林啟存，朱麗敏，沈小紅，蔡麗娟，戴瑜來，馮曉宇

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院 水產(chǎn)研究所，浙江 杭州 310024； 2.杭州市市區(qū)河道監(jiān)管中心，浙江 杭州 310006)

一株光合細菌的分離與鑒定

林啟存1，朱麗敏1，沈小紅2，蔡麗娟1，戴瑜來1，馮曉宇1

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院 水產(chǎn)研究所，浙江 杭州 310024； 2.杭州市市區(qū)河道監(jiān)管中心，浙江 杭州 310006)

通過富集、純化等方法，從杭州甲魚養(yǎng)殖水體中分離到一株光合細菌(PSB-1)，經(jīng)形態(tài)學觀察，生理生化特性和16SrRNA基因序列分析，初步確定分離株菌PSB-1為沙氏外硫紅螺菌。

養(yǎng)殖水體； 光合細菌； 生理生化； 16SrRNA基因

光合細菌(photosynthetic bacteria，簡稱PSB)是一類以光作為能源，能在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用自然界中的有機物、硫化物、氨等作為供氫體兼碳源進行光合作用的微生物，具有固氮、固碳、降解亞硝酸鹽、脫氫、氧化硫化物等不同種生理生化功能，在自然界的碳、氮、硫循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[1]。

光合細菌用于養(yǎng)殖水處理已非常普遍，且使用方式以全池潑灑菌制劑為主。菌種是微生態(tài)制劑處理水質(zhì)的核心關鍵，由于光合細菌種類多、生理功能多樣，加上不同菌株對水體的適應能力或?qū)ξ鬯奶幚砟芰Υ嬖谳^大差異[2]，因此從天然水體中挖掘高活性菌株仍是當前光合細菌的重要研究方向[3-5]。

本研究從甲魚養(yǎng)殖水體富集分離篩選出一株光合細菌，對其進行形態(tài)學、生理生化和16SrRNA基因序列分析，為該菌株的進一步應用研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 富集用樣品

富集用水樣采自杭州市西湖區(qū)雙浦鎮(zhèn)某外塘甲魚養(yǎng)殖場。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基。CH3COONa 2 g·L-1+CH3CH2COONa 0.2 g·L-1+NaCl 0.5 g·L-1+NH4Cl 1 g·L-1+MgCl20.1 g·L-1+NaHCO31 g·L-1+K2HPO40.1 g·L-1+CaCl20.01 g·L-1+酵母膏0.05 g·L-1+C2H5OH 0.1 mL·L-1，用磷酸液將pH值調(diào)至7.0。

分離純化培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基中加入15 g·L-1的瓊脂制成固體培養(yǎng)基分裝于培養(yǎng)皿中。

1.2 富集與分離

取濾網(wǎng)除雜的水樣1 mL于18 mm×180 mm試管中，加經(jīng)滅菌處理的富集培養(yǎng)基至15 mL，混勻，倒入滅菌液狀石蠟封口，并塞上橡膠塞，置(30±1)℃、2 000 lx左右恒溫光照培養(yǎng)箱中2～3周。待液體培養(yǎng)物呈紅色或紅棕色時，吸取1 mL培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接至另一裝有新鮮培養(yǎng)液的試管中，重復上述操作4～5次，使目標菌占優(yōu)勢生長。

采用平板劃線法在經(jīng)滅菌處理的光合細菌純化培養(yǎng)基上接種細菌。將接種后的培養(yǎng)皿放入裝有厭氧產(chǎn)氣袋的透明培養(yǎng)袋中，密封袋口后倒置培養(yǎng)5～7 d，溫度控制在(30±1)℃、光照強度在2 000 lx左右。待菌落生長起來，挑選紅色或紅棕色單菌落反復操作2～3次，直至獲得較純的單菌落。

1.3 分離菌株的擴培與初篩選

用無菌蒸餾水浸洗純化的菌落，取1 mL菌洗液加到裝有液體培養(yǎng)基18 mm×180 mm試管中，參照富集方法培養(yǎng)至深色，然后取培養(yǎng)液以體積比1∶4的比例接種到裝有富集培養(yǎng)基的250 mL塑料瓶中，密封瓶口，并置恒溫光照下培養(yǎng)7～10 d，至顏色呈深色、D660≥1.5備用。

取培養(yǎng)液接種處理魚塘水樣，分別測定水樣處理前后的COD值、銨氮、亞硝酸鹽氮和總氮，計算其去除率，比較處理效果，篩選凈化效果相對好的菌株。

COD采用重鉻酸鉀分光光度法測定；銨氮采用納氏試劑分光光度法測定；亞硝酸氮采N-1-萘基-乙二胺光度法測定；硝酸氮采用酚二磺酸紫外分光光度法測定；總氮采用過硫酸鉀氧化紫外分光光度法測定。

1.4 分離菌株的鑒定

1.4.1 菌體形態(tài)觀察

對分離的菌體在載玻片上涂片和革蘭氏染色處理，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.4.2 分離菌株生理生化特性分析

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》文獻[6]對分離菌株進行生理生化特性鑒定，包括接觸酶、氫化酶、明膠液化、乙酸鈉、丙酸鈉、乳酸鈉、硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、乙醇、甘油、苯甲酸鈉等試驗。

1.4.3 16SrDNA序列分析

采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(SK8255)提取該菌株的基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用細菌通用引物對(正向引物fD1：5′-cagagtttgatcctggct-3′，反向引物rp2：5′-aggaggtgatccagccgca-3′)進行16SrDNA PCR擴增。PCR擴增反應體系：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，模板DNA 0.5 μL，引物各0.5 μL，Taq酶0.2 μL，加雙蒸水至25 μL。擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃ 4復性5 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃修復延伸10 min，4 ℃終止反應。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測，交由上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。測序結(jié)果在NCBI上blast比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 光合細菌的富集分離

經(jīng)4次富集和2次純化分離，從水樣中得到菌落形態(tài)相似(濕潤圓形略隆起、邊緣整齊、有光澤)，但顏色、大小不相同的2株細菌(編號為PSB-1、PSB-2)，PSB-1菌落為紅色、直徑0.5～2.0 mm，PSB-2菌落為淡紅色、直徑0.2～1.0 mm。

2.2 分離菌株的初篩選

以PSB-1、PSB-2為菌株進行液體擴大培養(yǎng)，按30%的比例接種母液，培養(yǎng)7～10 d，培養(yǎng)條件同上，至顏色呈深色。取菌液接種處理魚塘水樣，分別測定水樣處理前后的COD值、銨氮、亞硝酸鹽氮和總氮，計算其去除率，比較處理效果，篩選凈化效果好的菌株。

以截去瓶口的5 L塑料油瓶為試驗容器，每瓶取魚塘水3 kg，初始水樣COD、總氮、銨氮、亞硝酸氮分別為61.00、4.83、1.46、0.43 mg·L-1。于25～30 ℃環(huán)境溫度條件下，試驗組每瓶放PSB-1或PSB-2菌液，對照組不放任何菌液，試驗周期5 d。試驗末取各組水樣測定水質(zhì)，其結(jié)果及去除率見表1。

表1 2種菌株培養(yǎng)液對養(yǎng)殖水質(zhì)的影響

從表1中可看出，PSB-1菌液對水樣COD、總氮、銨氮、亞硝酸氮的去除效果均比PSB-2菌液好，因此選PSB-1為對象進行下一步研究。

2.3 光合細菌菌株PSB-1鑒定

2.3.1 菌株PSB-1的菌體形態(tài)觀察

經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢結(jié)果顯示，菌株PSB-1呈陰性短桿菌，菌體大小為(1.6～2.0)μm×(0.8～0.9) μm。

2.3.2 生理生化特性

由表2可看出，分離菌株接觸酶試驗、氫化酶試驗為陽性；明膠液化試驗為陰性；可利用乙酸鈉、丙酸鈉、乳酸鈉、硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、乙醇、甘油，不能利用苯甲酸鈉、酒石酸鉀鈉。

2.3.3 分離菌株16SrRNA基因序列分析

分離菌株擴增出的 16SrDNA片段條帶單一，測序后得到長度為1486 bp16SrRNA基因序列：

表2 分離菌株PSB-1的生理生化特性

注：+表示利用，-表示不利用。

GTTACGACTTCACCCCAGTCATTGACCACACCGTGG TGAACGTCCTCCCGAAGGTTAGACTATCCACTTCTG GTGCAGCCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTG TACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGC TGATCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAG TCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACCAGC TTTTTGGGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACC CACTGTACTGGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTG CCCATAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCA CCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCCTAGAG TTCCCACCCAAAGTGTTGGCAACTAGGGACAAGGG TTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCAC GACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCA CTCGGTTCCCGAAGGCACTCCCACATCTCTGCAGG ATTCCGAGGATGTCAAGGGCAGGTAAGGTTCTTCG CGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTT GTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACC TTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGAACTTAACG CGTTTGCTGCGCCACTAAGAGGTTAAACCCTCCCA ACGGCTAGTTCTCATCGTTTACGGCGTGGACTACC AGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCG CAC-TCAGTGTCAGTTTTAGTCCAGAGAGTCGCTT TCGCCACTGGTGTTCCTTCCGATATCTACGCATTTC ACCGCTACACCGGAAATTCCACTCTCCTCTACCAAA CTCTAGCCATGCAGTATCAGATGCAGTTCCCAGGTT GAGCCCAGGGCTTTCACATCTGACTGACATCACCAC CTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACG CTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACG GAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGTGGGTAACGTCAA GTCAGGCACGTATTAGGCACCCGCTTTTCCTCCCC ACTGAAAGTGCTTTACAACCCGCAGGCCTTCTTCAC ACACGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATT GTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT CTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCA TCCTCTCAGACCAGCTACCGATCGTCGCCTTGGT GGGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATCGGACGC AGGCTCATCTGATAGCGCGAGGTCCGAAGAGCC CCCGCTTTCCCCCTTAGGGCGTATGCGGTATTAG CCCGAGTTTCCCCGGGTTGTCCCCCACTACCAGG CAGATTCCTACGCGTTACTCACCCGTCCGCCACTC GTCAGCGCCCGAAGGCCTGTTACCGTTCGACTTG CATGTGTTAAGCATGCCGCCAGCGTTCAATCTGA GCCAGGATCAA。序列對比的結(jié)果表明，所分離的PSB-1菌株與GenBank中Ectothiorhodospirasp.的相似性水平達99%，結(jié)合本試驗2.3.1、2.3.2的結(jié)果與伯杰細菌鑒定手冊(第八版)沙氏外硫紅螺菌形態(tài)、大小、生理生化特性基本相符，可初步確定分離菌株為沙氏外硫紅螺菌。

3 小結(jié)

試驗從甲魚養(yǎng)殖水體中富集篩選得到一株光合細菌，編號為PSB-1。根據(jù)菌株的形態(tài)學特征、生理生化特性及16SrRNA基因序列比對結(jié)果，初步確定該菌株為沙氏外硫紅螺菌。

沙氏外硫紅螺菌是一種以硫化物、分子氫、有機酸鹽等作為光合電子供體且能利用銨鹽的光能自養(yǎng)菌，本試驗條件下，分離菌株培養(yǎng)液對COD、總氮、銨氮、亞硝酸氮去除率分別達到57.38%、45.34%、48.63%和27.91%，顯示分離菌株在水質(zhì)凈化方面有較好的應用前景。

[1] 武廣，張超峰，呂軍，等. 光合細菌在對蝦養(yǎng)殖中的應用[J]. 中國水產(chǎn)，2006(10)：74-77.

[2] 徐姍楠，邱宏端，林娟，等. 紫色非硫光合細菌的分離鑒定及其功能研究[J]. 福州大學學報(自然科學版)，2004，32(2)：246-251.

[3] 林燕玲，劉杰鳳，周天，等. 一株紫色非硫光合細菌的分離鑒定和培養(yǎng)特性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2015，43(17)：5-8.

[4] 朱文優(yōu)，周守敘，郭春曉，等. 光合細菌的分離鑒定及其對廢水凈化效果研究[J]. 成都大學學報(自然科學版)，2014，33(2)：121-124.

[5] 鄧紅梅，馮霞，駕玉龍，等. 高活性光合細菌的分離純化培養(yǎng)及水處理應用研究[J]. 食品與發(fā)酵科技，2013，49(2)：17-19，58.

[6] 東秀珠，蔡妙英．常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]．北京：科學出版社，2001.

(責任編輯：張瑞麟)

2017-03-08

浙江省重點科技創(chuàng)新團隊計劃(2011R50029)；國家大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-46)

林啟存(1976—)，浙江金華人，高級工程師，碩士，從事水生動物病害防治與水域生態(tài)改良技術研究工作，E-mail：lqcun@sina.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170845

S917

A

0528-9017(2017)08-1444-03

文獻著錄格式：林啟存，朱麗敏，沈小紅，等. 一株光合細菌的分離與鑒定[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2017，58(8)：1444-1446.