余 鴿,龍鳳來,劉建軍,馬青青,康永祥,黃 建,曹 慶

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院,楊凌 7121002 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院,楊凌 7121003 西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院,楊凌 7121004 陜西佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局,佛坪 723400

不同年齡巴山木竹種群克隆結(jié)構(gòu)

余 鴿1,龍鳳來2,劉建軍3,*,馬青青1,康永祥1,黃 建1,曹 慶4

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院,楊凌 7121002 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院,楊凌 7121003 西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院,楊凌 7121004 陜西佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局,佛坪 723400

很多竹類植物是典型的克隆植物,也是大熊貓的食物。研究典型竹子種群克隆結(jié)構(gòu)的形成和發(fā)展對(duì)竹林的生產(chǎn)和撫育具有理論和實(shí)踐意義,可為預(yù)測(cè)該竹林群落的演替趨勢(shì)和大熊貓保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。利用SSR標(biāo)記研究不同年齡A(7齡)、B(>30齡)和C(>60齡)巴山木竹種群的克隆結(jié)構(gòu)和多樣性,探討小尺度范圍內(nèi)不同年齡巴山木竹種群的克隆結(jié)構(gòu)及斑塊的建立和發(fā)展。8對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出了118個(gè)位點(diǎn),3個(gè)種群樣地的256個(gè)樣本共檢測(cè)到了49個(gè)克隆(基因型),A、B和C種群分別檢測(cè)出31、10個(gè)和8個(gè)克隆。隨著種群年齡的增長(zhǎng),巴山木竹克隆面積增加,克隆數(shù)量減少；A和B樣地各克隆分布格局為團(tuán)塊狀,而C樣地克隆既有團(tuán)塊狀又有離散狀。這一結(jié)果顯示出在幼苗定居的初期,基株可能以短距離的克隆延伸為主從而呈現(xiàn)出團(tuán)塊狀；而隨著年齡的增長(zhǎng),克隆面積不斷擴(kuò)大,當(dāng)復(fù)軸混生型的巴山木竹克隆受到強(qiáng)大的壓迫時(shí),基株可能會(huì)進(jìn)行較多的單軸和長(zhǎng)距離克隆延伸,呈現(xiàn)出離散狀。Mantel 檢測(cè)和空間自相關(guān)分析都支持3個(gè)樣地在小尺度范圍內(nèi)存在明顯的克隆空間遺傳結(jié)構(gòu)。3個(gè)樣地在10 m等級(jí)下顯著的正相關(guān)空間遺傳結(jié)構(gòu)距離為3.1、28、48 m,X-軸截距為9.051、30.698和50.536,空間自相關(guān)系數(shù)的范圍分別為0.1—0.167、0.008—0.703和0.006—0.735。由此可推斷,隨著年齡的增長(zhǎng),巴山木竹克隆斑塊的規(guī)模在不斷地?cái)U(kuò)大,同一克隆的分株數(shù)量增加,在均勻取樣情況下,正相關(guān)空間遺傳結(jié)構(gòu)距離范圍內(nèi)取到具有相同基因型的可能性越大。A、B和C 3樣地的基因型比率(G/N)為1、0.14和0.055, Simpson多樣性指數(shù)(D) 分別為1、0.876和0.744。這說明巴山木竹幼苗期基因型比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成年的竹林,隨著年齡的增長(zhǎng)巴山木竹克隆多樣性雖有所降低,但由于有性繁殖的作用仍然保持了較高的多樣性。聚類和主坐標(biāo)分析均表明總體上各樣地的克隆被聚為一類,但不同樣地少數(shù)克隆的基因型有重疊和聚集,可推斷出不同巴山木竹種群之間可能存在著基因流動(dòng)和近似的克隆起源。

巴山木竹；克隆結(jié)構(gòu)；克隆多樣性

植物克隆結(jié)構(gòu)及斑塊的建立和發(fā)展與能量分配、生態(tài)對(duì)策和遺傳多樣性等生態(tài)學(xué)熱點(diǎn)問題密切相關(guān)[1]。克隆植物種群的克隆數(shù)量、大小、空間格局及其遺傳變異的測(cè)定[2-3]是研究克隆植物種群機(jī)制和進(jìn)化的基礎(chǔ)。研究克隆植物種群克隆結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性對(duì)了解克隆植物種群的形成、維持和衰退有重要意義,同時(shí)有助于了解克隆植物的定居、侵殖和演替機(jī)理[4]。

植物種群克隆結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性受生物因子和非生物因子共同作用的影響[5- 7],其中克隆植物的種苗補(bǔ)充方式[8- 11]、微生境的異質(zhì)性[11-12]以及生長(zhǎng)策略[4]這幾種機(jī)理被提出作為影響植物克隆結(jié)構(gòu)和多樣性的主要因素。在種群的建立、發(fā)展、維持以及衰退的不同階段,植物種群克隆結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性將會(huì)隨著各種作用因子的變化而呈現(xiàn)為動(dòng)態(tài)性。然而,由于許多克隆植物的生活史較長(zhǎng),如竹類植物可長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年甚至百年[13-14],使得人們很難對(duì)同一種群進(jìn)行連續(xù)的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)和研究,而通常將種群克隆結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的研究看成是某一時(shí)間點(diǎn)的靜態(tài)分析[15]。近年來,為研究克隆結(jié)構(gòu)和多樣性的時(shí)間動(dòng)態(tài),一些學(xué)者通過模型模擬并評(píng)估不同時(shí)間段的植物特性和各環(huán)境條件對(duì)克隆植物結(jié)構(gòu)發(fā)展的影響[16-17]；劉慶等采用“倒逐齡級(jí)累加法”研究斑苦竹無性系種群克隆生長(zhǎng)格局動(dòng)態(tài),發(fā)現(xiàn)復(fù)軸型的斑苦竹克隆種群隨時(shí)間進(jìn)程表現(xiàn)為聚集程度逐漸降低的集群分布格局[18]； Lian等用 SSR 標(biāo)記調(diào)查Salixreinii的種群克隆生長(zhǎng)動(dòng)態(tài),發(fā)現(xiàn)克隆的面積隨著該種群分布斑塊的面積增加而擴(kuò)大[19];Ma等使用AFLP標(biāo)記證實(shí)了兩個(gè)不同年齡段(小于30歲齡級(jí)和大于70歲齡級(jí))的Bashaniafangiana種群都是多克隆的,且克隆多樣性水平都較高,說明了該植物的有性繁殖在克隆多樣性中起到的重要作用[10]。這些研究方式為研究克隆結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的動(dòng)態(tài)發(fā)展提供了新思路。

巴山木竹為典型的克隆植物,大約每隔70—75年甚至更長(zhǎng)時(shí)間開一次花[20],開花后,幼苗開始更新；地下根莖為復(fù)軸混生型,即通過合軸叢生和單軸散生的生長(zhǎng)方式來共同完成新一輪的克隆延伸[21]。巴山木竹是秦嶺大熊貓冬春季食物的主要來源[22],主要分布于秦嶺南坡、大巴山以及米倉山地區(qū)的中山地帶。在海拔1600—2000 m處生長(zhǎng)良好,常形成大面積純林,對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定、水土保持及其動(dòng)物多樣性起著至關(guān)重要的作用[23]。已有研究表明部分保護(hù)區(qū)內(nèi)巴山木竹林老齡化,隨時(shí)有開花的危險(xiǎn)[24],研究不同年齡巴山木竹種群的克隆結(jié)構(gòu)和多樣性,有助于理解巴山木竹種群建立、發(fā)展和衰退不同階段的克隆數(shù)量、大小、空間格局及其遺傳變異情況, 從而為巴山木竹林的復(fù)壯更新、撫育實(shí)踐以及保護(hù)尋找出路。目前對(duì)于巴山木竹的研究主要集中在生物學(xué)特性、分布、生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律、生物量以及無性系種群生態(tài)等方面的研究[25],尚未見從遺傳角度研究其克隆結(jié)構(gòu)和多樣性的報(bào)道。在眾多分子標(biāo)記中,SSR 分子標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單及共顯性變異等優(yōu)點(diǎn)[26],被運(yùn)用于多種植物克隆多樣性和克隆結(jié)構(gòu)研究中[3,19,27]。與其它分子標(biāo)記不同之處在于SSR 分子標(biāo)記需要開發(fā)研究對(duì)象的專用引物,在前期的研究工作中,作者已經(jīng)成功開發(fā)出了巴山木竹的SSR引物[28]。因此本研究旨在利用SSR分子標(biāo)記探討不同年齡巴山木竹種群的克隆結(jié)構(gòu)和多樣性及其形成原因,以期為預(yù)測(cè)竹林群落演替趨勢(shì)和巴山木竹的竹林撫育實(shí)踐以及大熊貓保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地設(shè)置與采樣方法

為研究不同年齡巴山木竹種群的克隆結(jié)構(gòu),在考慮林分、海拔、坡度、坡向和土壤含水量等生態(tài)環(huán)境條件較一致的情況下,在2014年共設(shè)置A、B和 C 3塊不同種群年齡的樣地。3塊樣地大小根據(jù)各種群實(shí)際大小和生態(tài)環(huán)境條件而定。A和B 兩塊樣地設(shè)置在鎮(zhèn)巴縣,該縣巴山木竹資源豐富,曾在1978—1983年有大面積竹林開花[29]。A樣地設(shè)置在興隆鎮(zhèn)鄭家山一位農(nóng)戶旁邊的山上,這片竹林于2007年大面積開花后重新形成稠密的巴山木竹幼苗林,樣地大小為20 m×30 m,地理位置坐標(biāo)為108°01′14.40″E、32°30′31.80″N,海拔1603 m。B樣地設(shè)置在星子山朱家坪,該片竹林1978—1983年大面積開花后經(jīng)過幼苗更新形成稠密的巴山木竹成年純林,竹齡超過30a,樣地大小60 m×90 m,地理位置為 107°59′51.04″E、32°31′17.96″N,海拔1610 m左右。C樣地設(shè)置在佛坪國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū),樣地大小100 m×120 m, 經(jīng)過和保護(hù)站的工作人員了解,該竹林年齡大于60a,海拔1621 m,到目前為止仍沒有開花跡象,此處巴山木竹生長(zhǎng)良好形成稠密的純林。

3塊樣地均采取均勻(網(wǎng)格法)取樣策略,為了得到清晰的克隆結(jié)構(gòu),對(duì)竹林年齡較大的樣地C 進(jìn)行了初步取樣間隔檢測(cè)。在C樣地選取20 m×20 m的小樣方進(jìn)行初步取樣檢測(cè),取樣間隔為0—10 m,經(jīng)過實(shí)驗(yàn)最終確定3個(gè)樣地選擇一致的取樣策略,即在10 m×10 m為單位的網(wǎng)格交叉點(diǎn)上取樣。由于A樣地為實(shí)生苗,在20 m×3 0m樣地中央設(shè)置了一塊1 m×1 m 的小樣地a,采取0—25 cm間隔取樣,共取樣31個(gè),研究實(shí)生苗的克隆生長(zhǎng)情況。3個(gè)樣地共計(jì)取樣256個(gè),其中樣地A 43個(gè),樣地B 70個(gè),樣地C 143個(gè)。所有采樣點(diǎn)均用GPS定位記錄坐標(biāo),取每個(gè)分株的新鮮幼嫩葉片裝入塑封袋中,并用變色硅膠干燥帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃保存。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取和檢測(cè)

用植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京,百泰克)提取巴山木竹的總DNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段大小,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度和濃度。所提取的DNA用ddH2O稀釋至25 ng/μL,于-20℃保存。

1.2.2 SSR引物和PCR擴(kuò)增

經(jīng)過初篩和復(fù)篩,決定選用8對(duì)巴山木竹SSR引物(loc2—loc8,loc10)來鑒定克隆(基因型)。8對(duì)引物的序列信息、退火溫度及其PCR擴(kuò)增條件詳見關(guān)于發(fā)展巴山木竹的微衛(wèi)星引物這一文獻(xiàn)[28]。PCR反應(yīng)在美國(guó)Bio-RAD公司生產(chǎn)的MyCycler Thermal Cycler #170- 9701EDU型PCR儀上進(jìn)行。所有PCR產(chǎn)物在ABI3730XL DNA 測(cè)序儀(Applied Biosystems,USA)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè),用GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems,USA)軟件讀取擴(kuò)增片段大小。

1.2.3 克隆的鑒別

樣地內(nèi)所有基因型相同的分株被認(rèn)為是同一個(gè)克隆(基株)[3,19]。使用POLYSAT 軟件的assignClones功能對(duì)3個(gè)樣地所有個(gè)體的基因型進(jìn)行分析,基因型相同的個(gè)體被分配到同一克隆組[30]。然而,由于巴山木竹為四倍體植物[28,31-32],為了確?？寺澐值臏?zhǔn)確性,需要確認(rèn)每個(gè)基因片段在該位點(diǎn)上出現(xiàn)的頻率。使用MAC-PR (Microsatellite DNA Allele Counting-Peak Ratios)方法[33]來核算每個(gè)位點(diǎn)基因片段出現(xiàn)的頻率,最終每個(gè)樣擴(kuò)增出的基因位點(diǎn)頻率將通過微衛(wèi)星峰圖的面積比來獲得。利用該方法獲得的每個(gè)位點(diǎn)在該基因型中出現(xiàn)的頻率可以是0、 0.25、0.5、 0.75或者是1, 這些頻率被作為特征被記入每個(gè)個(gè)體[28,34]。仔細(xì)比對(duì)相同基因型個(gè)體每個(gè)位點(diǎn)的頻率,最終基因型相同且位點(diǎn)基因頻率相同的個(gè)體被確認(rèn)為同一個(gè)克隆[28,34](如樣地中部分個(gè)體基因型為ABC, 等位基因C在該基因型中出現(xiàn)的頻率為0.5,即為ABCC,最終所有為ABCC的個(gè)體被確認(rèn)為是同一個(gè)克隆)。為了方便后續(xù)的數(shù)據(jù)分析,使用POLYSAT軟件轉(zhuǎn)化所有具有基因頻率特征的基因型數(shù)據(jù)為0 1 數(shù)據(jù)[30]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

鑒別出所有個(gè)體的克隆基因組之后,根據(jù)每個(gè)采樣點(diǎn)的坐標(biāo)信息繪制出克隆分布圖(圖1)。為了更清楚的了解克隆的大小和形狀,計(jì)算了樣地B和C克隆分布圖(圖1)中除去邊緣以及單樣克隆以外的每個(gè)克隆的面積a和最大長(zhǎng)寬比率rm。rm的值等于或大于1,rm的值越大,說明該克隆所有分株趨向于離散分布,rm的值越接近1,說明該克隆所有分株趨向于團(tuán)塊分布。

運(yùn)用不同基因型比率(G/N),Simpson多樣性指數(shù)(D)以及Fager指數(shù)(E)這3個(gè)指標(biāo)來分析3個(gè)樣地的克隆多樣性。這3個(gè)指標(biāo)的計(jì)算公式詳見參考文獻(xiàn)[2,10,35- 37]。D和E的范圍為0—1,D為0表示種群內(nèi)只有1個(gè)獨(dú)克隆,即所有樣品的基因型相同,D為1表示種群內(nèi)每個(gè)樣品為1個(gè)克隆,即每個(gè)樣品的基因型各不相同；E為0表示種群內(nèi)所有樣品為不同的克隆或者是有一個(gè)優(yōu)勢(shì)克隆而其它所有樣品為不同的克隆,E為1所有克隆的樣本是相同的[2,10,35- 37]。

為了說明各種群內(nèi)和種群間克隆的基因關(guān)系,運(yùn)用NTSYSPC 2.10[38]對(duì)所有克隆基因型進(jìn)行UPGMA非加權(quán)算術(shù)平均聚類分析(Unweighted pair-group method analysis)。為了進(jìn)一步說明3個(gè)種群間和種群內(nèi)的克隆基因關(guān)系,運(yùn)用GenAlEx 6.5 對(duì)3塊樣地的克隆基因型進(jìn)行了PCoA主坐標(biāo)分析 (Principal Coordinates Analysis)[39]。

運(yùn)用GenAlEx 6.5[39]軟件計(jì)算巴山木竹所有分株基因遺傳距離矩陣在相應(yīng)距離等級(jí)下的空間自相關(guān)系數(shù)r,分析其克隆結(jié)構(gòu)。在同一軟件下對(duì)所有個(gè)體遺傳距離的線性矩陣和地理距離之間的關(guān)系進(jìn)行Mantel檢測(cè)[39]。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴山木竹克隆結(jié)構(gòu)

2.1.1 不同巴山木竹種群克隆大小及其形狀

利用8對(duì)引物對(duì)3個(gè)巴山木竹樣地的256個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,共檢測(cè)到118個(gè)位點(diǎn)。 A、B和C 3個(gè)樣地均由多克隆組成,分別為31、10和8個(gè)克隆,并且沒有相同的基因型(圖1)。

A樣地中的小樣地a 取樣31個(gè)樣,檢測(cè)到了19個(gè)克??；10 m間隔的A樣地取樣12個(gè),檢測(cè)到克隆12個(gè)。小樣地a(1 m×1 m)中克隆面積均小于1 m2, 且從圖1中可以看出克隆內(nèi)的分株主要進(jìn)行了短距離的密集型延伸。

B樣地取樣70個(gè),檢測(cè)到了10個(gè)克隆。除去邊緣克隆B1、B4、B6、B7和B10外,B2、B3、 B5、B8和B9克隆面積和形狀不同。其中,B2、 B5、B8和B9這4個(gè)克隆的面積(a)較為接近在550—650 m2,而B3面積最小為250 m2(表 1和圖1)。 同時(shí),這4個(gè)克隆的最大長(zhǎng)寬比率(rm)值大小也較為接近,分別為2.36、2.76、2.17和2.36；而B3的rm值為4.00則略高于B2、 B5、B8和B9(表1)。結(jié)合B樣地克隆結(jié)構(gòu)分布圖可以得出: B2、B3、B5、B8和B9均趨向于團(tuán)塊分布(圖1)。

表1 樣地B和C 9個(gè)克隆參數(shù)

B2，B3, B5,B8,B9分別代表的是B樣地的5個(gè)不同克隆，即克隆B2，B3, B5,B8,B9;面積a的英文全拼： ;最大長(zhǎng)寬比率的英文全拼： ;Rxy，xy是R的下標(biāo)。

C樣地共143個(gè)樣,檢測(cè)到了8個(gè)克隆。除去邊緣克隆C2、C5、C6、C7和C8外,C1、C3和C4克隆面積和形狀各不相同。其中,C1和 C4克隆面積較大分別為2700 m2和3800 m2,而C3面積則遠(yuǎn)小于C1和 C4僅有600 m2(表 1和圖1)。C1、C3和C4rm值之間的大小差異較大,C1和 C4的rm值分別為3.59和2.11,而C3rm值則遠(yuǎn)高于C1和 C4為16.17(表1)。結(jié)合C樣地克隆結(jié)構(gòu)分布圖可以得出, C1和 C4趨向于團(tuán)塊分布,而C3趨向于離散分布(圖1)。

圖1 巴山木竹3個(gè)樣方的克隆空間分布Fig.1 Clonal structure in the three plots of Bashania fargesii inferred from Simple Sequence Repeat (SSR) fingerprintA：7齡巴山木竹克隆結(jié)構(gòu)圖,A1—A12：樣地A的12個(gè)克隆, 虛線樣框內(nèi)是小樣方a的放大,a1—a19： 小樣方a的19個(gè)克隆; B： ﹥30齡巴山木竹克隆結(jié)構(gòu)圖,B1—B10： 樣地B的10個(gè)克隆；C： ﹥60齡巴山木竹克隆結(jié)構(gòu)圖,C1—C8： 樣地C的8個(gè)克隆

綜上所述,隨著年齡的增長(zhǎng)3個(gè)樣地的克隆數(shù)量減少；從克隆大小來分析(不包括樣地邊緣的克隆),隨著年齡的增長(zhǎng)克隆面積增加(表 1和圖1)；結(jié)合rm值和各樣地克隆結(jié)構(gòu)分布圖分析(不包括樣地邊緣的克隆),A樣地中的小樣地a和B樣地各克隆趨向于團(tuán)塊狀分布,而C樣地克隆既有團(tuán)塊狀分布又有離散狀分布(表1和圖1)。

2.1.2 不同巴山木竹種群空間遺傳結(jié)構(gòu)

巴山木竹3個(gè)樣地所有分株的空間自相關(guān)分析結(jié)果如圖2所示。當(dāng)距離等級(jí)間隔為10 m時(shí), 3個(gè)樣地都存在顯著的正相關(guān)空間遺傳結(jié)構(gòu)。A、B和C 3個(gè)樣地所有分株在空間距離分別小于3.1、28、48m時(shí)存在顯著的正相關(guān)空間遺傳結(jié)構(gòu),X-軸截距分別為9.051、30.698和50.536,空間自相關(guān)系數(shù)r的取值范圍為0.1—0.167、0.008—0.703和0.006—0.735。 Mantel檢測(cè)顯示 3個(gè)樣地的不同克隆的基因遺傳距離和空間距離之間也存在正相關(guān)性 (A,Rxy=0.358,P﹤0.006; B,Rxy=0.529,P﹤0.001; C,Rxy=0.487,P﹤0.001)。因此,這兩種分析都支持 3個(gè)樣地在小尺度范圍內(nèi)存在明顯的克隆結(jié)構(gòu)。

圖2 A、B和C 3個(gè)樣地10m 等級(jí)下的空間自相關(guān)分析圖Fig.2 Spatial autocorrelograms from three plots A、B and C in distance class sizes of 10 mr 為空間自相關(guān)系數(shù), U和L分別表示不存在顯著性空間自相關(guān)遺傳結(jié)構(gòu)的95%置信區(qū)間的上限和下限

2.2 巴山木竹克隆多樣性分析

2.2.1 巴山木竹基因型多樣性

為了在同一水平上比較3樣地克隆多樣性指標(biāo)的變化,僅對(duì)10 m間隔取樣的樣品進(jìn)行了多樣性分析。A、B和C 3樣地的基因型比率(G/N)分別為1、0.14和0.055, Simpson多樣性指數(shù)(D)為1、0.876和0.744, Fager均勻度指數(shù)(E)為1、0.945和0.825。比較3個(gè)樣地各指標(biāo)可以發(fā)現(xiàn),巴山木竹的基因型比率(G/N)、Simpson多樣性 (D) 和Fager均勻度均隨著該竹林年齡的增加而下降。

圖3 3個(gè)樣地的49個(gè)克隆UPGMA聚類分析圖Fig.3 UPGMA clustering analysis of the 49 clones in the three plotsA1—A12:A樣地的12個(gè)無性系,a1—a19:A樣地中小樣地a的19個(gè)無性系；B1—B10:B 樣地的10個(gè)無性系； C1—C8:C樣地的8個(gè)無性系

2.2.2 不同齡級(jí)巴山木竹種群聚類和主坐標(biāo)PCoA分析

3個(gè)樣地的克隆聚類結(jié)果如圖3所示,各樣地內(nèi)克隆之間聚類明顯,表現(xiàn)出較高的遺傳相似性,總體上來自同一樣地的克隆被聚為一類,但C樣地的C4、C7和C8優(yōu)先于C樣地的其他克隆同樣地B的克隆聚在一起。3個(gè)樣地49個(gè)克隆基因型主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示(圖4)：3個(gè)樣地的大多數(shù)克隆基因型可以被清楚的分離,僅在C樣地的C4、C7和C8和B樣地部分區(qū)域重合,這與聚類分析有著較為一致的結(jié)果。

圖4 3個(gè)樣地49個(gè)克隆主坐標(biāo)(pcoA)分析圖Fig.4 Principal coordinates analysis (pcoA) of the 49 clones in the three plotsA1—A31： A樣地的31個(gè)無性系, B1—B10： B樣地的10個(gè)無性系, C1—C8： C樣地的8個(gè)無性系

3 討論

3.1 不同年齡巴山木竹的克隆結(jié)構(gòu)

從3個(gè)樣地的克隆大小和數(shù)量來分析,隨著年齡的增長(zhǎng)巴山木竹克隆面積逐漸增加,數(shù)量逐漸減少。從7齡竹林到﹥30齡的成年竹林克隆數(shù)量急劇減少面積急劇增大,而從﹥30齡到﹥60齡竹林克隆數(shù)量減少不明顯,面積增加的倍數(shù)同前者相比也少的多。A樣地為實(shí)生苗樣地,在大尺度取樣下(10 m×10 m),未檢測(cè)到克隆的延伸；在小尺度取樣下(0—25 cm), 由于幼苗稠密,基株無法進(jìn)行更長(zhǎng)距離的延伸,克隆內(nèi)的分株主要進(jìn)行了短距離的密集型延伸(圖1a)。分析B樣地的克隆分布圖和各克隆的rm值可知,除去樣地邊緣的克隆外,B2、 B5、B8和B9四個(gè)克隆為團(tuán)塊狀分布,B3由于處于這4個(gè)團(tuán)塊克隆的包圍下,有從團(tuán)塊狀向離散狀發(fā)展的趨勢(shì)。分析C樣地的克隆分布圖和各克隆的rm值可知,兩個(gè)較大克隆C1和C4成團(tuán)塊狀,而克隆C3成離散狀。一般認(rèn)為,克隆植物會(huì)優(yōu)先占有有利于自己生存的環(huán)境,在生長(zhǎng)環(huán)境良好的情況下,更容易形成較為均勻的密集型克隆[40]。然而,Inghe比較了游擊型和密集型克隆植物的競(jìng)爭(zhēng)力,發(fā)現(xiàn)當(dāng)干擾率低的時(shí)候密集型克隆植物占優(yōu)勢(shì),而干擾率較高時(shí)游擊型植物占優(yōu)勢(shì)[41]。因此,B樣地中B3處于B2, B5,B8和B9 4個(gè)團(tuán)塊克隆包圍中,受到了一定的壓迫,但由于空間和面積的原因仍然為團(tuán)塊狀。C樣地中,C3受到了C1和C4兩個(gè)特大克隆的壓迫,呈現(xiàn)為離散狀。由于巴山木竹為復(fù)軸混生型的竹子,同時(shí)具有合軸叢生和單軸散生的兩種類型的根莖,可推測(cè)出,當(dāng)克隆基株受到強(qiáng)大的壓迫時(shí),可能進(jìn)行更多的單軸和長(zhǎng)距離的克隆延伸,從而呈現(xiàn)為離散狀。

3.2 不同年齡巴山木竹的空間遺傳結(jié)構(gòu)

從A樣地的自相關(guān)分析結(jié)果看,在3.1 m范圍內(nèi),所有個(gè)體表現(xiàn)為正相關(guān)空間遺傳結(jié)構(gòu),但這一相關(guān)系數(shù)r的范圍為0.1—0.167,說明在該范圍內(nèi)進(jìn)行較長(zhǎng)距離延伸的克隆還較少,這同Mental檢測(cè)結(jié)果P﹤0.006時(shí)才有相關(guān)性是一致的。在小尺度取樣下(0—25 cm),檢測(cè)到了部分相同的克隆分株,這說明巴山木竹在7齡時(shí)已經(jīng)進(jìn)行了克隆延伸,但僅限于短距離密集型的延伸。由此可見,對(duì)于較小年齡的巴山木竹林,應(yīng)采取較小尺度的取樣策略才能清晰地闡明克隆結(jié)構(gòu)。而本研究中B和C樣地的10 m間隔取樣下的空間分析結(jié)果同Mental檢測(cè)結(jié)果一致顯示(P<0.001),可以清楚的得到克隆結(jié)構(gòu),說明取樣策略是合理的。

雖然單獨(dú)的空間自相關(guān)分析數(shù)據(jù)不能揭示真實(shí)的克隆結(jié)構(gòu)[42],但是在同一距離10 m等級(jí)下比較3塊樣地的空間自相關(guān)分析數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)3塊樣地的正相關(guān)空間遺傳結(jié)構(gòu)的距離、X-軸截距隨著年齡的增加而增加,空間自相關(guān)系數(shù)r的取值范圍隨著年齡的增加也在擴(kuò)大。為了保證數(shù)據(jù)的可靠性,還做出了5、15、20 m不同距離等級(jí)的空間自相關(guān)分析圖,正如 Peakall 等闡述的那樣,改變距離等級(jí)X-軸截距也會(huì)隨之改變[42]。但是,比較各距離等級(jí)下3個(gè)樣地的相關(guān)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)各指標(biāo)的變化和10 m距離等級(jí)下的改變趨勢(shì)相同。當(dāng)一個(gè)種群被檢測(cè)到顯著的正相關(guān)空間結(jié)構(gòu)時(shí),X-軸截距指的是基因斑塊平均最短長(zhǎng)度的相對(duì)空間距離[42]。由此可見,隨著年齡的增長(zhǎng)巴山木竹克隆的面積和規(guī)模在不斷地?cái)U(kuò)大,同一克隆的分株數(shù)量增加,在均勻取樣情況下,正相關(guān)空間遺傳結(jié)構(gòu)距離范圍內(nèi)取到具有相同基因型可能性越大。

3.3 不同年齡巴山木竹克隆多樣性的比較及其原因分析

本研究中B和C樣地的基因型比率(G/N)遠(yuǎn)低于其他竹子的值 (Sasasenanensis,G/N=0.43;B.fangiana,G/N=0.9583)[2,10]。采樣規(guī)模和間隔的大小都會(huì)影響巴山木竹的基因型比率[2]。3個(gè)樣地選擇相同的采樣間隔10 m, 比之前兩種竹子的50 m和30 m都要小,這可能是該值遠(yuǎn)低于其他竹子的原因。比較3個(gè)樣地巴山木竹的Simpson多樣性指數(shù)(D)、基因型比率(G/N)和Fager均勻度指數(shù)(E),各指標(biāo)值隨著竹林年齡的增加而降低。其中, A樣地與B和C的基因型比率(G/N)差別最大,說明巴山木竹幼苗期基因型比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成年的竹林。比較樣地A、B和C 的Simpson多樣性指數(shù)(D) 和Fager均勻度(E),發(fā)現(xiàn)各指標(biāo)雖略有降低,但仍然保持了較高的克隆多樣性和基因型均勻分布度,說明了巴山木竹成年后隨著年齡的增長(zhǎng)克隆多樣性和基因型均勻分布度仍然較高。這和各樣地克隆數(shù)量和面積隨著年齡變化趨勢(shì)分析是一致的。

從幼苗更新模式來看,巴山木竹為初始苗補(bǔ)充型(ISR,Initial Seedling Recruitment) 物種[8-9]。巴山木竹大約70—75a甚至更長(zhǎng)時(shí)間開花結(jié)實(shí)[20],結(jié)實(shí)后可產(chǎn)生大量的幼苗,在7齡竹林的調(diào)查過程中,我們統(tǒng)計(jì)了每平方米的實(shí)生苗數(shù)可高達(dá)130株。從A樣地來看,實(shí)生苗的克隆多樣性很高,只有在0—25 cm更小尺度取樣下,才檢測(cè)到了不同分株屬于同一克隆的基因型。關(guān)于克隆多樣性隨時(shí)間變化的研究,可以分為兩類：一些研究認(rèn)為,克隆植物基因型多樣性會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而急劇的降低[43-44]；相反的,也有一些研究認(rèn)為不會(huì)降低[45-46]。然而,從本實(shí)驗(yàn)分析來看,巴山木竹幼苗初始補(bǔ)充量很大,而且基因型多樣性很高,隨著樣地年齡的增長(zhǎng),分株和基株間的競(jìng)爭(zhēng)排斥或死亡導(dǎo)致克隆多樣性略有降低,但仍然維持在一定的水平上,這說明巴山木竹的有性生殖對(duì)其克隆基因型多樣性貢獻(xiàn)很大。此外,Ma等和馬青青等發(fā)現(xiàn)冷箭竹(Bashaniafangiana)和秦嶺箭竹(Fargesiaqinlingensis)的初始補(bǔ)充苗都對(duì)克隆多樣性有極大貢獻(xiàn)[10-11]。

另外,本文在聚類和主坐標(biāo)分析中,發(fā)現(xiàn)了不同樣地少數(shù)克隆基因型的重疊和聚集,說明不同巴山木竹種群之間存在著基因流動(dòng)和近似的克隆起源。竹子花粉較輕,無粘性,為風(fēng)媒傳粉植物,其花粉和種子可在外力情況下可以進(jìn)行長(zhǎng)距離擴(kuò)散[11,47],因此有待進(jìn)一步開展不同巴山木竹種群之間的基因流動(dòng)研究。

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Clonal structure ofBashaniafargesiipopulations at different ages

YU Ge1, LONG Fenglai2, LIU Jianjun3,*, MA Qingqing1, KANG Yongxiang1, HUANG Jian1, CAO Qing4

1CollegeofForestry,NorthwestAgriculture&ForestryUniversity,Yangling712100,China2YangLingVocationalTechnologyCollege,Yangling712100,China3CollegeofLandscapeArchitectureandArts,NorthwestAgriculture&ForestryUniversity,Yangling712100,China4ShaanxiFopingNationalNatureReserve,Foping723400,China

Bamboos are typical clonal plants commonly used as food for giant pandas. Studies of the clonal structure of typical bamboo populations are of both theoretical and practical importance for bamboo forest production and tending. Studies have attempted to predict its population succession for the protection of giant pandas. In this study, simple sequence repeat fingerprints were used to reveal the clonal structure and diversity ofBashaniafargersiipopulations at three different genet ages (A 7 years, B > 30 years and C > 60 years). We described how the clonal structure ofB.fargersiipopulations at different genet ages established and developed at the small scale. We amplified 118 microsatellite locus using 8 selective primer pairs. A total of 49 clones were identified from 256 leaf samples collected from three populations, among which 31 clones were detected in plot A, 10 clones in plot B, and 8 clones in plot C. The size of clones in the three plots increased and the number of clones decreased with population aging. The spatial distribution pattern of clones in plots A and B exhibited a clumped distribution, while plot C showed two different patterns with simultaneously clumped and discrete distributions. The results showed that the genet generally formed a clumped distribution pattern during the seeding stage. The clones may expand into either the more sympodial type of ramets or short-distance clones, indicating that clonal propagation restricts dense seedling growth. However, with increasing clone size and genet age, compound axis mixedB.fargesiimay expand into either the more monopodial type of ramets or long-distance clones representing a discrete distribution pattern when the genet are pressured by other strong clones. In addition, in our study, both the Mantel test and spatial autocorrelation analysis supported the significant presence of positive spatial clonal structures in three plots at the small-scale level. Spatial autocorrelation analysis also showed that the positive spatial genetic structure distance of the three plots in the 10 m distance class were 3.1, 28, 48 m,X-intercepts were 9.051, 30.698, and 50.536, and scope of spatial autocorrelation coefficientsrwere 0.1—0.167, 0.008—0.703, and 0.006—0.735, respectively. Our results showed that the size and scale of clones increased with genetic aging. Additionally, the number of ramets in the same clone increased under uniform sampling conditions, indicating that more samples with the same genotype can be collected with a positive spatial genetic structure distance. In our study, the distinguishable genotypes (G/N) from populations A, B, and C were 1, 0.14, and 0.055 and the Simpson′s indices of diversity (D) were 1, 0.876, and 0.744, respectively. This result revealed that the distinguishable genotypes at the seeding stage (A 7 years) was much greater than that at the adult stage (B 30 years and C 60 years). Although the genotypic diversity of clonal populations reduced with genet aging, because of initial seedling recruitment, the value remained high. The unweighted pair-group method and principal component analysis demonstrated that clones in the same plot were always classified into the same clade. However, a few clones from different plots exhibited aggregation and overlap during analysis. In conclusion, we demonstrated that gene flow and an approximate clone origin might exist in different populations.

Bashaniafargesii; clonal structure; clonal diversity

國(guó)家“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域科技計(jì)劃課題(2015BAD07B0203)

2016- 04- 19; 網(wǎng)絡(luò)出版日期:2017- 03- 02

10.5846/stxb201604190733

*通訊作者Corresponding author.E-mail: ljj@nwsuaf.edu.cn

余鴿,龍鳳來,劉建軍,馬青青,康永祥,黃建,曹慶.不同年齡巴山木竹種群克隆結(jié)構(gòu).生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(14):4743- 4753.

Yu G, Long F L, Liu J J, Ma Q Q, Kang Y X, Huang J, Cao Q.Clonal structure ofBashaniafargesiipopulations at different ages.Acta Ecologica Sinica,2017,37(14):4743- 4753.