魏盼盼，陸躍樂(lè)，陳小龍

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

手性拆分2-溴丙酸甲酯的菌株篩選及優(yōu)化

魏盼盼，陸躍樂(lè)，陳小龍*

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

2-溴丙酸甲酯是一種重要的農(nóng)藥中間體，其光學(xué)純構(gòu)型可用于多種手性農(nóng)藥的合成。該研究從自然界篩選出可以選擇性水解拆分2-溴丙酸甲酯的菌株，并對(duì)此菌株進(jìn)行菌種鑒定和發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，最終通過(guò)全細(xì)胞催化獲得R-2-溴丙酸甲酯。經(jīng)鑒定，該S-型水解酶菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，對(duì)映體過(guò)量值達(dá)85%以上。經(jīng)單因素和正交試驗(yàn)分析，確定該菌株最佳培養(yǎng)基成分為麥芽糖20 g·L-1，蛋白胨30 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，玉米油10 mL·L-1。最終脂肪酶活性為優(yōu)化前的1.64倍，該方法可為多種手性農(nóng)藥單一對(duì)映異構(gòu)體的合成提供初始光學(xué)純?cè)?，從而降低生產(chǎn)成本，并利于農(nóng)藥減量使用。

手性農(nóng)藥；R-2-溴丙酸甲酯； 不對(duì)稱水解； 生物催化

苯氧羧酸類除草劑是一類最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的手性除草劑，如精噁唑禾草靈等，此類除草劑具備毒性低、活性高、安全等一系列優(yōu)點(diǎn)[1-2]。在如今的農(nóng)藥市場(chǎng)上，高純度異構(gòu)體作為除草劑其市場(chǎng)占有率超過(guò)50%[3]，此類除草劑的R構(gòu)型活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于S構(gòu)型活性[4]。單一使用R型苯氧羧酸類除草劑不僅可以節(jié)約成本，減少資源使用，也可以降低對(duì)環(huán)境造成的傷害。而現(xiàn)今農(nóng)藥市場(chǎng)上單一構(gòu)型苯氧羧酸類除草劑，價(jià)格較為昂貴，若能高效廉價(jià)獲得R型苯氧羧酸類除草劑將會(huì)推進(jìn)除草劑行業(yè)迅猛發(fā)展。獲得單一構(gòu)型苯氧羧酸類除草劑主要是通過(guò)2個(gè)途徑：提高R-對(duì)羥基苯氧基乳酸/酯的合成效率和增加鹵代2-丙酸/酯的光學(xué)純度[5]。

2-溴丙酸甲酯，在有機(jī)化學(xué)中屬于合成原料，并且是苯氧羧酸類除草劑禾草靈、吡氟禾草靈、禾草克等一系列除草劑的重要中間體。目前，獲得單一構(gòu)型2-溴丙酸甲酯的方法主要為化學(xué)合成[6]和生物拆分法。曹雪榮等[7]采用固定化柱狀假絲酵母脂肪酶的方法，獲得了單一構(gòu)型2-溴丙酸甲酯，其ee值達(dá)到90%以上。Tasnádi等[8]通過(guò)構(gòu)建工程菌高產(chǎn)還原酶，將β-鹵代丙烯酸酯衍生物脫鹵還原成R-2-溴丙酸甲酯，該對(duì)映體過(guò)量值高達(dá)96%?，F(xiàn)有利用酶法拆分獲得單一構(gòu)型的方法主要局限于固定化酶或者是工程菌中，兩者的立體選擇性高，但是固定化酶前期步驟繁瑣，工程菌不穩(wěn)定，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

本研究從自然界土壤中篩選具有選擇性降解2-溴丙酸甲酯能力的菌株并且對(duì)其進(jìn)行鑒定和發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，進(jìn)一步提高催化效率。

1 材料與方法

1.1 菌株

從土壤中篩選出可水解拆分2-溴丙酸甲酯的菌株，篩選ees值最高菌株，命名為Fer-ly-16。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基。蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，pH值 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。蛋白胨10 g·L-1，蔗糖10 g·L-1，橄欖油10 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，pH 值7.0，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

富集培養(yǎng)基。蛋白胨 10 g·L-1，無(wú)水K2HPO41 g·L-1，無(wú)水MgSO40.5 g·L-1，底物100 μL，pH值7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

初篩培養(yǎng)基。橄欖油10 g·L-1，(NH4)2SO45 g·L-1，無(wú)水K2HPO41 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

復(fù)篩培養(yǎng)基。蛋白胨10 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，蔗糖10 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，橄欖油10 g·L-1，無(wú)水K2HPO41 g·L-1，pH 值7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 試劑及溶液配制

Rac-2-溴丙酸甲酯(分析純)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PVA橄欖油乳化液的制備。取20 g聚乙烯醇(PVA)，加入800 mL去離子水，加熱，不斷攪拌使其完全溶解，用0.1 mol·L-1NaOH調(diào)pH值至7.0，過(guò)濾后，定容至1 000 mL，配置成2%聚乙烯醇(PVA)溶液。取上述溶液300 mL，加入100 mL橄欖油，高速勻漿機(jī)高速攪拌成乳白色液體，無(wú)油狀物質(zhì)即可(乳化液現(xiàn)配現(xiàn)用)。

0.1 mol·L-1pH值 7.0的磷酸鈉緩沖液配制方法參考http://www.biomart.cn/experiment/430/478/479/28726.htm。

1.4 儀器

氣相色譜儀(FULI 9790)，高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智)，恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9082)，恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床(DKY-1)，光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯CH-20)。

1.5 方法

1.5.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

富集培養(yǎng)。將50 mL滅菌生理鹽水倒入250 mL錐形瓶中，再加入5 g土樣，將錐形瓶置于30 ℃，180 r·min-1搖床中，1 h后取出，靜置30 min；取1 mL上清于富集培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)4 d；取1 mL 4 d后培養(yǎng)的菌液于富集培養(yǎng)基，為第2次富集；如此富集培養(yǎng)3次。

平板篩選。取富集后的菌液進(jìn)行稀釋，稀釋濃度為10-8、10-10、10-12、10-14，取以上4個(gè)濃度的菌液各100 μL，涂布于初篩固體培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度做3組。置于30 ℃培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)直至有菌落產(chǎn)生。將平板置于365 nm紫外下，挑取有熒光產(chǎn)生的菌落，將此類菌落挑取劃線于新初篩固體平板中，劃線純化，保存于斜面培養(yǎng)基中。

復(fù)篩篩選。將斜面培養(yǎng)基中菌落接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12～16 h，取1 mL種子液培養(yǎng)基于復(fù)篩液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r·min-1，培養(yǎng)48 h，得到50 mL發(fā)酵液。取發(fā)酵液，4 ℃ 8 000g離心20 min，去掉上清得到菌體，加入10 mL 0.1 mol·L-1pH值7.0的磷酸鈉緩沖液，加入100 μL底物，30 ℃，180 r·min-1進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)固定化酶對(duì)底物反應(yīng)時(shí)間[7]，在4 h時(shí)停止反應(yīng)，進(jìn)行處理。

1.5.2 菌株活化及菌株發(fā)酵培養(yǎng)

菌株劃線于LB平板，過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，得到50 mL發(fā)酵液。

1.5.3 菌體及上清液催化水解反應(yīng)

取50 mL發(fā)酵液，4 ℃，8 000g離心20 min，去除上清液，得到全細(xì)胞，加入10 mL 0.1 mol·L-1pH 值7.0的磷酸鈉緩沖液，然后加入100 μL底物，將10 mL反應(yīng)液放于30 ℃水浴搖床中反應(yīng)。每隔2 h取1 mL反應(yīng)液，加入0.1 mol·L-1HCl，直至反應(yīng)液pH值為2，加入等體積乙酸乙酯，放入搖床內(nèi)完全萃取，取上清液500 μL，加入少量無(wú)水硫酸鈉除水，14 000g，離心1 min后，取上清液200 μL進(jìn)樣檢測(cè)。

1.5.4 檢測(cè)方法

氣相色譜條件載氣為氮?dú)?，檢測(cè)器210 ℃，進(jìn)樣器210 ℃。升溫程序：80 ℃，1 min；以10 ℃·min-1升溫至160 ℃；160 ℃，2 min；以6 ℃·min-1升溫至180 ℃；180 ℃，1 min；以10 ℃·min-1升溫至190 ℃；190 ℃，降溫。進(jìn)樣量2 μL，氣相柱為BGB-174毛細(xì)管手性色譜柱。

底物對(duì)映體過(guò)量值(ees)和酯轉(zhuǎn)化率(C)按下列公式計(jì)算：

ees=│([S]S-[S]R)/([S]S+[S]R)│×100。

C=([S]SA+[S]RA- [S]S-[S]R)/([S]SA+[S]RA)。

式中：[S]S和[S]R是樣品中S構(gòu)型和R構(gòu)型含量，ees為底物對(duì)映體過(guò)量值；[S]SA和[S]RA為未催化前樣品中S構(gòu)型和R構(gòu)型含量，C為酯轉(zhuǎn)化率。

1.5.5 產(chǎn)脂肪酶菌株鑒定

選取對(duì)底物有效果的菌株進(jìn)行生理生化鑒定，將挑取的單菌落接種于LB培養(yǎng)基，并劃線于LB固體平板中，培養(yǎng)16 h后，觀察平板中菌落，將菌液稀釋后進(jìn)行革蘭氏染色。將單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)16 h，隔2 h取樣，測(cè)其生長(zhǎng)曲線。取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，30 ℃ 180 r·min-1振蕩培養(yǎng)16 h后，進(jìn)行16S rDNA分子鑒定。

1.5.6 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵條件優(yōu)化

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)碳源(1%添加量，蔗糖、麥芽糖、甘露醇、橄欖油、殼聚糖、可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖以及不加碳源)、氮源(1%添加量，蛋白胨、氨水、大豆分離蛋白、黃豆粉、酵母提取物、硫酸銨、氯化銨、脫脂豆粉、玉米粉)、無(wú)機(jī)鹽(0.1%添加量，KH2PO4、K2HPO4、Na2S2O3、MnSO4、Na2SO4、NaCl、ZnSO4、AgNO3、CaCl2、CoCl2、CuSO4、EDTA、FeCl3、FeSO4、MgSO4·7H2O)、誘導(dǎo)劑(吐溫-80、玉米油、橄欖油、底物)各個(gè)單因素，對(duì)培養(yǎng)基中各個(gè)因素進(jìn)行單因素優(yōu)化，確定各個(gè)因素的最佳濃度。在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，考查麥芽糖(A)、蛋白胨(B)、無(wú)機(jī)鹽(MgSO4·7H2O和NaCl的濃度)(C，D)和玉米油(E)5個(gè)因素，每個(gè)因素選取4個(gè)水平：麥芽糖(A)和蛋白胨(B)的4個(gè)水平均分別為5、10、20、30 g·L-1；MgSO4·7H2O和NaCl的4個(gè)水平均分別為0.2、0.5、1、2 g·L-1；玉米油的4個(gè)水平分別為4、10、20、40 mL·L-1。

1.5.7 酶活性測(cè)定

脂肪酶活性單位定義為30 ℃、pH值為7.0條件下，以每1 min消耗1 μg 2-溴丙酸甲酯所需酶量為1個(gè)活性單位(U)。

相對(duì)脂肪酶活性。以初發(fā)酵培養(yǎng)基pH 值7.0，30 ℃發(fā)酵48 h為基礎(chǔ)，50 mL發(fā)酵液離心得到菌體加10 mL磷酸緩沖液，加入100 μL底物，水浴搖床30 ℃反應(yīng)4 h，氣相檢測(cè)剩余底物量，計(jì)算酯轉(zhuǎn)化率，將該轉(zhuǎn)化率定為脂肪酶活性100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

通過(guò)富集培養(yǎng)、初篩培養(yǎng)以及復(fù)篩培養(yǎng)后，總共獲得65株產(chǎn)脂肪酶菌株，其中有11株菌株對(duì)2-溴丙酸甲酯有拆分作用，有1株菌株對(duì)于2-溴丙酸甲酯的拆分選擇性比較高，將其命名為Fer-ly-16；其ees值大于85%。

2.2 催化水解反應(yīng)

Fer-ly-16 菌株發(fā)酵液離心后得到全細(xì)胞，取全細(xì)胞作為酶催化劑，反應(yīng)4 h，結(jié)果如圖1所示。以全細(xì)胞作為催化劑，反應(yīng)4 h以后，底物的2種構(gòu)型有很大差距，其ees大約為85%，酯轉(zhuǎn)化率約為40%。

圖1 全細(xì)胞催化拆分底物

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌落特征

Fer-ly-16單菌落背面為乳白色，正面凸起，表面粗糙，桿狀，革蘭陽(yáng)性菌。生長(zhǎng)曲線表明，0～3 h處于停滯期，4～10 h為指數(shù)生長(zhǎng)期，10～16 h為平臺(tái)期，17 h后進(jìn)入衰亡期。

2.3.2 16S rDNA分子鑒定

測(cè)序得到其16S rDNA全長(zhǎng)約為1 400 bp，序列比對(duì)結(jié)果表明，該菌株與Bacillussubtilis27R7-12、B.subtilissubsp. subtilis strain QB5413和B.subtilissubsp. subtilis strain QB5412的同源性高于99%。根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果、序列比對(duì)以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果(圖2)，F(xiàn)er-ly-16菌株屬于枯草芽孢桿菌。

小數(shù)為枝長(zhǎng)，枝上顯示Bootstrap500個(gè)循環(huán)的置信度圖2 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.4.1 碳源優(yōu)化

從圖3中看出，以麥芽糖為碳源時(shí)，其脂肪酶活性最大，而以殼聚糖為碳源時(shí)，其脂肪酶活性最低，表明Fer-ly-16菌株不適合以殼聚糖為碳源，最適碳源為麥芽糖。以麥芽糖為碳源，當(dāng)麥芽糖濃度為15 g·L-1時(shí)，其脂肪酶相對(duì)活性最高，達(dá)到110%；麥芽糖濃度超過(guò)15 g·L-1時(shí)，相對(duì)酶活性逐漸降低，表明麥芽糖濃度的增加在一定程度上抑制了菌體的生長(zhǎng)。

圖3 不同碳源及最優(yōu)碳源濃度對(duì)菌株Fer-ly-16發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.4.2 氮源優(yōu)化

由圖4可以看出，以蛋白胨為氮源，菌株酶活性最大；而以氨水、硫酸銨、氯化銨為氮源時(shí)，菌株相對(duì)酶活性幾乎為0。因此，F(xiàn)er-ly-16菌株最適氮源為蛋白胨。蛋白胨濃度為20 g·L-1時(shí)，脂肪酶相對(duì)酶活性達(dá)到最大。推測(cè)高濃度的氮源可能會(huì)使菌體細(xì)胞發(fā)生破裂，從而使酶合成受到抑制，降低酶活性。

圖4 不同氮源及最優(yōu)氮源濃度對(duì)菌株Fer-ly-16發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

2.4.3 無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化

從圖5可知，添加NaCl或MgSO4·7H2O的培養(yǎng)基，脂肪酶相對(duì)酶活比較高，分別為100%和110%。當(dāng)培養(yǎng)基中添加ZnSO4和CoCl2時(shí)，這2種無(wú)機(jī)鹽可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，菌體的相對(duì)酶活性幾乎為0。因此，F(xiàn)er-ly-16菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最適無(wú)機(jī)鹽為NaCl或MgSO4·7H2O。在最適無(wú)機(jī)鹽離子的基礎(chǔ)上，考查不同濃度的無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)脂肪酶相對(duì)活性的影響。MgSO4·7H2O和NaCl分別為0.2和1 g·L-1時(shí)，其脂肪酶活性達(dá)到最大值。

2.4.4 誘導(dǎo)劑優(yōu)化

從圖6可以看出，以玉米油為誘導(dǎo)劑時(shí)，其脂肪酶相對(duì)活性達(dá)到最大，以添加底物為誘導(dǎo)劑時(shí)，其脂肪酶相對(duì)活性幾乎為0。因此，F(xiàn)er-ly-16菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最適誘導(dǎo)劑為玉米油，當(dāng)玉米油添加量為30 mL·L-1時(shí)，其脂肪酶相對(duì)活性最大。

2.4.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，A3B4C2D3E2為最佳水平組合，即麥芽糖20 g·L-1，蛋白胨30 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，玉米油10 mL·L-1。極差分析表明，氮源對(duì)脂肪酶活性影響最大，其次是MgSO4·7H2O，影響最小的是碳源。取組合A3B4C2D3E2為最佳培養(yǎng)基組合，發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，催化反應(yīng)后相對(duì)酶活性為164%。

圖5 不同無(wú)機(jī)鹽及最優(yōu)無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)菌株Fer-ly-16發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖6 不同誘導(dǎo)劑及最優(yōu)誘導(dǎo)劑濃度對(duì)菌株Fer-ly-16發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

組合因素碳源氮源MgSO4·7H2ONaCl玉米油相對(duì)酶活性/%111111102.89212222121.82313333127.64414444130.61521234108.23622143101.68723412129.63824321129.71931342108.301032431122.031133124124.221234213129.211341423105.651442314116.371543241130.681644132128.08K1120.7106.3114.2119.5121.3K2117.3115.5122.5120.4122.0K3120.9128.0120.5121.5116.0K4120.2129.4122.0117.8119.9R3.623.18.33.76.0

3 小結(jié)

本研究篩選出1株可以高效水解拆分2-溴丙酸甲酯的菌株Fer-ly-16，經(jīng)單菌落觀察和16S rDNA分子鑒定可知，此菌株為枯草芽孢桿菌。30 ℃發(fā)酵48 h后，離心得到全細(xì)胞，該全細(xì)胞可在30 ℃下催化100 μL 2-溴丙酸甲酯，其ees達(dá)到85%，剩余底物為R-2-溴丙酸甲酯，并且可產(chǎn)生S-2-溴丙酸。

對(duì)菌株Fer-ly-16發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，培養(yǎng)基中氮源對(duì)脂肪酶活性影響最大。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為麥芽糖20 g·L-1，蛋白胨30 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，玉米油10 mL·L-1，此培養(yǎng)基得到的脂肪酶活性為基礎(chǔ)培養(yǎng)基酶活性的1.64倍，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯：侯春曉)

2017-03-09

魏盼盼(1992—)，女，浙江余姚人，碩士研究生，主要從事酶工程研究工作，E-mail：weihangchen@163.com。

陳小龍(1970—)，男，浙江仙居人，教授，博士，從事生物農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)修飾與生物催化制備手性農(nóng)藥研究工作，E-mail：richard_chen@zjut.edu.cn。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170839

S482.4+1

A

0528-9017(2017)08-1420-05

文獻(xiàn)著錄格式：魏盼盼，陸躍樂(lè)，陳小龍. 手性拆分2-溴丙酸甲酯的菌株篩選及優(yōu)化[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(8)：1420-1424，1428.