鄭 琳，高士偉，曹 丹，王雪萍，王勝鵬，葉 飛，鄭鵬程，滕 靖，劉盼盼，龔自明

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹茶葉研究所，湖北 武漢 430064)

分子印跡技術(shù)在茶葉中的應(yīng)用

鄭 琳，高士偉，曹 丹，王雪萍，王勝鵬，葉 飛，鄭鵬程，滕 靖，劉盼盼，龔自明*

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹茶葉研究所，湖北 武漢 430064)

分子印跡技術(shù)是一項(xiàng)制備與識(shí)別“分子鑰匙”的人工“鎖”技術(shù)，在分離提純、免疫分析、模擬酶、催化以及生物傳感器等方面的應(yīng)用研究有較廣闊的空間。本文對(duì)分子印跡技術(shù)在提取純化茶葉中咖啡因、兒茶素、EGCG單體等有效成分中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，并分析了應(yīng)用前景，以期為分子印跡技術(shù)與茶葉深加工技術(shù)的進(jìn)一步“合作”開拓思路。

分子印跡技術(shù)； 茶葉； 應(yīng)用現(xiàn)狀； 前景分析

分子印跡技術(shù)(Molecular Imprinting Technology，簡(jiǎn)稱MIT)是以目標(biāo)分子為模板，制備對(duì)該目標(biāo)化合物具有特異選擇性的聚合物的過(guò)程。茶葉作為中國(guó)特有的飲品，選育品種多樣，種植歷史悠久，針對(duì)其所含茶堿、茶多酚、兒茶素、茶黃素、EGCG等成分的功效性分析研究層出不窮。本文對(duì)分子印跡技術(shù)在茶葉成分提純中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了概述，旨在為提高茶葉深加工產(chǎn)品的品質(zhì)和產(chǎn)量、高效快速判定茶葉安全性等提供思路。

1 分子印跡聚合物的制備

分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，簡(jiǎn)稱MIP)的制備過(guò)程分三步：1)在一定溶劑(也稱致孔劑)中，模板分子與功能單體依靠官能團(tuán)之間的共價(jià)或非共價(jià)作用形成主客體配合物；2)加入交聯(lián)劑，通過(guò)引發(fā)劑、光或熱等引發(fā)單體聚合，使主客體配合物與交聯(lián)劑通過(guò)自由基共聚合在模板分子周圍形成高聯(lián)的剛性聚合物；3)選用合適的溶劑，物理或者化學(xué)方法將聚合物中的印跡分子洗脫或解離出來(lái)。這樣在聚合物中便留下了與模板分子大小和形狀相匹配的立體孔穴，同時(shí)孔穴中包含了精確排列的與模板分子官能團(tuán)互補(bǔ)的由功能單體提供的功能基團(tuán)，如果構(gòu)建合適，這種分子印跡聚合物就像鎖一樣對(duì)此鑰匙具有選擇性，所以分子印跡技術(shù)通常也被描述為制備與識(shí)別“分子鑰匙”的人工“鎖”技術(shù)。所得分子印跡聚合物包括絮塊狀、線狀、棒狀、微球、凝膠、薄膜等形態(tài)，其制備方法主要有本體聚合法、懸浮聚合法、分散聚合法、沉淀聚合法及表面印跡法，各有千秋，詳見表1。

2 分子印跡技術(shù)在茶葉成分提純中的應(yīng)用現(xiàn)狀

早在1973年，Wulff等[1]研究以乙烯基苯基硼酸和4-硝基苯基-α-D-甘露糖苷反應(yīng)，得到模板分子，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸甲酯后共同聚合，然后通過(guò)硼酸酯分解除去模板，首次成功制得共價(jià)型分子印跡聚合物，使分子印跡方面的研究產(chǎn)生了突破性進(jìn)展。隨著80年代非共價(jià)模板聚合物的出現(xiàn)，Mosbach等[2]認(rèn)為，單體和模板間存在非共價(jià)相互作用，也能達(dá)到印跡目的，成功用非共價(jià)型分子印跡聚合物分離得到茶堿以后，分子印跡技術(shù)在分離提純、免疫分析、模擬酶、催化以及生物傳感器等方面的應(yīng)用研究如雨后春筍般盛起。

受品種、生長(zhǎng)環(huán)境、加工方式不同等影響，茶葉中活性成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜、類型多樣。目前，茶葉中有效成分的分離純化主要依賴于硅膠柱色譜、大孔吸附樹脂柱色譜、聚酰胺柱色譜、凝膠柱色譜、高速逆流色譜、制備型高效液相色譜等色譜技術(shù)，以EGCG的分離純化為例，為了得到高純度EGCG單體，生產(chǎn)中常使用氯仿、乙酸乙酯等有毒試劑，也大量使用到乙醇等有機(jī)溶劑，或需經(jīng)反復(fù)柱色譜純化，不僅溶劑消耗量大、環(huán)境污染嚴(yán)重，而且效率和收率也低。與上述色譜分離技術(shù)相比，分子印跡技術(shù)顯示出獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn)：構(gòu)效預(yù)定性、操作穩(wěn)定性、廣泛實(shí)用性、抗物理撞擊和耐酸、堿、熱等特點(diǎn)，同時(shí)操作簡(jiǎn)單，溶劑消耗量小，模板和MIPs都可以回收再利用。正因如此，2000年開始分子印跡技術(shù)也被廣泛用于茶葉深加工行業(yè)，用來(lái)分離純化茶葉中的有效成分。

表1 MIPs制備方法及其優(yōu)缺點(diǎn)

2.1 在分析/提純咖啡堿成分中的應(yīng)用

早在2000年，Kobayashi等[3]就以咖啡因?yàn)槟０?、聚丙烯腈為聚合劑，采用沉淀聚合法制備出咖啡因MIPs膜，再將厚約0.1mm的膜貼在石英晶體的金電極上，制成MIPs-QCM傳感器，只需將傳感器浸入含咖啡因的樣品液中，根據(jù)電極數(shù)據(jù)反應(yīng)即可清楚所得咖啡因含量。Mohammed等[4]在此基礎(chǔ)上制作了更加精細(xì)的咖啡因MIPs-QCM傳感器，可定量分析茶樣中咖啡因的含量，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差保證在±5%。Theodoridis等[5]以熱聚合法制備了咖啡因MIPs，并證實(shí)該MIPs固相萃取劑可從茶葉飲料中直接萃取咖啡因。顏流水等[6]同樣以咖啡因?yàn)槟０?、聚丙烯腈為聚合劑，紫外光引發(fā)原位聚合，制備出咖啡因MIPs毛細(xì)管整體柱，可從綠茶飲料中有效分析出咖啡因含量。

2.2 在提純/檢測(cè)兒茶素成分中的應(yīng)用

諸多研究用分子印跡技術(shù)從茶葉中提取純化得到咖啡因，或者可有效檢測(cè)茶飲品中咖啡因的含量，受其啟發(fā)，一眾研究學(xué)者開展了兒茶素印跡分子聚合物的制備及應(yīng)用研究。雷啟福等[7]制備了兒茶素MIPs，并將此MIPs作為固相萃取劑，從茶葉提取物中分離富集兒茶素，效果較好。干寧等[8]先選用EC為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙烯二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，紫外誘發(fā)合成聚合物EC-MIPs；再用EC-MIPs填充制備EC-MIPs-SPE柱，萃取分離茶葉樣品；最后采用電噴霧質(zhì)譜(EIMS)檢測(cè)洗脫液中兒茶素含量，結(jié)果顯示，該方法有效去除94.2%的咖啡因和全部茶堿干擾，可用于茶葉中微量?jī)翰杷胤蛛x鑒定。劉伯洋等[9]建立了一種分子印跡固相萃取-毛細(xì)管電泳聯(lián)用檢測(cè)表兒茶素的方法：首先考察了模板分子(表兒茶素)、功能單體(丙烯酰胺)、交聯(lián)劑(乙二醇二甲基丙烯酸酯)和引發(fā)劑(偶氮二異丁腈)在不同比例條件下表兒茶素分子印跡聚合物的特異性吸附能力，并利用掃描電子顯微鏡和紅外光譜技術(shù)對(duì)聚合物進(jìn)行表征，然后在毛細(xì)管電泳條件下對(duì)加載過(guò)固相萃取柱的過(guò)柱液與洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該方法可靠有效。

2.3 在提純EGCG單體成分中的應(yīng)用

鐘世安等[10]選用模板分子EGCG，功能單體α-甲基丙烯酸，交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯，光冷條件下引發(fā)合成EGCG分子印跡聚合物，并將該聚合物用于固相萃取茶葉提取物茶多酚，結(jié)果顯示，所得EGCG純度可達(dá)92.4%。隨后，張春靜等[11]以多孔乙酸纖維膜為支撐體，成功制備了EGCG分子印跡復(fù)合膜，可從茶多酚中分離富集得到純度為93%的EGCG單體。張文博等[12-14]先后研究制備EGCG分子印跡殼聚糖膜，優(yōu)化其工藝及性能，結(jié)果表明，該膜可有效分離茶葉中EGCG單體，并可有效應(yīng)用于電化學(xué)傳感方面。秦宇[15]以光或熱為引發(fā)條件，制備了EGCG-微/納米硅膠分子印跡聚合物及EGCG-分子印跡復(fù)合膜，聯(lián)合傅里葉變換紅外光譜、掃描電子顯微鏡和元素分析等對(duì)其進(jìn)行表征，并從靜態(tài)、動(dòng)態(tài)和選擇性吸附多重方向評(píng)價(jià)其吸附性能，結(jié)果顯示，聚合物表征和吸附性能均良好。隨著分子印跡聚合物制備方法的比較研究，表面分子印跡法顯現(xiàn)出絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，結(jié)合表面分子印跡法檢測(cè)分離中藥成分的研究頗多，茶葉研究者也與時(shí)俱進(jìn)，將其應(yīng)用到了對(duì)茶葉成分的分離中。徐菲菲等[16]以g-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的硅膠為載體、EGCG為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體，用表面分子印跡的方法制備了SMIP，可有效吸附茶葉中的EGCG單體。胡穎[17]制備出EGCG新型表面分子印跡聚合物，以此為固相萃取的吸附劑，分離純化了茶多酚中的EGCG單體，并識(shí)別檢測(cè)出牙膏樣品中痕量EGCG，建立了基于表面分子印跡聚合物-固相萃取-高效液相色譜分析的新方法。

3 展望

我國(guó)茶葉有綠茶、紅茶、烏龍茶、黃茶、白茶、黑茶，是全球最重要的茶葉大國(guó)，茶葉面積第一、茶葉產(chǎn)量第一、出口第三，我國(guó)茶葉產(chǎn)銷量約占世界的38%。相較于分子印跡技術(shù)在中醫(yī)藥行業(yè)的高度利用，該技術(shù)在茶葉行業(yè)的應(yīng)用研究太少，若能與茶葉深加工、茶葉品質(zhì)檢測(cè)等方向的研究有效合作，將是強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合。

3.1 與茶葉深加工技術(shù)的合作前景分析

茶葉深加工技術(shù)作為提高茶葉附加值、延伸茶葉產(chǎn)業(yè)鏈的有效手段，近年來(lái)產(chǎn)學(xué)研機(jī)構(gòu)都投入了相當(dāng)多的精力和經(jīng)濟(jì)開展研究，但是都難有重大突破。膜技術(shù)、固相萃取技術(shù)、納米技術(shù)等在茶葉深加工發(fā)展中應(yīng)用較多，分子印跡技術(shù)若能與之有效聯(lián)合應(yīng)用，將可開展提純甲基化EGCG、r-氨基酸等茶葉微量成分的相關(guān)研究，凸顯出高選擇性、良好穩(wěn)定性、廣泛適用性等特點(diǎn)，增加茶葉深加工產(chǎn)品的種類并提高其產(chǎn)量和品質(zhì)。

3.2 與茶葉品質(zhì)檢測(cè)的合作前景分析

隨著茶園種植面積的快速增加，茶園土肥藥的管理問(wèn)題出現(xiàn)，還有一些茶企加工不連續(xù)不規(guī)范，儲(chǔ)存運(yùn)輸不專業(yè)，導(dǎo)致茶葉品質(zhì)安全問(wèn)題日益嚴(yán)峻，分子印跡熒光納米探針分析高效、靈敏、快速、簡(jiǎn)便[18]，可有效檢測(cè)出茶葉中的農(nóng)藥及有害微生物殘留，保證茶葉品質(zhì)安全，為茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展保駕護(hù)航。

3.3 尚需解決的問(wèn)題

分子印跡聚合物通常在有機(jī)溶劑中合成，但由于極性溶劑破壞了模板分子與單體間的氫鍵作用，故其識(shí)別能力在用于水相中目標(biāo)物的富集時(shí)就會(huì)變?nèi)?。但是茶葉提取物的提純大多是在水相中完成的，所以選擇適應(yīng)性強(qiáng)的交聯(lián)劑、水溶性功能單體等，也是應(yīng)用中需要解決的問(wèn)題。

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(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2017-05-16

國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-23)；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項(xiàng)目(2016-620-000-001-032)；湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金(2015NKYJJ16)

鄭 琳(1985—)，湖北襄陽(yáng)人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，從事茶葉深加工研究工作，E-mail：376624543@qq.com。

龔自明，研究員，從事茶葉加工研究工作，E-mail：ziminggong@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170832

S571

A

0528-9017(2017)08-1398-03

文獻(xiàn)著錄格式：鄭琳，高士偉，曹丹，等. 分子印跡技術(shù)在茶葉中的應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(8)：1398-1400.