張慶悅

(喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院，新疆 喀什 844400)

趨化因子CXCL12對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制研究

張慶悅

(喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院，新疆 喀什 844400)

目的 研究趨化因子CXCL12對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制。方法 采用RT-PCR檢測20例上皮性卵巢癌組織、卵巢癌細(xì)胞株CAOV3、血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC和20例正常卵巢組織中CXCL12的mRNA表達(dá)及卵巢癌腹膜后淋巴組織和輸卵管平滑肌組織中CXCL12的表達(dá)，ELISA法檢測20例卵巢癌患者腹水中趨化因子CXCL12表達(dá)水平，比較不同濃度CXCL12對(duì)CAOV3及HUVEC細(xì)胞遷移能力及其表面相關(guān)黏附分子表達(dá)水平的影響。結(jié)果 20例卵巢癌組織、卵巢細(xì)胞CAOV3、內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、轉(zhuǎn)移的淋巴組織中CXCL12mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.41±1.05、1.92±1.17、1.73±1.12、1.68±1.13，而正常組未檢出，各組比較有顯著性差異(F=2.907，P=0.032)。20例卵巢癌患者腹水中有19例檢測到趨化因子CXCL12，檢出率95.0%，CXCL12水平為(6 552.7±476.5)pg/mL。與對(duì)照組相比，CAOV3細(xì)胞經(jīng)CXCL12處理后，與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力相對(duì)粘附率由(22.65±2.3)%上升至(51.47±2.7)%(t=4.696，P<0.05)。卵巢癌細(xì)胞株CAOV3與內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中，加入CXCL12處理后，經(jīng)Tramswell法檢測，結(jié)果顯示細(xì)胞數(shù)顯著增加(t值分別為3.326、3.897、3.215、3.168，均P<0.05)，提示細(xì)胞的侵襲與遷移能力明顯增強(qiáng)，其中濃度為100ng/mL的趨化活性最高，CAOV3 與HUVEC細(xì)胞趨化指數(shù)分別為4.0±1.5、4.3±1.7，對(duì)照組趨化指數(shù)分別為1.1±0.5、1.2±0.6，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.687、2.938，均P<0.05)。結(jié)論 趨化因子CXCL12通過調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)而提高CAOV3、HUVEC細(xì)胞活性，參與卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

卵巢癌；趨化因子；細(xì)胞侵襲；細(xì)胞轉(zhuǎn)移；配體

卵巢癌是婦科常見女性生殖器官惡性腫瘤，發(fā)病率在婦科腫瘤中排第三位，但致死率排首位，治療失敗和致死率高的原因主要是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜連續(xù)的過程，具有高度的組織性和器官選擇性，雖然既往的研究證明有多種因素與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]，但其分子機(jī)制尚不清楚。趨化因子CXCL12(stromal cell derived factor-12，CXCL12)是趨化因子蛋白家族中的一種小分子細(xì)胞因子，對(duì)淋巴細(xì)胞有強(qiáng)烈的趨化作用。多數(shù)研究表明，CXCL12及其配體CXCR4與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2-3]，本研究旨在分析趨化因子CXCL12及其配體CXCR4對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，并探討卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，以期為卵巢癌的治療提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1細(xì)胞株

卵巢癌細(xì)胞株CAOV3購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)寶藏中心，血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC購自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心。

1.1.2臨床樣本

選取2015年6月至2016年6月喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院收治的20例卵巢癌患者，均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為上皮性卵巢癌，年齡28～68歲，平均年齡(51.5±12.7)歲，包括漿液性癌13例，黏液性癌7例。對(duì)照組為同期收治的良性卵巢腫瘤患者20例，經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為良性卵巢腫瘤，年齡25～54歲，平均年齡(42.5±10.6)歲。

1.2方法

1.2.1樣本采集

在患者手術(shù)時(shí)收集其卵巢癌組織、盆腔和腹膜后淋巴結(jié)組織及輸卵管平滑肌組織，對(duì)照組為良性卵巢腫瘤患者切除的正常卵巢組織，將收集的樣本均置于液氮中保存，同時(shí)收集卵巢癌患者腹水(注意不得有血液污染)，置于無菌的離心管中，-20℃保存待檢。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)

CAOV3和HUVEC細(xì)胞常規(guī)接種于RPMI-1640培養(yǎng)基中(含10%小牛血清、100μg/mL鏈霉素及100IU/mL青霉素)，然后置5%CO2培養(yǎng)箱中，濕度飽和，37℃下培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞密度和生長情況傳代。

1.2.3 RT-PCR檢測卵巢癌細(xì)胞CXCL12mRNA表達(dá)水平

將收集到的腫瘤組織、輸卵管平滑肌組織、轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織及正常卵巢組織勻漿，加入CAOV3和HUVEC細(xì)胞，用TRlzol試劑提取組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用PCR擴(kuò)增，同時(shí)擴(kuò)增加內(nèi)參照β-actin。擴(kuò)增長度為227bp，CXCL12引物序列為，正義鏈：5’-CCGCGCTCTGCCTCAGCGACGGGAAG-3’。擴(kuò)增反應(yīng)條件：溫度94℃，變性時(shí)間30s，55℃退火30s，70℃延伸30s，以上操作循環(huán)33次后，再70℃延伸10min后反應(yīng)結(jié)束。

1.2.4卵巢癌腹水趨化因子CXCL12水平檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定法檢測卵巢癌患者腹水趨化因子CXCL12水平，操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5細(xì)胞粘附試驗(yàn)

將RPMI1640培養(yǎng)基加入到96孔板中，每孔50μL，然后加20μL培養(yǎng)液，PBS沖洗后加入處理好細(xì)胞，每組同時(shí)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃孵育1h，PBS沖洗，每孔加0.04%結(jié)晶紫50μL染色，光鏡(×200)下觀察。每孔中加100μL10%冰乙酸，10min后用多功能酶標(biāo)儀檢測吸光度A值。

1.2.6細(xì)胞侵襲與遷移實(shí)驗(yàn)

首先將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，30μL細(xì)胞外基質(zhì)膠涂Tramswell小室濾膜內(nèi)表面，放超凈臺(tái)下干燥過夜，然后用含0.1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的RPMI-1640培養(yǎng)基水化，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組，第一組上室加10μL細(xì)胞懸液，下室加500μL含100ngCXCL12的完全培養(yǎng)基，第二組在第一組的基礎(chǔ)上加CXCL12封閉單克隆抗體20μL，第三組為空白對(duì)照組。置5%CO2培養(yǎng)箱中37℃下孵育16h。使用帶膜的小室制片。每組設(shè)3個(gè)平行濾膜，每膜隨機(jī)取5個(gè)視野。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)同侵襲實(shí)驗(yàn)，區(qū)別在于濾膜內(nèi)表面不加細(xì)胞外基質(zhì)膠。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩個(gè)樣本之間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測CXCL12mRNA表達(dá)水平

20例卵巢癌組織、卵巢細(xì)胞CAOV3、內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、轉(zhuǎn)移的淋巴組織中，CXCL12mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.41±1.05、1.92±1.17、1.73±1.12、1.68±1.13，而在正常組中未檢出，各組比較有顯著性差異(F=2.907，P=0.032)，電泳見圖1。

注：M：100bpMarker，1：正常卵巢組織，2：卵巢癌組織，3：CAOV3，4：HUVEC，5：淋巴組織。

圖1 CXCL12表達(dá)電泳圖

Fig. 1 Expression electrophoregram of CXCL12

2.2卵巢癌腹水趨化因子CXCL12水平

在20例卵巢癌患者腹水中，有19例檢測到趨化因子CXCL12，檢出率95.0%，CXCL12水平為(6 552.7±476.5)pg/mL。

2.3細(xì)胞外基質(zhì)與腫瘤細(xì)胞的粘附能力

與對(duì)照組相比，CAOV3細(xì)胞經(jīng)CXCL12處理后，與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力相對(duì)黏附率由(22.65±2.3)%上升至(51.47±2.7%)(t=4.696，P<0.05)，見圖2。

注：A:對(duì)照組，B：經(jīng)CXCL12處理后CAOV3細(xì)胞。

圖2 細(xì)胞黏附試驗(yàn)

Fig. 2 Cell adhesion test

2.4趨化因子CXCL12可提高癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力

卵巢癌細(xì)胞株CAOV3與內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中，加入CXCL12處理后，經(jīng)Tramswell法檢測，結(jié)果顯示細(xì)胞數(shù)均顯著增加(t值分別為3.326、3.897、3.215、3.168，均P<0.05)，提示細(xì)胞的侵襲與遷移能力明顯增強(qiáng)，見圖3和圖4，其中濃度為100ng/mL的趨化活性最高，CAOV3 與HUVEC細(xì)胞趨化指數(shù)分別為4.0±1.5、4.3±1.7，對(duì)照組趨化指數(shù)分別為1.1±0.5、1.2±0.6，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.687、2.938，均P<0.05)。

圖3 趨化因子CXCL12對(duì)卵巢癌細(xì)胞的遷移的影響

Fig. 3 Influence of chemokines CXCL12 on migration of ovarian cancer cells

圖4 趨化因子CXCL12對(duì)卵巢癌細(xì)胞的侵襲的影響

Fig. 4 Influence of chemokines CXCL12 on invasion of ovarian cancer cells

3討論

3.1趨化因子CXCL12在癌癥轉(zhuǎn)移中的作用

癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是卵巢癌治療失敗和死亡率高的主要原因，也是惡性腫瘤重要的臨床特征，如何有效控制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是治療的關(guān)鍵，對(duì)患者的預(yù)后也十分關(guān)鍵。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程是復(fù)雜的，受多種因素的影響，不僅與癌細(xì)胞本身有關(guān)，也與癌細(xì)胞所處微環(huán)境及信號(hào)通道的變化密切相關(guān)，因此，控制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是提高患者生存期的關(guān)鍵。近年來的研究表明，趨化因子CXCL12在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)化等過程中起重要作用，CXCL12與其受體CXCR4結(jié)合后，參與細(xì)胞的生長、分化、凋亡腫瘤的轉(zhuǎn)移等多種生理病理的過程，具有廣泛的生物學(xué)作用[4-5]，逐漸成為研究的熱點(diǎn)。

趨化因子是蛋白家族中的一種具有化學(xué)趨化性的細(xì)胞因子，分為四大類：CXC、CC、C和CX3C，多數(shù)癌細(xì)胞表達(dá)CXC和CC，卵巢癌腹水癌細(xì)胞表達(dá)CXCR4，同時(shí)也有CXCL12。Miwa等[6]研究證實(shí)，CXCL12/ CXCR4與卵巢上皮癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且有超過80%的卵巢癌組織中有CXCL12的表達(dá)，在95%卵巢癌患者腹水中檢測到CXCL12。本研究共對(duì)20例卵巢癌患者腹水進(jìn)行CXCL12水平檢測，其中有95.0%的患者中檢測CXCL12，與既往研究結(jié)果一致。Yang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，正常卵巢上皮細(xì)胞中沒有CXCL12表達(dá)，而卵巢癌組織中高表達(dá)，本研究也發(fā)現(xiàn)癌組織、卵巢細(xì)胞CAOV3、內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、轉(zhuǎn)移的淋巴組織中CXCL12mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.41±1.05、1.92±1.17、1.73±1.12、1.68±1.13，而正常組未檢出，各組比較有顯著性差異(P=0.032)。癌性腹水和重組CXCL12均可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞遷移，CXCL12與其受體作用后，誘發(fā)細(xì)胞定向性侵襲、遷移和血管生成，作用過程與癌細(xì)胞侵襲機(jī)制一致。

3.2趨化因子CXCL12在癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力中的作用

血管生成的增加是惡性腫瘤病情進(jìn)展的一個(gè)重要標(biāo)志，CXCL12可直接刺激腫瘤原發(fā)灶內(nèi)及其外周組織中新生血管生成。此外CXCL12還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并通過其間接抵抗調(diào)亡的作用來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育[8]。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌細(xì)胞株CAOV3與內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中，加入CXCL12處理后，經(jīng)Tramswell法檢測，結(jié)果顯示細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，提示細(xì)胞的侵襲與遷移能力明顯增強(qiáng)，其中濃度為100ng/mL的趨化活性最高，CAOV3 與HUVEC細(xì)胞趨化指數(shù)分別為4.0±1.5、4.3±1.7，對(duì)照組趨化指數(shù)分別為1.1±0.5、1.2±0.6，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。趨化因子CXCL12調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的黏附能力主要通過改變腫瘤細(xì)胞及其外基質(zhì)、基底膜的粘附能力，進(jìn)而促使腫瘤細(xì)胞更易于向外遷徙[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，CAOV3細(xì)胞經(jīng)CXCL12處理后，與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力相對(duì)黏附率由22.65±2.3%上升至51.47±2.7%(P<0.05)，以上結(jié)果進(jìn)一步表明CXCL12 與卵巢癌的侵襲、遷移密切相關(guān)。

綜上所述，趨化因子CXCL12與卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移密切相關(guān)，作用機(jī)制可能是通過調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的粘附能力、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，提高CAOV3、HUVEC細(xì)胞活性，參與卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

[1]鄭福利,張穎,趙亞寧,等. S100A6 siRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J]. 中國婦幼健康研究,2014,25(1):48-51.

[2]尹東,張佐,高素,等. 趨化因子受體CXCR4及其配體CXCL12在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和遷移中的作用[J]. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2013,32(1):8-12.

[3]李青,汪艷,張曦,等. 卵巢腫瘤干細(xì)胞中趨化因子的表達(dá)與細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系[J]. 中國當(dāng)代醫(yī)藥,2012,19(16):10-12.

[4]Messina-Graham S, Broxmeyer H.SDF-1/CXCL12 modulates mitochondrial respiration of immature blood cells in a bi-phasic manner[J]. Blood Cells Mol Dis,2016,58:13-18.

[5]Clatot F,Cornic M, Berghian A,etal. CXCL12 and CXCR4, but not CXCR7, are primarily expressed by the stroma in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Pathology,2015,47(1):45-50.

[6]Miwa Y, Hayashi T, Suzuki S,etal. Up-regulated expression of CXCL12 in human spleens with extramedullary haematopoiesis[J]. Pathology,2013,45(4):408-416.

[7]Yang L, Wang M, Guo Y Y,etal. Systemic inflammation induces anxiety disorder through CXCL12/CXCR4 pathway[J]. Brain Behav Immun,2016,56:352-362.

[8]Bagheri V, Hassanshahi G, Mirzaee V,etal. CXC chemokine CXCL12 tissue expression and circulating levels in peptic ulcer patients with Helicobacter pylori infection[J]. Cytokine,2016,85:1-4.

[9]Vitiello L, Ferraro E, De Simone S,etal. CXCL12 prolongs naive CD4+ T lymphocytes survival via activation of PKA, CREB and Bcl2 and BclXl up-regulation[J]. Int J Cardiol,2016,224:206-212.

[專業(yè)責(zé)任編輯：楊文方]

EffectofchemokineCXCL12oninvasionandmetastasisofovariancancercellsanditsmechanism

ZHAGNQing-yue

(FirstPeople’sHospitalofKashgar,XinjiangKashgar844400,China)

Objective To study the effect of chemokine stromal cell derived factor-12 (CXCL12) on invasion and metastasis of ovarian cancer cells and its mechanism. Methods Expression of mRNA of CXCL12 in 20 cases of epithelial ovarian cancer tissue, ovarian cancer cell line CAOV3, vascular endothelial cell line HUVEC and 20 normal ovarian tissues and expression of CXCL12 in ovarian cancer retroperitoneal lymphoid tissue and oviduct smooth muscle tissue were detected by RT-PCR. Levels of chemokine CXCL12 in ascites of 20 patients with ovarian cancer were detected by ELISA. Effects of different concentrations of CXCL12 on migration ability of CAOV3 and HUVEC cells and the expression of surface-related adhesion molecules were compared. Results CXCL12 mRNA relative expression amount in 20 cases of ovarian cancer tissue, ovarian cells CAOV3, endothelial cells HUVEC and invaded lymph tissues was 2.41±1.05, 1.92±1.17, 1.73±1.12 and 1.68±1.13, respectively, which was not found in normal group, and difference between groups was significant (F=2.907,P=0.032). Chemokine CXCL12 was detected in ascites of 19 cases in 20 cases of ovarian cancer, with detection rate of 95.0%, and CXCL12 level was 6 552.7±476.5pg/mL. Compared with control group, relative adhesion rate of CAOV3 cells processed by CXCL12 increased to 51.47±2.7% from 22.65±2.3% (t=4.696,P<0.05). After ovarian cancer cell lines CAOV3 and endothelial cells HUVEC were processed with CXCL2, significant increase in cell number was detected by Tramswell method (tvalue was 3.326, 3.897, 3.215 and 3.168, respectively, allP<0.05), indicating significant increase in cell invasion and migration ability. Chemotactic activity under concentration of 100ng/mL was highest. Cell chemotactic index of CAOV3 and HUVEC was 4.0±1.5 and 4.3±1.7, respectively, which was 1.1±0.5 and 1.2±0.6, respectively in control group, and difference was statistically significant (tvalue was 2.687 and 2.938, respectively, bothP<0.05).Conclusion Through regulating adhesion, invasion and migration ability of ovarian cancer cells and increasing activity of CAOV3 and HUVEC cells, chemokine CXCL12 participates in the invasion and metastasis of ovarian cancer cells.

ovarian cancer; chemokine; cell invasion; cell metastasis; ligand

2017-06-21

張慶悅(1971-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.07.013

R771.7

[文章編號(hào)]1673-5293(2017)07-0790-03