馬盾，王奉斌，吳強(qiáng)，張燕紅，袁杰，海里且木，趙志強(qiáng)，曹偉

(1.新疆農(nóng)科院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091；2.烏魯木齊市米東區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，烏魯木齊 831400)

新疆水稻穗腐病病原菌種類(lèi)鑒定及防控研究

馬盾1，王奉斌1，吳強(qiáng)2，張燕紅1，袁杰1，海里且木1，趙志強(qiáng)1，曹偉2

(1.新疆農(nóng)科院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091；2.烏魯木齊市米東區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，烏魯木齊 831400)

【目的】稻穗腐病 (Rice spikelet rot disease), 有稱(chēng)穎枯病、谷枯病、黑穗病、穗褐變病、褐變穗等，是由鐮刀菌(Fusariumproliferatum)為主的多種真菌引起的穗期病害。在新疆水稻四大主產(chǎn)區(qū)時(shí)有發(fā)生，發(fā)病率在5%～20%。研究新疆水稻穗腐病發(fā)生規(guī)律、為害特點(diǎn)等，為有針對(duì)性的防治該病提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎捎每共∑贩N、調(diào)整抽穗期、藥劑防控等措施，可有效地控制該病的發(fā)生為害。【結(jié)果】經(jīng)鑒定該病的侵染源主要為層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)，次要為新月彎孢菌(Curvularialunata)和細(xì)交鏈孢菌(Alternariatenuis)?！窘Y(jié)論】防治該病的最佳方案是種植抗病品種，防治上在水稻始穗前5～7 d，采用50%米鮮.稻瘟靈可濕性粉劑(1 500倍液)和25%米酰胺乳油(1 600倍液)等藥劑葉面噴霧防治，可有效預(yù)防該病的發(fā)生。

穗腐??；病原菌鑒定；防控

0 引 言

【研究意義】由于氣候、耕作制度變化，施肥量(特別是氮肥)增加、品種更替等，近年來(lái)，新疆水稻穗腐病發(fā)生頻繁，危害加重。水稻感染穗腐病后不但影響產(chǎn)量，還由于病原菌有色、產(chǎn)生毒素而改變稻谷外觀(guān)，降低稻米品質(zhì)，影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)食用的人、畜禽健康、安全造成危害[1,2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者多認(rèn)為水稻穗腐病主要侵染源有鐮刀菌屬 (Fusariumsp.) 、彎孢菌屬 (Curvulariasp.)、鏈格孢菌屬 (Alternariasp.)及蠕孢菌屬(Bipolarissp.) 等菌屬，引起的原因復(fù)雜，初侵染源尚無(wú)統(tǒng)一定論，國(guó)內(nèi)由于水稻穗部病害及侵染的致病菌較多，名稱(chēng)多而易混亂，近10年中國(guó)水稻所黃世文等對(duì)該病病原菌的生物學(xué)特性及種類(lèi)鑒定、防治等進(jìn)行了研究，統(tǒng)一將水稻穗部由鐮刀菌屬、彎孢菌屬、鏈格孢菌屬及蠕孢菌屬等真菌致病菌引起的病害稱(chēng)作水稻穗腐病[3-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)，隨著高產(chǎn)密植、品種更新、施肥量增加等因素，新疆主要稻區(qū)穗腐病逐漸增多，影響到了稻米的產(chǎn)量及品質(zhì)，通過(guò)稻田病谷粒采樣，利用分子鑒定技術(shù)，確定新疆水稻穗腐病病原菌種類(lèi)，采取相應(yīng)的防控技術(shù)，進(jìn)行預(yù)防和控制?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】該病是由多種真菌引起的病害，鑒定新疆稻區(qū)穗腐病病原菌種群，優(yōu)勢(shì)致病菌種類(lèi)，研究新疆穗腐病發(fā)生規(guī)律、為害特點(diǎn)等，進(jìn)行有效地、針對(duì)性預(yù)防。

1 材料與方法

1.1 材 料

穗腐病病株穗部樣品的采集，2015～2016年9～10月水稻成熟期，在發(fā)病的水稻穗部采集帶有病斑的谷粒；烏魯木齊市米東區(qū)水稻種植區(qū)11個(gè)水稻主栽品種，采集穗部樣品36份，病米粒樣品1份，伊犁州察布查爾縣周?chē)稗r(nóng)科院水稻試驗(yàn)站在19個(gè)品種上，采集穗部樣品19份，阿克蘇地區(qū)溫宿縣農(nóng)科院試驗(yàn)站水稻試驗(yàn)田，采集穗部樣品35份，病米粒3份，分2次寄送中國(guó)水稻所水稻病害研究室，進(jìn)行病原菌分類(lèi)鑒定。

水稻穗腐病防控藥劑，2015～2016年分別使用13%春雷.三環(huán)唑可濕性粉劑(上海悅聯(lián)化工有限公司)，50%米鮮.稻瘟靈可濕性粉劑(浙江溫州市仰義沿江工業(yè)區(qū))，25%米酰胺乳油(廣西南寧綠豐化工有限公司)，20%春雷霉素.稻瘟凈粉劑(成都化夏化學(xué)試劑有限公司)，80%代森錳鋅可濕性粉劑(河北雙吉化工有限公司)，分別于破口前(7月23日)、抽穗揚(yáng)花期(8月3日)各施藥1次，均用水稀釋1 500～1 600倍液，使用微量機(jī)動(dòng)噴霧器穗部噴霧。

1.2 方 法

1.2.1 穗腐病病原菌種類(lèi)鑒定1.2.1.1 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：蔗糖 30 g、硝酸鈉2 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸鐵0.01 g、磷酸氫二鉀1 g、氯化鉀0.5 g、瓊脂13 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2.1.2 病原菌的分離及純化

按常規(guī)組織塊分離法分離病原菌，待菌落形成后，進(jìn)行初次鏡檢和鑒定，單孢分離法從菌落上挑取孢子或切取菌絲，移到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得純化菌株，保存在冰箱備用。

分別從烏魯木齊市米東區(qū)、伊犁州察布查爾縣、阿克蘇地區(qū)溫宿縣，水稻發(fā)病穗部獲得的帶有病斑谷粒，進(jìn)行分離、純化均得到3種形態(tài)特征不同的菌株，分別記錄為 XJ1、XJ2、和XJ3。由于新疆水稻種植主要是粳稻，只對(duì)主要感病樣本粳稻上分離的菌進(jìn)行生物學(xué)特性和分子鑒定。

1.2.1.3 菌株的形態(tài)特征觀(guān)察

將菌株移植于PDA板上，恒溫培養(yǎng)7 d后，觀(guān)察菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形態(tài)、色澤、質(zhì)地等性狀。用0.05%吐溫20液洗落孢子，取分生孢子懸浮液滴在玻片上，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察分生孢子梗和分生孢子的細(xì)微形態(tài)。

1.2.1.4 菌株的分子鑒定

用CTAB法提取菌株菌絲體總DNA。使用引物ITS1和ITS2進(jìn)行ITS片段的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物回收后純化用pGEM-T-Easy載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)DH5a菌株上，進(jìn)行分子測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果再進(jìn)行比對(duì)分析，選擇相似性較高的菌株序列與供試的菌株序列，進(jìn)行多序列比對(duì)，進(jìn)行同源性比較，最終確定菌株(病原菌)種類(lèi)。

1.2.2 防治藥劑試驗(yàn)

2016年在烏魯木齊市米東區(qū)羊毛工鎮(zhèn)新建村水稻展示區(qū)進(jìn)行，試驗(yàn)品種為新稻11號(hào)(米東區(qū)主栽品種)、豐優(yōu)516、新稻47號(hào)，小區(qū)面積約200 m2，每處理重復(fù)2次，按順序排列，小區(qū)間田埂相隔，正常管理，試驗(yàn)區(qū)內(nèi)不施用其他殺菌劑。于水稻破口前5 d施藥1次。配藥時(shí)，先用少量清水將藥劑充分稀釋?zhuān)笤偌尤脒m量清水，采用機(jī)動(dòng)微量噴霧器(東方紅360型)，在水稻植株穗部，進(jìn)行不同藥劑噴霧防治試驗(yàn)，噴清水作空白對(duì)照。每小區(qū)按3點(diǎn)取樣法調(diào)查，每點(diǎn)調(diào)查100穗，統(tǒng)計(jì)發(fā)病穗數(shù)、每穗發(fā)病谷粒數(shù)，計(jì)算發(fā)病率和防治效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。采用新復(fù)極差法,用于供試的幾種藥劑對(duì)穗腐病防治效果的各個(gè)藥劑之間的顯著性分析、即試驗(yàn)結(jié)果的兩兩比較，計(jì)算供試藥劑對(duì)穗腐病的防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株 XJ1的鑒定

菌株XJ1在PDA上菌絲生長(zhǎng)旺盛，開(kāi)始為白色、逐漸變?yōu)榉奂t色、氣生菌絲(空間)發(fā)達(dá)、似棉絮狀?？僧a(chǎn)生大、小兩型分生孢子。但大型分生孢子較少、鐮刀型或紡錘型、有彎曲、其間約有3～9個(gè)不等的隔膜、一端細(xì)胞較長(zhǎng)、另一端有足孢，大小20.6～49.0 μm×2.3～4.9 μm。而小型分生孢子量大、長(zhǎng)卵形、梨形或腎形，無(wú)色透明、生長(zhǎng)快、一端尖細(xì)、另一端鈍園；基胞明顯、約有2～4 個(gè)隔膜，大小16.5～26.4 μm×3.3～4.9 μm。

采用PCR技術(shù)擴(kuò)增XJ1的ITS基因序列，對(duì)其進(jìn)行克隆和測(cè)序。用BLAST比較菌株XJ1的ITS與Genbank中已登錄的序列，查找與菌株XJ1的ITS同源菌株序列，鑒定出該菌株為：層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)是穗腐病的致病菌，屬于半知菌亞門(mén)(Deuteromycotina)、絲孢綱 (Hyphomycetes)、瘤座菌目(Tuberculariales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、鐮孢屬(Fusarium)[11]。

2.2 菌株XJ2的鑒定

菌株XJ3在PDA培養(yǎng)基上,菌落表現(xiàn)為褐色、短絨緊湊狀、有膠狀分泌物、平展圓形、周邊齊整。菌絲淺褐色或無(wú)色、多分枝、具有隔膜、寬 1.5～3.8 μm。分生孢子梗簇生或單生、分枝直或彎曲。分生孢子為單生卵形或紡錘形，由4個(gè)細(xì)胞組成，從下部向上數(shù)第3個(gè)細(xì)胞較大，色深，其他細(xì)胞顏色較淺，大小 17.5～33.0 μm×8.6～17.7 μm。

采用PCR技術(shù)擴(kuò)增XJ2的ITS基因序列，對(duì)其進(jìn)行克隆和測(cè)序，將菌株的rDNAITS序列與Genbank 中已有的DNA序列進(jìn)行同源性比較，將XJ2菌株鑒定為：新月彎孢菌(Curvularialunata)為穗腐病的致病菌，屬于半知菌亞門(mén)(Deuteromycotina)、絲孢綱(Hyphomycetes)、絲孢目(Hyphomycetales)、暗色孢科(Dematiaceae)、彎孢霉屬(Curvularia)[11]。

2.3 菌株XJ3的鑒定

菌株在 PDA 培養(yǎng)基上，菌落表現(xiàn)為絮狀平展、正面灰褐色、背面褐色。菌絲體潛生、菌絲淺褐色、具有隔膜、多分枝、寬 1.8.0～3.0 μm。分生孢子梗單生或簇生、淺褐色、直立、有隔。分生孢子鏈生或單生、倒梨形、淡褐色、橫隔有2～8個(gè)、具有縱、斜隔2～5個(gè)、分隔處有縊縮。分生孢子大小21.0～57.0 μm×9.0～16.5 μm，分生孢子啄大小 0.9～52.0 μm×1.5～5.5 μm。

對(duì)XJ3的ITS基因序列進(jìn)行克隆和測(cè)序。將菌株的rDNAITS序列與Genbank中已有的DNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，將XJ3菌株鑒定為：細(xì)交鏈孢菌(Alternariatenuis)為穗腐病的致病菌，屬于半知菌亞門(mén)(Deuteromycotina)、絲孢綱(Hyphomycetes)、絲孢目(Hyphomycetales)、暗色孢科(Dematiaceae)、鏈格孢屬(Alternaria)[11,12]。

2.4 根據(jù)對(duì)新疆主要水稻種植區(qū)穗腐病谷粒及米粒病菌培養(yǎng)，菌株檢出量較大的為層出鐮刀菌，約占63.6%，新月彎孢菌占21.2%，細(xì)交鏈孢菌7.8%，另外一些種類(lèi)的菌株檢出量均不到1%，據(jù)此，在新疆水稻主要種植區(qū)，引起水稻穗腐病的主要致病菌為層出鐮刀菌，次要致病菌為新月彎孢菌和細(xì)交鏈孢菌。

2.5 田間藥劑試驗(yàn)

針對(duì)水稻穗腐病的發(fā)生特點(diǎn)、致病機(jī)理以及可預(yù)防程度，分別使用5種藥劑(13%春雷.三環(huán)唑可濕性粉劑、50%米鮮.稻瘟靈可濕性粉劑、25%米酰胺乳油 、20% 春雷霉素.稻瘟凈粉劑、80%代森錳鋅可濕性粉劑)進(jìn)行稻田穗腐病預(yù)防防治小區(qū)試驗(yàn)對(duì)比，9月中旬，水稻黃熟期,穗腐病發(fā)生癥狀定型，開(kāi)始系統(tǒng)調(diào)查，條件計(jì)算供試藥劑對(duì)穗腐病的防治效果。結(jié)果表明，第一次(抽穗前)對(duì)穗腐病的防治效果均好于第二次(抽穗揚(yáng)花期)，發(fā)病率顯著降低，其中，50%米鮮.稻瘟靈可濕性粉劑和25%米酰胺乳油，對(duì)水稻穗腐病的防治效果較好，分別達(dá)到68.54%和67.38%，13%春雷.三環(huán)唑可濕性粉劑和20%春雷霉素.稻瘟凈粉劑也具有一定預(yù)防效果。表1

表1 稻田藥劑處理對(duì)水稻穗腐病的防治效果
Table 1 Control effect of different fungicides on ricespikelet let rot disease in the fields

殺菌劑Fungicide發(fā)病率/%Diseaseincidence平均防效/%Conteoleffect50%米鮮.稻瘟靈WP 50%Prochloraz.IsoprothiolaneWP15.24±0.0168.54aA13%春雷.三環(huán)唑WP 13%kasugamycin.TricyclazoleWP24.13±0.0152.66cC80%代森錳鋅WP 80%mancozebWP25.88±0.0250.23cC20%春雷霉素.稻瘟凈WP 20%kasugamycin.kitazineWP20.38±0.0254.71bB25%米酰胺EC 25%ProchlorazEC16.36±0.0167.38aA清水CK WaterCK53.41±0.070.00dD

注：同一數(shù)字后小寫(xiě)、大寫(xiě)字母表示在P<0.05和P<0.01水平下的差異顯著性

Ante： Valuues in the same column with different small and capital letters are significantly different atP<0.05 andP<0.01 by DMRT,respectively

3 討 論

從新疆主要水稻種植區(qū)穗腐病谷粒和米粒上分離出的主要3個(gè)菌株，與國(guó)內(nèi)相關(guān)稻田穗腐病的研究報(bào)道基本吻合，表現(xiàn)為層出鐮刀菌占比例較大，為主要(優(yōu)勢(shì))水稻穗腐病致病菌，另外，新月彎孢菌和細(xì)交鏈孢菌也占有一定比例，也認(rèn)定為水稻穗腐病的致病菌，但這3種致病菌之間的關(guān)系是互作關(guān)系，還是以層出鐮刀菌為主要侵染致病菌，其他為輔助侵染致病菌，還需要進(jìn)一步研究分析。根據(jù)目前的研究進(jìn)展以及對(duì)相關(guān)知識(shí)的認(rèn)識(shí)，與水稻穗腐病病因相關(guān)的這些致病菌，既有互作關(guān)系，又有從屬(主次)關(guān)系[1]。

對(duì)于新疆水稻穗腐病的發(fā)生情況，2015～16年9～10月的稻田病害調(diào)查：烏魯木齊市米東區(qū)平均發(fā)病率16.35%，溫宿縣平均發(fā)病率達(dá)到16.3%，和田地區(qū)墨玉縣平均發(fā)病率7.7%，伊犁州察布查爾縣平均發(fā)病率13.8%，以烏魯木齊市米東區(qū)、溫宿縣發(fā)生較重，由于引起穗腐病的致病菌均為弱腐菌，水稻發(fā)生穗腐病的條件與水稻品種是否感病、水稻生長(zhǎng)環(huán)境、抽穗期空氣濕度(有降雨)、施氮肥量的較多、田間管理技術(shù)(水層較深)等有密切地關(guān)系。

稻田穗腐病的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，烏魯木齊市米東區(qū)稻田穗腐病的發(fā)生呈2種明顯不同的表現(xiàn)形式；一種是穗部個(gè)別稻粒上有少量、較小的病斑，病斑淡褐色-褐色，稻田零零散散，較為普遍，為米東區(qū)穗腐病主要發(fā)生形式，另一種是在大田中，僅有極個(gè)別穗部有病斑，與第一種不同的是；病穗整個(gè)穗上幾乎所有稻粒殼上有病斑，病斑較大，褐色(色較重)，整個(gè)病穗呈現(xiàn)出褐色，在稻田中3～5病穗集中在一起，明顯易于發(fā)現(xiàn)。這與穗腐病致病菌種類(lèi)較多是否有關(guān)有待研究[13,14]。

4 結(jié) 論

根據(jù)新疆稻田穗腐病谷粒致病菌的鑒定結(jié)果，確定新疆水稻主產(chǎn)區(qū)水稻穗腐病主要致病菌為層出鐮刀菌，次要致病菌為新月彎孢菌和細(xì)交鏈孢菌。

根據(jù)水稻品種對(duì)穗腐病抗性調(diào)查，種植抗穗腐病水稻品種，可以減輕95%以上的發(fā)生為害，解決水稻生產(chǎn)上病粒、黑斑米粒等影響水稻加工品質(zhì)的問(wèn)題。

一般年份，新疆水稻產(chǎn)區(qū)穗腐病發(fā)生水平較低(發(fā)病率在15%以下)，不需要進(jìn)行藥劑預(yù)防，遇水稻孕穗期降雨量超過(guò)20 mL以上的年份、抽穗期水層超過(guò)5 cm以上的稻田、施穗肥5 kg以上的老稻田等，對(duì)于感病品種或預(yù)報(bào)發(fā)病率達(dá)到15%以上時(shí)，可在水稻始穗前5～7 d,采用50%米鮮.稻瘟靈可濕性粉劑(1 500倍液)和25%米酰胺乳油(1 600倍液)等藥劑葉面噴霧防治，如遇降雨一定要補(bǔ)打1次，達(dá)到預(yù)防和控制該病的目的。

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Studies on Identification and Control of Rice Spikelet Rot Disease (RSRD) Pathogens Species in Xinjiang

MA Dun1,WANG Feng-bin1,WU Qiang2, ZHANG Yan-hong1, YUAN Jie1,Hailiqiemu1, ZHAO Zhi-qiang1, CAO Wei2

(1.InstituteofNuclearandBiologicalTechnologies,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China； 2.AgriculturalTechnologyExtensionCenterofMidongDistrict,Urumqi831400,China)

【Objective】 Rice spikelet rot disease (RSRD), in the past, also known as glume blight, valley blight, smut, rice spike brown rot disease, brown panicle and so on, is a spike period disease that is caused by a variety of fungi dominated byFusariumproliferatum. Sometimes it happens in the four major rice producing zones in Xinjiang and the incidence rate is generally in the range of 5% to 20% .【Method】The occurrence and damage of the disease was effectively controlled by using resistant varieties, adjusting heading date, and preventing and curing agents.【Result】The main infection source of this disease was identified as Fusariumtenuis. In addition, the secondary infection source of this disease was identified as Curvularialunata and Alternariatenuis.【Conclusion】The best solution to prevention and control the disease is to plant resistant cultivars. Using wet
Table powder of 50% prochlorazisoprothiolane (1,500 times liquid) and missible oil of 25% prochloraz (1,600 times liquid) as well as other insecticides to prevent and control during 5-7 days before rice heading date by foliar spraying, can significantly reduce the occurrence of this disease.

rice spikelet rot disease; pathogen identification; prevention and control

ZHANG Yan-hong (1982- ), female, native place:Ganshu. assistant research fellow, research field: Rice breeding，(E-mail)zhangyanhong9527@163.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.06.016

2017-02-08

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目計(jì)劃項(xiàng)目“水稻穗腐病發(fā)生規(guī)律及綜合防控技術(shù)研究”(2016E02017)

馬盾(1960-)，男，研究員，碩士，研究方向?yàn)樗静∠x(chóng)害，(E-mail)madun627@163.com

張燕紅(1982-)，女，甘肅武威人，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)樗居N等，(E-mail)zhangyanhong9527@163.com

S432

A

1001-4330(2017)06-1093-06

Supported by: Science and Technology Supporting Xinjiang Program "Studies on Identification and Control of Rice Spikelet Rot Disease (RSRD)"(2016E02017)