楊月月+遲德富+宇佳

摘 要 通過(guò)分別向匍枝筋骨草懸浮培養(yǎng)體系中添加不同濃度的脫落酸（ABA）并測(cè)定添加后不同時(shí)間懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況和生物量，以及蛻皮甾酮（20E）和ABA的濃度變化，篩選出最適宜添加濃度.通過(guò)測(cè)定懸浮細(xì)胞內(nèi)玉米素（ZR）、赤霉素3（GA3）和吲哚乙酸（IAA）及20E的含量變化，探討ABA對(duì)匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.結(jié)果表明，添加0.15 mg·L-1 ABA后細(xì)胞生長(zhǎng)速度減緩，但在未褐化期ABA促進(jìn)20E的累積，在第48 h和72 h懸浮細(xì)胞中20E含量顯著地高于對(duì)照組，但在第96 h懸浮細(xì)胞出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，20E含量下降極顯著地低于對(duì)照組；向匍枝筋骨草懸浮體系中加入外源ABA，懸浮細(xì)胞內(nèi)ABA含量呈上升趨勢(shì)，ZR，GA3，IAA含量呈相對(duì)下降趨勢(shì)；在相同條件下添加ABA抑制劑（Na2WO4），則ABA，ZR，GA3和IAA的變化趨勢(shì)與添加ABA相反，對(duì)20E的影響不顯著.

關(guān)鍵詞 匍枝筋骨草；脫落酸；脫落酸抑制劑；鎢酸鈉；內(nèi)源激素；蛻皮甾酮（β-蛻皮甾酮）

中圖分類號(hào) Q946；Q813文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1000-2537（2017）04-0026-08

Abstract The optimal concentration of abscisic acid （ABA） was evaluated in this work by adding different concentrations of ABA into the suspension cell cultures system of Ajuga lobata D. Don. The growing status， biomass of suspension cultures cell， concentration of ecdysterone （20E） were measured after adding those substances. Upon the selection of optimal concentration， 0.15 mg·L-1ABA was added into Ajuga lobata D.Don suspension cell culture system， then changes of endogenous phytohormones， such as zeatin（ZR）， gibberellin 3（GA3）， Hetero auxin（IAA） and 20E content were determined with HPLC， and the impact of ABA on plant endogenous hormone content and 20E synthesis in suspension cultures cell of Ajuga lobata D. Don were analyzed. Adding ABA in the suspension cell culture system， we found that the growing speed of suspension cell was decreased， but without browning， ABA promoted the accumulation of 20E. At 48 h and 72 h after the addition of ABA， the content of 20E was significantly higher than that in the control group， and at 96 h after its addition， those treated with suspension cells became browning， and the dry weight of those cells was significantly lower than that of the control group. The content of endogenous ZR， GA3 and IAA in the treated suspension cell was also decreased. After the addition of Na2WO4 into the suspension cell culture system， the change trend of ABA， ZR， GA3 and IAA was opposite to that of adding ABA， and their range of 20E concentration change never reached to the significant difference level as compared with that of the control group.

Key words Ajuga lobata D.Don； abscisic acid （ABA）； ABA inhibitors； Na2WO4； endogenous hormone； ecdysterone （20E，20-hydroxyecdysone）

匍枝筋骨草（Ajuga lobata D. Don）屬唇形目（Lamiales）唇形科（Lamiaceae）筋骨草屬（Ajuga），一年或二年生草本植物[1-2]，具有清熱解毒、涼血平肝的藥用作用[3-4].匍枝筋骨草富含蛻皮甾酮（20E），屬于萜類化合物，通過(guò)類異戊二烯生物合成途徑合成[5-6].20E有促進(jìn)膠元蛋白合成、抗心律不齊、抗疲勞的作用，降膽固醇、血脂、血糖，治療心肌缺血，股骨頭壞死等，也是一種天然的抗癌制劑[7].化妝品中也有應(yīng)用，具有增強(qiáng)細(xì)胞新陳代謝及活化、去斑增白作用[8].在昆蟲(chóng)防治方面，由于植物中的蛻皮甾酮與昆蟲(chóng)體內(nèi)的蛻皮激素結(jié)構(gòu)類似，具有影響昆蟲(chóng)蛻皮和生長(zhǎng)發(fā)育的作用，制成植物源殺蟲(chóng)劑和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，是對(duì)環(huán)境無(wú)毒無(wú)害的生物類農(nóng)藥[9].

脫落酸（abscisic acid，ABA）是一種調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的植物激素[10]，有“逆境激素”之稱.逆境條件會(huì)引起植物體內(nèi)的ABA含量增加，添加外源ABA同樣可誘導(dǎo)植株發(fā)生信號(hào)傳遞啟動(dòng)防御系統(tǒng)，抵御外界脅迫[11-12].除此之外，ABA可促使植物中酚類、酮類等次生代謝產(chǎn)物的增加[13-16].鎢酸鈉（Na2WO4）為ABA合成抑制劑，能抑制ABA合成過(guò)程中的ABA醛氧化酶（ABA-aldehydeoxidase），使ABA醛不能轉(zhuǎn)化為ABA，從而抑制植物內(nèi)源ABA的合成[17].吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）和細(xì)胞分裂素（ZR）都是生長(zhǎng)類激素，組織培養(yǎng)過(guò)程中添加適當(dāng)濃度的生長(zhǎng)類激素可促進(jìn)植物細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的積累，其原因是生長(zhǎng)類激素促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及分裂，影響其代謝，從而次生代謝產(chǎn)物含量上升[18-20].ABA是一種較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制劑，其對(duì)生長(zhǎng)的作用與IAA，GA3和ZR三者相反，它對(duì)細(xì)胞的分裂與生長(zhǎng)起抑制作用[21-24]，卻同樣可以提高次生代謝產(chǎn)物含量，但原因和機(jī)制不明.

本研究通過(guò)在匍枝筋骨草懸浮培養(yǎng)體系中添加ABA或處理，分析ABA對(duì)懸浮細(xì)胞的各種內(nèi)源激素和20E含量的影響，探討ABA和Na2WO4誘導(dǎo)懸浮細(xì)胞中內(nèi)源激素變化與20E合成存在的關(guān)系，為ABA誘導(dǎo)蛻皮激素合成的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，也可為利用細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)植物20E提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持.

1 試驗(yàn)與方法

1.1 材料

愈傷組織由匍枝筋骨草葉片誘導(dǎo)形成，再經(jīng)懸浮培養(yǎng)得到懸浮細(xì)胞.

三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（Waters 公司），C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm粒度，Waters 公司）；GA3，IAA，ZR，ABA標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）；蛻皮激素標(biāo)品由上海中醫(yī)大學(xué)提供.

1.2 方法

1.2.1 懸浮細(xì)胞的培養(yǎng) 采用趙曉杰等[25]方法，將筋骨草在固體培養(yǎng)基（MS+2，4-D 0.4 mg/L）上誘導(dǎo)成愈傷組織，然后將愈傷組織在無(wú)菌條件下接種到未添加瓊脂的液體培養(yǎng)基內(nèi)（MS+2，4-D 0.4 mg/L）懸浮培養(yǎng)，接種量為10%（即每50 mL培養(yǎng)基中接種筋骨草細(xì)胞鮮質(zhì)量5 g），pH調(diào)至6.0.每隔7 d進(jìn)行一次繼代.本試驗(yàn)使用繼代次數(shù)為4代的懸浮體系.培養(yǎng)條件：室內(nèi)光照培養(yǎng)，溫度為25 ℃，光/暗周期：16 h/8 h，光照強(qiáng)度2 000 lux，濕度為70%.搖床速度：110～120 r/min.

1.2.2 生物量的測(cè)定 將細(xì)胞懸浮液經(jīng)48 μm細(xì)胞篩過(guò)濾，將濾出的細(xì)胞用濾紙吸干多余水分，60 ℃烘干12 h至恒重后，稱量得到細(xì)胞干質(zhì)量.每個(gè)試驗(yàn)組取5個(gè)平行樣品，取其結(jié)果計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差.

1.2.3 蛻皮甾酮含量測(cè)定 蛻皮甾酮（20E）的提取：取干質(zhì)量0.2 g，色譜純甲醇5 mL浸泡24 h，超聲1 h后進(jìn)行微波消解（WT-8000，消解條件T：50 ℃，P：2P0，t：10 min，W：300×2）.有機(jī)過(guò)濾膜過(guò)濾后，濾液直接用于HPLC檢測(cè).每12 h取樣，每試驗(yàn)組取5個(gè)平行樣品.蛻皮甾酮液相圖譜如圖1所示.

20E的檢測(cè)條件：20E檢測(cè)色譜柱（C18）；紫外可見(jiàn)光檢測(cè)波長(zhǎng)范圍190～800 nm；檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm；流動(dòng)相V（甲醛）∶V（水）=1∶1；流動(dòng)相速度0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL.每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次.

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配置濃度為0.8，0.4，0.2，0.1，0.05 g/L的蛻皮甾酮（20E）標(biāo)準(zhǔn)品溶液，檢測(cè)方法同上.以峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得β-蛻皮甾酮回歸方程為：y=18 498x+226.2，相關(guān)系數(shù)為0.999. 根據(jù)液相色譜檢測(cè)試樣20E相應(yīng)峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出β-蛻皮甾酮含量.

1.2.4 內(nèi)源激素含量測(cè)定 內(nèi)源激素的提?。好吭囼?yàn)組取5個(gè)平行樣品.稱取樣品1.0 g于研缽中，加入10 mL -20 ℃過(guò)夜的80%甲醇水溶液，研磨成漿，轉(zhuǎn)入PP管中密封，4 ℃冷浸過(guò)夜.離心得上清液，殘?jiān)尤?～8 mL 80%甲醇水溶液，冷浸2 h后離心得上清液，合并兩份清液，室溫以水泵旋蒸除去大部分甲醇，加入15 mL正己烷脫色3次，棄有機(jī)相，再換油泵將剩余溶劑旋干.加入pH 3.5的甲酸溶液2 mL，過(guò)C18 SPE柱，甲醇洗脫，收集液旋干，以移液器加入2.0 mL流動(dòng)相（含0.1%甲酸），經(jīng)濾膜過(guò)濾后測(cè)試.每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次.

內(nèi)源激素的檢測(cè)：參考鐘冬蓮等方法[26-27].色譜條件，流動(dòng)相V（乙腈）∶V（水）=3∶7；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：2.0 μL；色譜柱溫度：35 ℃.質(zhì)譜條件采用全掃描圖譜，選擇離子定量進(jìn)行分析.離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子方式檢測(cè)； 離子噴射電壓：5.5 kV；溫度：300 ℃；源內(nèi)氣體：N2，壓力：379 kPa；氣簾氣體（N2）壓力：69 kPa；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；碰撞氣（N2）壓力：Medium.內(nèi)激素質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2.

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別配置濃度為0.8，0.4，0.2，0.1，0.05 g/L的ZR，GA3，IAA和ABA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以各內(nèi)源激素對(duì)應(yīng)峰面積的平均值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得內(nèi)源激素回歸方程（見(jiàn)表1）.根據(jù)質(zhì)譜檢測(cè)的試樣ZR，GA3，IAA和ABA相應(yīng)峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出內(nèi)源激素含量.

1.2.5 ABA及ABA抑制劑最佳濃度的篩選 按照方法1.2.1的條件培養(yǎng)7 d，分別向懸浮體系中添加0.05，0.10，0.15，0.20 mg/L ABA 后每24 h進(jìn)行取樣，每個(gè)處理取3個(gè)平行樣，按照1.2.3方法檢測(cè)試樣的20E含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出β-蛻皮甾酮含量.β-蛻皮甾酮含量最高的處理組為最佳ABA添加濃度.

同樣條件培養(yǎng)7 d，分別向懸浮體系中添加0.50，0.75，1.00，1.25 mg/L Na2WO4，每24 h取樣，每個(gè)處理取3個(gè)平行樣，按照1.2.4方法檢測(cè)試樣ZR，GA3，IAA和ABA含量，根據(jù)液相色譜檢測(cè)的相應(yīng)峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出內(nèi)源激素含量.

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示測(cè)定結(jié)果，分別對(duì)ABA處理及Na2WO4處理結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析.采用Excel 2010繪圖.

2 結(jié)果

2.1 ABA及ABA抑制劑對(duì)匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)影響及最佳濃度的篩選

2.1.1 ABA對(duì)匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)影響 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)探究，設(shè)定 0.05，0.10，0.15，0.20 mg/L不同梯度ABA，向匍枝筋骨草懸浮體系中添加不同濃度ABA后，前72 h生長(zhǎng)狀況較為良好，懸浮培養(yǎng)體系為淡黃色，組織均一松散.第96 h懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)褐化，懸浮培養(yǎng)體系為紅褐色.生長(zhǎng)狀況如圖3（彩圖見(jiàn)封三）所示.

添加ABA后，細(xì)胞生物量增長(zhǎng)速度與對(duì)照組相比較緩慢，添加的ABA濃度越高，其細(xì)胞生物量增長(zhǎng)速度越緩慢（圖4）.添加0.05和0.10 mg/L的ABA與對(duì)照差異不顯著.添加0.15 mg/L ABA的第96 h與對(duì)照差異顯著（p<0.05）， 添加0.20 mg/L ABA第48 h及第96 h時(shí)細(xì)胞干重與對(duì)照組差異顯著（p<0.05）.

計(jì)算出懸浮體系中蛻皮激素的總含量（細(xì)胞干質(zhì)量×單位量中蛻皮激素含量），做進(jìn)一步篩選試驗(yàn)，蛻皮激素含量變化如圖5所示.添加0.05 mg/L ABA組中蛻皮激素含量變化與對(duì)照差異不顯著；添加0.10 mg/L ABA組在第48 h蛻皮激素含量高于對(duì)照組，與對(duì)照差異顯著（p<0.05）；添加0.15 mg/L ABA組中蛻皮激素含量在第48 h與72 h與對(duì)照差異顯著，分別高于對(duì)照組28.73%（p<0.01）和18.73%（p<0.05）.第96 h細(xì)胞褐化，蛻皮激素含量較第72 h低但高于對(duì)照組；0.20 mg/L ABA處理組蛻皮激素含量呈先上升后下降趨勢(shì)，分別第96 h低于對(duì)照組且差異顯著（p<0.05）.因此選出最佳ABA添加濃度為0.15 mg/L.

2.1.2 ABA抑制劑對(duì)匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)影響及最佳濃度的篩選 添加不同濃度Na2WO4后ABA含量變化如圖6所示，添加0.50，0.75，1.00 mg/L Na2WO4后細(xì)胞干質(zhì)量有所上升，添加1.25 mg/L Na2WO4后細(xì)胞干質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，在第72 h與第96 h與對(duì)照差異顯著.

添加不同濃度Na2WO4后ABA含量下降，變化如圖7所示.經(jīng)0.50 mg/L Na2WO4處理后細(xì)胞中ABA含量與對(duì)照差異不顯著，0.75 mg/L Na2WO4處理后的第72 h與第96 h與對(duì)照差異顯著（p<0.05）.經(jīng)1.00 mg/L Na2WO4處理后的第48 h與對(duì)照差異顯著（p<0.05），第72 h與第96 h與對(duì)照差異極顯著（p<0.01）.經(jīng)1.25 mg/L Na2WO4處理后細(xì)胞內(nèi)ABA含量與對(duì)照差異極顯著.但是，在0.50，0.75及1.00 mg/L Na2WO4等3種濃度處理后的24，48和72 h，匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)均未表現(xiàn)出明顯的不正常狀況，而在1.25 mg/L Na2WO4處理后的72 h和第96 h，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量明顯下降.因此認(rèn)為1.00 mg/L為向匍枝筋骨草懸浮培養(yǎng)體系中添加Na2WO4的最適濃度.

2.2 外源ABA及ABA抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)激素影響

2.2.1 外源ABA及ABA抑制劑對(duì)ZR含量影響 如圖8，向懸浮培養(yǎng)體系中添加0.15 mg/L外源ABA后，懸浮細(xì)胞內(nèi)ZR含量呈下降趨勢(shì)，到第72 h和第96 h，ZR的含量與對(duì)照相比差異極顯著，低于對(duì)照組27.25%（p<0.01）和30.10%（p<0.01）.向懸浮培養(yǎng)體系中添加1.00 mg/L Na2WO4后24～72 h，懸浮細(xì)胞中ZR含量與同期對(duì)照相比略有上升，但是上升幅度未達(dá)到差異顯著的水平.而到了第96 h，懸浮細(xì)胞中的ZR含量高于對(duì)照組12.23%（p<0.05），差異顯著.

2.2.2 外源ABA及ABA抑制劑對(duì)GA3含量的影響 如圖9，向懸浮培養(yǎng)體系中添加0.15 mg/L外源ABA后，懸浮細(xì)胞內(nèi)GA3含量呈下降趨勢(shì).添加后的第48 h，懸浮細(xì)胞內(nèi)GA3的下降幅度與同期對(duì)照相比差異顯著.到第72 h和第96 h，GA3的下降幅度進(jìn)一步加大，分別低于對(duì)照組34.91%（p<0.01）和34.45%（p<0.01），均與其同期對(duì)照相比差異極顯著.向懸浮系統(tǒng)添加1.00 mg/L Na2WO4后的第24 h，懸浮細(xì)胞內(nèi)GA3含量呈上升趨勢(shì)，在添加后的72 h和96 h，懸浮細(xì)胞內(nèi)GA3含量均與同期對(duì)照相比極顯著上升（p<0.01）.

2.2.3 外源ABA及ABA抑制劑對(duì)IAA含量的影響 如圖10，向懸浮培養(yǎng)體系中添加0.15 mg/L外源ABA后，懸浮細(xì)胞內(nèi)IAA含量呈下降趨勢(shì).在添加后的第24，48，72 h，IAA的下降水平與同期對(duì)照相比差異顯著（p<0.01）；第96 h IAA的水平與同期對(duì)照相比差異極顯著.添加1 mg/L Na2WO4后細(xì)胞內(nèi)IAA含量上升，第48 h與對(duì)照差異顯著（p<0.05），第72 h和96 h IAA含量均與同期對(duì)照相比上升極顯著（p<0.01）.

2.2.4 外源ABA及ABA抑制劑對(duì)ABA含量的影響 如圖11，向懸浮培養(yǎng)體系中添加0.15 mg/L外源ABA后的第24 h和第48 h，細(xì)胞內(nèi)的ABA含量與同期對(duì)照相比呈現(xiàn)了小幅上升的狀態(tài)，但上升幅度未達(dá)到差異顯著的程度；在添加后的第72 h和第96 h，細(xì)胞內(nèi)的ABA含量繼續(xù)上升，分別比同期對(duì)照提高46.29%（p<0.01）和49. 61%（p<0.01），并且均達(dá)到差異極顯著水平.向懸浮培養(yǎng)體系中添加1 mg/L Na2WO4后，懸浮細(xì)胞內(nèi)ABA含量一直呈下降趨勢(shì).在添加后的第24 h，ABA含量比同期對(duì)照略有下降，但未達(dá)到差異顯著水平.到第48 h，ABA含量比同期對(duì)照下降了24.90%（p<0.05），處于差異顯著狀態(tài)；在添加后的第72 h和第96 h，ABA含量分別比同期對(duì)照下降了44.61%（p<0.01）和52.24%（p<0.01），均處于極顯著下降狀態(tài).

2.3 外源ABA及ABA抑制劑對(duì)蛻皮甾酮含量的影響

在懸浮培養(yǎng)體系中添加0.15 mg/L外源ABA和1 mg/L Na2WO4后，20E含量變化如圖12所示.添加外源ABA后24 h，匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞中20E含量略有上升，但與同期對(duì)照相比，未達(dá)到差異顯著水平；在添加后的48 h，懸浮細(xì)胞中20E含量極顯著地高于同期對(duì)照的水平（p<0.01）；第72 h，20E含量顯著地高于同期對(duì)照（p<0.05）；第96 h細(xì)胞褐化死亡，20E含量極顯著地低于同期對(duì)照組的水平（p<0.01）.向懸浮培養(yǎng)體系中添加Na2WO4后，20E含量在第24，48，72或96 h分別出現(xiàn)了與同期對(duì)照相比略微升高或略微下降的波動(dòng)，但是這種波動(dòng)始終未達(dá)到差異顯著的水平.

3 討論

3.1 外源ABA及ABA抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)激素影響

本試驗(yàn)添加外源ABA后，ZR，IAA和GA3含量下降，而ABA含量升高.該現(xiàn)象與其他外施ABA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常相似，如研究發(fā)現(xiàn)在盆栽煙草（Nicotiana tabacum L.）的葉片上噴施ABA后，抑制了煙草葉片中內(nèi)源激素IAA 與GA3的合成[21].在3年生紫花苜蓿（Medicago sativa）的植株上噴施ABA后，其頂芽和第一展開(kāi)葉中ABA 含量均隨外源ABA 噴施濃度水平的提高而增加，IAA和GA3 含量則表現(xiàn)出與ABA 相反的遞減趨勢(shì)[22].ABA處理柱花草的結(jié)果表明，ABA處理植株的ABA含量升高，IAA，GA1+3和iPAs的含量降低[23].其原因是植物激素具有相互調(diào)節(jié)功能，ABA的含量增多對(duì)生長(zhǎng)類激素產(chǎn)生抑制作用[28].

添加ABA抑制劑Na2WO4后，ABA含量大幅度下降，ZR，GA3和IAA含量小幅度上升.其原因是，Na2WO4抑制了ABA合成過(guò)程中的ABA醛氧化酶，使ABA醛不能轉(zhuǎn)化為ABA[17]，因而抑制懸浮細(xì)胞內(nèi)ABA的生物合成，降低了細(xì)胞中的ABA含量，也增強(qiáng)了細(xì)胞進(jìn)一步分裂和生長(zhǎng)的勢(shì)頭，所以出現(xiàn)了ZR，GA3和IAA含量上升的現(xiàn)象.本研究的現(xiàn)象與周碧燕等的研究結(jié)果相似，以ABA 合成抑制劑Na2WO4處理柱花草，ABA含量降低，IAA，GA1+3和iPAs 的含量升高[23].本試驗(yàn)添加Na2WO4后懸浮細(xì)胞內(nèi)ABA，ZR，GA3和IAA的變化規(guī)律，進(jìn)一步說(shuō)明了內(nèi)源ABA對(duì)其他內(nèi)源激素的影響，及細(xì)胞中各種內(nèi)源激素協(xié)調(diào)平衡.

匍枝筋骨草懸浮細(xì)胞褐化的現(xiàn)象也與內(nèi)激素的變化有關(guān)，玉米素ZR是細(xì)胞分裂素，可促進(jìn)細(xì)胞分裂并使細(xì)胞體積擴(kuò)大；生長(zhǎng)素IAA通過(guò)細(xì)胞核的分裂來(lái)進(jìn)行組織的生長(zhǎng)；赤霉素GA3則通過(guò)縮短細(xì)胞分裂周期的G1期和S期來(lái)加速細(xì)胞分裂[28-29].在添加了外源ABA后，此時(shí)用于縮短分裂周期、促進(jìn)細(xì)胞核分裂、刺激細(xì)胞分裂的相應(yīng)激素含量降低，細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育變緩，促使懸浮細(xì)胞提前進(jìn)入到衰老及死亡進(jìn)程[29].

3.2 外源ABA及ABA抑制劑對(duì)蛻皮甾酮含量的影響

蛻皮甾酮（20E）是甾酮類化合物，是匍枝筋骨草次生代謝產(chǎn)物.以往研究表明組織培養(yǎng)過(guò)程中添加適當(dāng)濃度的生長(zhǎng)類激素可促進(jìn)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的積累，其原因是生長(zhǎng)類激素促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及分裂，影響其代謝，從而次生代謝產(chǎn)物含量上升[18-20].ABA是生長(zhǎng)抑制劑，但也有增加植物次生代謝產(chǎn)物的作用，可以誘導(dǎo)綠原酸、酚類、黃酮類和萜類物質(zhì)的增加，其原因與ABA的脅迫作用介導(dǎo)植物啟動(dòng)防御系統(tǒng)引起植物應(yīng)激反應(yīng)從而導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物增加有關(guān)[30].文獻(xiàn)研究也有同樣的發(fā)現(xiàn)，丹參酮與匍枝筋骨草的20E同是萜類物質(zhì)，都是通過(guò)MVA途徑和DOXP/MEP途徑等2條支路完成合成[31].研究表明，ABA可提高丹參酮含量[16，31]，外源添加200 μmol/L ABA到丹參發(fā)根培養(yǎng)體系中，誘發(fā) H2O2和O-2的迸發(fā)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)外源ABA提升了丹參酮合成中的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）基因的表達(dá)量和酶的活性，從而促進(jìn)丹參酮的積累[31]，產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因與上述表達(dá)的植物應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[32].在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)添加ABA后細(xì)胞生長(zhǎng)激素GA3，ZR和IAA含量下降，但可增加20E含量，可以說(shuō)明ABA誘導(dǎo)20E含量增加與生長(zhǎng)素類激素加快細(xì)胞生長(zhǎng)及分裂而引起的次生代謝產(chǎn)物增加的作用無(wú)關(guān)，而是ABA介導(dǎo)植物啟動(dòng)防御系統(tǒng)引發(fā)的結(jié)果，且在以往的實(shí)驗(yàn)中已驗(yàn)證ABA可以促使匍枝筋骨草的防御系統(tǒng)啟動(dòng)[33].但是ABA如何調(diào)控信號(hào)因子、影響次生代謝產(chǎn)物通路的機(jī)理，還需要通過(guò)代謝組學(xué)及基因組學(xué)進(jìn)一步加以研究.

到目前為止沒(méi)有檢索到添加ABA抑制劑Na2WO4后，如何影響植物萜類含量變化的相關(guān)研究.本研究也只是發(fā)現(xiàn)，盡管在匍枝筋骨草懸浮培養(yǎng)體系中添加Na2WO4后，出現(xiàn)了ZR，GA3和IAA含量上升及ABA含量下降的現(xiàn)象.但是在添加后24～96 h懸浮細(xì)胞中20E的含量與同期對(duì)照相比出現(xiàn)了小幅波動(dòng)，而且波動(dòng)過(guò)程始終未達(dá)到顯著差異的水平，說(shuō)明由于ABA含量下降導(dǎo)致其他生長(zhǎng)類激素含量上升，但未達(dá)到促進(jìn)匍枝筋骨草蛻皮激素積累的程度，影響作用不大.其原因尚需要從添加Na2WO4后對(duì)懸浮細(xì)胞合成20E相關(guān)的各種激素水平、關(guān)鍵前體物質(zhì)的濃度、多種酶的活性等方面加以深入地研究.

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