假設(shè)葡萄糖消耗僅為菌體的成長，此時k2=0；當(dāng)t>63，k1、k2均不等于零，分別擬合求解方程如下：

從擬合圖形來看，無論是直接擬和還是分段擬和模型都可以較好地反映發(fā)酵過程中葡萄糖消耗的實際情況，但明顯分段擬和更接近實測值。同時，從黑色素產(chǎn)生動力學(xué)擬和曲線和底物消耗動力學(xué)擬和曲線都可以看出，當(dāng)實驗菌生長121 h 后，即菌體生長進入平穩(wěn)期后，黑色素產(chǎn)生和葡萄糖消耗均呈現(xiàn)線性。進一步對該階段葡萄糖消耗和黑色素生成進行線性擬和分析，結(jié)果顯示，擬和曲線斜率為-0.132，截距為1.664，即在本發(fā)酵中單位殘?zhí)悄苻D(zhuǎn)換0.132 g 黑色素，如計算菌體量及時間因素，菌株最大黑色素生產(chǎn)能力為1.523×10-4g/g葡萄糖·g干菌體·h。圖4，圖5

圖4 底物消耗動力學(xué)方程擬合曲線
Fig.4 Comparison between predictive values of glucose consumption model and experimental data

圖5 底物-黑色素產(chǎn)量擬合曲線
Fig.5 Comparison between predictive values and experimental data about glucose consumption and yield of melanin

3 討 論

出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)作為重要生物材料短梗霉多糖(普魯蘭多糖)的工業(yè)生產(chǎn)菌株，在工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵后期，由于產(chǎn)生的黑色素與短梗霉多糖緊密結(jié)合，極難去除，嚴重影響多糖品質(zhì)且增加發(fā)酵成本，發(fā)酵控制中極力避免黑色素的產(chǎn)生[26]。研究使用一株高產(chǎn)黑色素耐輻射真菌-出芽短梗霉變種MF1，在不需要酪氨酸或精氨酸誘導(dǎo)的情況下，極少產(chǎn)生短梗霉多糖，可大量產(chǎn)生水溶性黑色素[20]。一般黑色素僅溶于堿性溶液，不溶于酸性溶液，微溶于水，不溶于常見有機溶劑[5]，該研究中水溶性黑色素可能因與短梗霉多糖結(jié)合而增加了其水溶性，不僅解決了黑色素應(yīng)用中的溶解性問題，同時拓寬了可溶性黑色素的來源，極具開發(fā)應(yīng)用價值。

微生物發(fā)酵動力學(xué)研究是實現(xiàn)發(fā)酵過程控制和實驗室放大中試的重要前期工作。由于黑色素不是微生物生長、代謝、繁殖所必須的物質(zhì)，屬于次生代謝產(chǎn)物[25]。盡管黑色素產(chǎn)生菌種類很多，但相關(guān)研究多局限于搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化，目前對黑色素的發(fā)酵動力學(xué)知之甚少。研究利用出芽短梗霉變種MF1，對搖瓶分批發(fā)酵產(chǎn)生黑色素的動力學(xué)進行了研究，并確立了分批發(fā)酵動力學(xué)模型，屬于二型發(fā)酵，即產(chǎn)物形成與菌體生長部分偶聯(lián)型。通過對菌株MF1黑色素液體分批發(fā)酵動力學(xué)模型的建立，可以實時定量的對發(fā)酵過程中菌體細胞的生長、底物的消耗和產(chǎn)物的生成變化進行了解。研究首次對分批發(fā)酵過程中黑色素生成和底物消耗的動力學(xué)模型進行直接擬合和分段擬合構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)分段擬和預(yù)測更符合實際情況。通過進一步對發(fā)酵后期的葡萄糖消耗和黑色素生成進行線性擬和，發(fā)現(xiàn)該階段菌體可以看作簡單生化反應(yīng)器。但由于后期菌株代謝活力降低，葡萄糖濃度降低或營養(yǎng)限制等因素影響，導(dǎo)致產(chǎn)量低于預(yù)測，適當(dāng)添加營養(yǎng)或改善限制條件有利于黑色素產(chǎn)量的繼續(xù)提高。

4 結(jié) 論

研究利用 Logistic 方程建立了菌體生長動力學(xué)模型，分別以直接擬合和分段擬合對黑色分批發(fā)酵過程中黑色素生成和底物消耗的動力學(xué)模型進行了構(gòu)建，兩者均能很好的描述發(fā)酵過程，但分段擬和預(yù)測更符合實際情況。在菌體生長進入平穩(wěn)期后，殘?zhí)窍呐c黑色素生成呈線性關(guān)系，即在本發(fā)酵中單位葡萄糖轉(zhuǎn)換率為0.132 g黑色素/g葡萄糖，菌體最大黑色素生產(chǎn)能力為1.523×10-4g/g葡萄糖·g干菌體·h。

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Fermentation Kinetic Model of the Melanin Produced from a Radiation-resistantAureobasidiumpullulans

ZHU Jing1, FANG Shi-jie2, TANG Qi-yong1, ZHANG Li-juan1, WANG Wei1, WANG Bo1,SONG Su-qin1, GU Mei-ying1, ZHANG Zhi-dong1

(1.ResearchInstituteofNuclearandBiotechnologies,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China: 2.ScientificResearchAdministrativeOfficeofXinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830016,China)

【Objective】 In this paper, the melanin produced by the batch fermentation of a radiation-resistantAureobasidiumpullulansMF1 and fermentation kinetics is studied．【Method】Cell growth, melanin production and glucose consumption throughout the melanin fermentation were investigated. The kinetic model was built to describe the cell growth，melanin production and glucose consumption based on Logistic equation and Luedeking-Piret equation．And the predictive values of models were compared with the experimental data. 【Result】Results showed that kinetic properties in the production process of melanin by batch fermentation．The calculated result of model fit well with the experimental data. And calculated maximum melanin production of cell was 1.523×10-4g/gglucose·gdry cell·h. 【Conclusion】The kinetic model laid foundation for the pilot scale, large-scale production of water-soluble natural melanin in the future.

melanin;Aureobasidiumpullulans; fermentation kinetic; mathematical model

ZHANG Zhi-dong(1977- ), male, native place: Shi He Zi, Xinjiang. Professor, research field: Special environmental microbiology, (E-mail)zhangzheedong@sohu.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.06.020

2016-12-01

新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展計劃“天然黑色素高產(chǎn)菌發(fā)酵工藝及其在生物農(nóng)藥中的應(yīng)用研究”(201511105)

朱靜(1981-)，女，碩士，副研究員，研究方向為特殊環(huán)境微生物學(xué)，(E-mail)122543537@qq.com

張志東(1977-)，男，碩士，研究員，研究方向為特殊環(huán)境微生物學(xué)，(E-mail)zhangzheedong@sohu.com

S188

A

1001-4330(2017)06-1122-08

Supported by: Xinjiang High Technology Research and Development Program (Grant No. 201511105)