岳川，曹紅利，郝心愿，郭玉瓊，葉乃興，王新超*，楊亞軍*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)烏龍茶協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 310008

茶樹CsASR基因的克隆及其表達(dá)分析

岳川1,2，曹紅利1,2，郝心愿2，郭玉瓊1，葉乃興1，王新超2*，楊亞軍2*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)烏龍茶協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 310008

逆境脅迫影響茶樹生長(zhǎng)發(fā)育及茶葉品質(zhì)，ASR（abscisic acid, stress, ripening-induced）基因在植物抗逆響應(yīng)中具有重要功能。本研究以龍井43品種茶樹為材料，從中克隆了CsASR基因的全長(zhǎng)cDNA序列、基因組序列及其啟動(dòng)子序列，分析了該基因的生物信息學(xué)特征及在組織間和不同脅迫處理下的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，CsASR的cDNA序列全長(zhǎng)875 bp，含有546 bp的ORF序列，編碼181個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量19.89 kD，理論等電點(diǎn) 5.69；CsASR蛋白結(jié)構(gòu)序列中 74.5%的序列為無(wú)序結(jié)構(gòu)，是一種無(wú)序蛋白；CsASR的 C-端含有ABA/WDS功能結(jié)構(gòu)域，主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中；茶樹CsASR與海棗的ASR相似性最高，為87%，而在進(jìn)化樹中與棗的關(guān)系最近。CsASR基因含2個(gè)外顯子，第1個(gè)外顯子長(zhǎng)363 bp，第2個(gè)外顯子長(zhǎng)183 bp，內(nèi)含子較大為2 750 bp，內(nèi)含子中含7種簡(jiǎn)單重復(fù)序列和2種DNA轉(zhuǎn)座子序列。克隆獲得起始密碼子ATG上游2 554 bp的啟動(dòng)子區(qū)序列，該啟動(dòng)子上含有干旱、低溫、高溫以及ABA等相關(guān)的順式作用元件。CsASR在根中的表達(dá)量最低；ABA抑制 CsASR的表達(dá)，而干旱、NaCl和低溫脅迫能夠顯著上調(diào) CsASR的表達(dá)。表明CsASR基因可能與茶樹抗逆密切相關(guān)。

茶樹；ASR基因；逆境脅迫；基因克隆

逆境脅迫，如干旱、低溫等嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)。植物在遭受逆境脅迫時(shí)，能夠誘導(dǎo)逆境響應(yīng)基因表達(dá)，適應(yīng)不利的環(huán)境條件。ASR（abscisic acid, stress, ripening-induced）基因是在植物中新發(fā)現(xiàn)的一種逆境響應(yīng)特異基因。從Iusem等[1]于1993年發(fā)現(xiàn)ASR基因到目前為止，大量的研究顯示，ASR基因在植物逆境脅迫響應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中都有重要的作用。ASR是一類由少數(shù)多基因家族編碼的小蛋白（300個(gè)氨基酸以下），編碼蛋白分子量在11.0～33.0 kD。其蛋白富含組氨酸、谷氨酸和賴氨酸，具有較高的親水性，這對(duì)其在逆境脅迫下的作用發(fā)揮起關(guān)鍵作用[1-2]。它屬于ABA/WDS蛋白家族中一類特異的蛋白亞家族，該家族蛋白與植物抵御滲透脅迫等逆境響應(yīng)密切相關(guān)，ASR的 C-端含有保守的ABA/WDS功能結(jié)構(gòu)域，是 ASR蛋白的重要結(jié)構(gòu)特征。

鑒于ASR在植物中的重要功能，目前，多種植物中的 ASR基因已被鑒定并開展了較深入的研究。大部分植物中的 ASR基因家族成員主要在5個(gè)左右，如番茄中含有5個(gè)[3]，蘋果中有5個(gè)[4]，玉米中最多為9個(gè)[5]，而在擬南芥中沒(méi)有發(fā)現(xiàn) ASR同源基因?；蚬δ苎芯匡@示，ASR既可以作為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活基因表達(dá)，也能夠在胞質(zhì)中作為分子伴侶起作用[6-11]。大量研究表明，在擬南芥植物中過(guò)表達(dá) ASR基因能夠提高植物對(duì)低溫、干旱、高鹽等非生物及多種病害的抵御能力。Virlouvet等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在缺水條件下 ZmASR1能夠影響支鏈氨基酸的生物合成等代謝，進(jìn)而提高玉米的籽粒產(chǎn)量。Saumonneau等[12]和 Jia等[6]的研究顯示，ASR參與 ABA和糖信號(hào)介導(dǎo)的植物生長(zhǎng)發(fā)育。Arenhart等[9,13-14]的一系列研究表明，OsASR5在水稻抵御鋁毒害中具有重要的功能。Sun等[15]最新研究發(fā)現(xiàn) 1個(gè)在香蕉雌花中特異表達(dá)的MaASR基因，過(guò)表達(dá)該基因延遲轉(zhuǎn)基因植株的開花時(shí)間。從以上研究結(jié)果可以看出，ASR在植物中具有廣泛的功能，該基因在植物抗逆等生理活動(dòng)中具有廣闊的研究前景和應(yīng)用價(jià)值。

然而，茶樹中有關(guān) ASR基因的信息未見報(bào)道。前期，我們從茶樹冷馴化和低溫脅迫等轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出大量與茶樹抗寒等逆境響應(yīng)相關(guān)的基因，其中獲得 1條ASR的同源序列。在此基礎(chǔ)上，本研究首先克隆了茶樹CsASR基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并擴(kuò)增獲得了該基因的基因組序列，然后通過(guò) Genome Walker擴(kuò)增獲得了它的啟動(dòng)子序列，對(duì)CsASR基因的基本生物信息學(xué)特征分析，檢測(cè)了CsASR在不同組織和低溫、干旱、ABA和鹽脅迫下的表達(dá)模式。研究結(jié)果為茶樹抗逆功能基因研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 茶樹總 RNA提取、cDNA合成及基因組DNA提取

參照文獻(xiàn)[16]的方法，用0.5～1.0 g茶樹樣品為材料，提取總RNA，測(cè)定其RNA濃度及電泳檢測(cè)完整性后，逐步稀釋調(diào)整質(zhì)量濃度到1 μg·μL-1，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

按照SMART RACE試劑盒（Clontech，Mountain View，USA）的說(shuō)明，分別用 1 μg茶樹總 RNA 為模板，合成 5′-和 3′-的 cDNA鏈，用于RACE-PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)；用1 μg茶樹總 RNA為模板，根據(jù) SuperScript Ⅲ試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，USA）的操作說(shuō)明，合成cDNA用于熒光定量PCR（qRT-PCR）和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。

按照天根植物DNA提取試劑盒（DP305-2）的操作說(shuō)明提取茶樹基因組 DNA，在Nanodrop2000中檢測(cè) DNA的純度并測(cè)定濃度，通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，檢測(cè)合格的DNA樣品置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 CsASR基因的全長(zhǎng)cDNA克隆

將茶樹轉(zhuǎn)錄組中的 ASR基因序列片段在NCBI中進(jìn)行BLASTx比對(duì)分析，結(jié)果顯示缺少 3′-端。以該序列為模板，設(shè)計(jì) 3′-RACE特異引物CsASR-3：AGACCACCAACGCCTAT GGAAGC，進(jìn)行 RACE擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)方法參照SMART RACE試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行，50 μL反應(yīng)體系，PCR條件為94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物回收純化后，連接到PMD18-T表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，于氨芐固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取2個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與原片段進(jìn)行拼接，初步獲得全長(zhǎng)cDNA序列，在ORF兩端設(shè)計(jì)RT-PCR引物CsASR-F：CACAATGG CCGAAGAGAAGCA和CsASR-R：AAAGAG GTGGTGGTGCTTC，驗(yàn)證該序列的準(zhǔn)確性，并最終獲得該基因的全長(zhǎng)cDNA序列。

1.3 CsASR全長(zhǎng)基因組序列和啟動(dòng)子擴(kuò)增

參照已獲得的CsASR全長(zhǎng)cDNA序列，用龍井 43茶樹品種的 DNA為模板，利用PrimeSTAR HS試劑盒，以步驟 1.2中的RT-PCR引物擴(kuò)增基因組全長(zhǎng)序列，50 μL PCR反應(yīng)體系。參考其他植物中ASR基因的全長(zhǎng)，設(shè)置 PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 3 min，30 個(gè)循環(huán)后 72℃反應(yīng) 5 min。PCR產(chǎn)物回收測(cè)序，獲得目的基因的基因組序列。

以 CsASR基因組序列為模板，按照Clontech公司的GenomeWalker 2.0試劑盒操作步驟，先構(gòu)建克隆啟動(dòng)子的DNA酶切文庫(kù)，參照實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)啟動(dòng)子擴(kuò)增引物CsASR-P1：TGGTGGTGTCACCATATCCGGT GGTGG和CsASR-P2：CTCTTCGGCCATTG TGGTGCTGATCGG，采用試劑盒推薦的體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后，回收測(cè)序，獲得基因的啟動(dòng)子序列。

1.4 CsASR基因的生物信息學(xué)分析

用 DNAStar軟件包對(duì)序列進(jìn)行拼接；用DNAMAN軟件進(jìn)行開放閱讀框查詢；核酸序列及氨基酸序列分別在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLASTn和BLASTx分析；將序列用ClustalW比對(duì)后，在CLC6.0中輸出同源比對(duì)結(jié)果并在MEGA6.0軟件中用鄰近相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；用EXPASY（http://expasy.org/tools）中的TargetP、ProtParam、SingalP等工具對(duì)氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；NetPhos 2.0 server預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)；N-糖基化位點(diǎn)和蛋白激酶位點(diǎn)在PROSCAN. BASE （http://npsa-pbil.ibcp.fr）中預(yù)測(cè)；FoldIndex（http://bioportal.weizmann.ac.il/fldbin/findex）用于分析序列的可折疊特性；SWISS-MODEL模擬蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，Pymol編輯輸出。

基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、外顯子和內(nèi)含子所在位點(diǎn)等信息在 Augustus（http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/submission）中預(yù)測(cè)，基因結(jié)構(gòu)在GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn）中顯示。內(nèi)含子重復(fù)序列及轉(zhuǎn)座子序列在RepeatMasker（http://www.repeatmasker.org）中進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，CpG島在 MethPrimer（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）中預(yù)測(cè)，獲得的啟動(dòng)子序列先在NCBI中用BLASTn方法比對(duì)分析后，在PlantCARE（http://bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html）中對(duì)啟動(dòng)子序列所含順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.5 CsASR基因的表達(dá)模式分析

以生長(zhǎng)健壯的 2年生盆栽龍井 43茶樹為材料，參照Yue等[17]的方法進(jìn)行低溫（4℃）、ABA（100 μmol·L-1）、高鹽（250 mmol·L-1NaCl）和干旱（10% PEG-6000）處理。調(diào)節(jié)人工氣候室溫度并使之維持在(4±1)℃，將生長(zhǎng)在另一溫室(25±2)℃中的茶樹迅速移入低溫氣候室中，進(jìn)行低溫處理，并于 0、2、8、24 h時(shí)分別從至少3株茶苗上取枝條頂端第2～3片成熟葉為材料；用超純水配制 100 μmol·L-1濃度的ABA溶液，均勻噴灑茶樹葉片上，分別在0、2、8、24 h時(shí)取枝條頂端第2～3片成熟葉為材料；用純凈水配制250 mmol·L-1的NaCl溶液，采用澆灌方式將溶液緩慢注入盆中，直至澆透，并有大量溶液從底部流出，來(lái)對(duì)茶苗進(jìn)行鹽脅迫處理，并于0、8、24 h時(shí)取枝條頂端第2～3片成熟葉為材料；將茶苗從土中取出，用自來(lái)水洗凈根部土壤后，迅速置于純凈水配制的 10% PEG-6000溶液中，分別在 0、2、8 h時(shí)取樣后，用自來(lái)水將根部PEG去除，并于純凈水中恢復(fù)，在恢復(fù)48 h時(shí)取樣，用于檢測(cè)目的基因在干旱脅迫后復(fù)水過(guò)程的表達(dá)模式。每個(gè)處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。于2013年10月取生長(zhǎng)健壯并有花芽開放的茶苗5盆，先取頂端第 2～3片成熟葉、頂芽下 1 cm莖段及全開的茶花，然后將茶苗從盆中取出，先后用自來(lái)水和純凈水沖洗除去泥土，迅速剪下幼嫩根。從5盆茶苗上取下的組織混勻后再分別分成3份。所有樣品液氮速凍后保存于－80℃，提取RNA，檢測(cè)基因的表達(dá)模式。

根據(jù)序列特異性，設(shè)計(jì) qRT-PCR引物qASR-F：AAGCCCATCGATTCAGCTCC 和qASR-R：TTCCATAGGCGTTGGTGGTC，以茶樹polypyrimidine tract-binding protein 1 (PTB1)基因[18]作為內(nèi)參基因，按照 SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TAKARA公司）的操作步驟，采用20 μL體系于ABI PRISM7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。PCR主要程序?yàn)椋?5℃ 15 s，94℃ 5 s，60℃ 34 s，共 40 個(gè)循環(huán)，結(jié)果采用 2-ΔΔCT算法進(jìn)行分析，并用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsASR基因的cDNA全長(zhǎng)克隆及生物信息學(xué)特征分析

RACE-PCR擴(kuò)增獲得茶樹CsASR基因的3′-端638 bp序列（圖1-A），與原目的片段拼接獲得全長(zhǎng) cDNA序列。該 cDNA序列全長(zhǎng)875 bp，其中 ORF序列長(zhǎng) 546 bp（圖 1-B），編碼181個(gè)氨基酸，并提交GenBank（登錄號(hào)為：KF880380）。

2.1.1 CsASR的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析

利用ProtParam對(duì)CsASR基因編碼的蛋白的特征進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量較小，僅為 19.89 kD，分子式為C866H1272N250O292S1；含酸性氨基酸（Asp+Glu）34個(gè)，堿性氨基酸（Arg+Lys）18個(gè)，理論等電點(diǎn) 5.69，屬酸性蛋白；其半衰期較長(zhǎng)，為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為 35.17，表明該蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定。CsASR中富含甘氨酸（Gly，24個(gè)，占13.26%）、組氨酸（His，22個(gè)，占 12.15%）、谷氨酸（Glu，25個(gè)，占13.81%）、蘇氨酸（Thr，18個(gè)，占9.94%）、賴氨酸（Lys，16個(gè)，占 8.84%）和丙氨酸（Ala，15個(gè)，占8.29%）等氨基酸，這與其他植物中報(bào)道的 ASR的氨基酸組成比例相似[19]，與ASR蛋白功能密切相關(guān)。

2.1.2 CsASR的序列特征

CsASR的結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的可變性。利用FoldIndex在線預(yù)測(cè)軟件對(duì) CsASR的結(jié)構(gòu)折疊性進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，在序列中高達(dá)74.5%的氨基酸（即135個(gè)氨基酸位點(diǎn)）組成的結(jié)構(gòu)屬于無(wú)序結(jié)構(gòu)（圖 2），由其構(gòu)成的結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的可變性，因此，CsASR是一個(gè)無(wú)序蛋白。

在NetPhos 3.1 Server中對(duì)CsASR所含磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該序列含 25個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中6個(gè)絲氨酸（Ser）位點(diǎn)、12個(gè)Thr和7個(gè)絡(luò)氨酸（Tyr）位點(diǎn)，約占全序列的13.8%，主要能夠被蛋白激酶C（PKC）、酪蛋白激酶Ⅰ（CKI）、酪蛋白激酶Ⅱ（CKII）和 SRC等蛋白激酶磷酸化；而PROSCAN.BASE中分別預(yù)測(cè)到 PKC、CKII和酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)各為1、2、2個(gè)。同時(shí)，CsASR還含有8個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別為第 29、42、43、65、67、70、78、112號(hào)位點(diǎn)上的甘氨酸（Gly）。

圖1 CsASR克隆電泳圖Fig. 1 Electrophoresis results of CsASR cloning

圖2 CsASR序列的折疊性預(yù)測(cè)Fig. 2 The folding characteristics of the CsASR protein

2.1.3 CsASR的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析

TargetP1.1中的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，cTP、mTP、SP和 other的預(yù)測(cè)值分別為 0.123、0.118、0.102和 0.919，表明該基因定位在除葉綠體和線粒體外的其他亞細(xì)胞器的可能性較大；SignalP4.1中的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該序列中不含信號(hào)肽輸出位點(diǎn)；WoLF PSORT預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示其定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、葉綠體和線粒體的K值分別為6、3、2和1，說(shuō)明該基因定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等亞細(xì)胞器上的可能性最大；綜合TargetP、SignalP和WoLF PSORT的預(yù)測(cè)結(jié)果，推測(cè)本研究獲得的CsASR可能定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等亞細(xì)胞器中。

2.1.4 CsASR的序列聯(lián)配及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中采用 BLASTX和BLASTP對(duì)該基因進(jìn)行同源比對(duì)查找，結(jié)果顯示，未有茶樹等茶組植物中相關(guān)的序列與之匹配；且該基因與比對(duì)出的 ASR序列相似性較高，主要都在 50%以上，如與芭蕉（Musa balbisiana）、油棕（Elaeis guineensis）和蓖麻（Ricinus communis）的相似性分別為85%、84%和80%，其中與海棗（Phoenix dactylifera）的相似性最高，為87%。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，CsASR中的第94位至第170位氨基酸序列為ABA/WDS超家族的保守結(jié)構(gòu)域，這是 ASR主要的特征功能域。

對(duì)來(lái)自不同物種中的 ASR氨基酸序列進(jìn)行聯(lián)配分析，結(jié)果顯示，它們的 N-端序列保守性較低，但在N-端第4或第5個(gè)氨基酸后面均含有1個(gè)由6～8個(gè)組His構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域，而該結(jié)構(gòu)域后的序列相似性較低，氨基酸序列長(zhǎng)度變異較大；ASR的 C-端序列保守性較高，含有約90個(gè)氨基酸序列長(zhǎng)度的保守域，在該保守域中，含有ASR特異的保守功能結(jié)構(gòu)域——ABA/WDS功能域以及1個(gè)富含His的功能域（圖3-A）。在MEME中對(duì)來(lái)自不同物種中的ASR的保守序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，在所預(yù)測(cè)的ASR序列中主要含有5個(gè)不同的保守結(jié)構(gòu)域，即 M1-M5，且它們?cè)诎被嵝蛄猩系呐帕许樞蚓嗨?，其中M1和M2共同構(gòu)成了 ABA/WDS保守功能結(jié)構(gòu)域（圖3-B），這是ASR的特異結(jié)構(gòu)。

選取23種不同植物中的ASR構(gòu)建進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，這些ASR可以聚為2類，即Group A和Group B，其中茶樹CsASR聚在Group A中，且與棗（Ziziphus nummularia）的關(guān)系最近（圖4）。

2.2 CsASR基因的全長(zhǎng)基因組序列和啟動(dòng)子序列克隆及分析

以O(shè)RF兩端的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得大小約 3 000 bp的條帶（圖 1-C），該片段序列測(cè)序后，獲得長(zhǎng)度為3 278 bp的序列（GenBank登錄號(hào)：KY697275），在NCBI中進(jìn)行BLASTn序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示，該基因能夠與茶樹等植物中的 ASR基因的 cDNA序列匹配。在AUGUSTUS中對(duì)基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該序列由1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄的cDNA序列經(jīng)比對(duì)結(jié)果為CsASR基因。2個(gè)外顯子中，第1個(gè)外顯子較大，長(zhǎng)363 bp，第2個(gè)外顯子只有183 bp，內(nèi)含子較大，長(zhǎng)2 750 bp（圖5）。在多種植物中，ASR主要由2個(gè)外顯子組成，但它們所含的內(nèi)含子較小，一般在800 bp以下，蘋果MdASR2的內(nèi)含子最長(zhǎng)，為1 587 bp，但比CsASR的內(nèi)含子短（圖5）。對(duì)CsASR的內(nèi)含子分析顯示，該序列不含 CpG島；含有 7個(gè)不同類型的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，分別是(TATC)n、(ATT)n、(AT)n、(AAAT)n、(T)n、(TTTTAT)n和(TTTAATT)n，占內(nèi)含子序列長(zhǎng)的12.15%，含2種DNA轉(zhuǎn)座子DNA/TcMar-Stowaway（2058-2144）和 DNA/CMC-EnSpm（2082-2153）。

圖3 不同植物中的ASR 序列聯(lián)配（A）及MEME 預(yù)測(cè)保守域（B）結(jié)果分析Fig. 3 Alignment of ASR (A) and motif prediction analysis using MEME database (B)

圖4 CsASR的進(jìn)化樹分析Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of CsASR

圖5 ASR基因結(jié)構(gòu)分析Fig. 5 Structure analysis of the ASR genes

通過(guò)GenomeWalker方法，在EcoR V和Pvu II的酶切文庫(kù)中擴(kuò)增出多條清晰片段（圖1-D），將大小在800 bp以上的條帶回收測(cè)序，測(cè)序結(jié)果拼接獲得2 539 bp的片段，該序列與基因組序列拼接后，獲得起始密碼子ATG上游2 554 bp的啟動(dòng)子區(qū)（GeneBank登錄號(hào)：KY697274）。在PLANTCARE中對(duì)該序列所含順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，CsASR啟動(dòng)子區(qū)含有多種與植物逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，如干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的 MBS、低溫響應(yīng)相關(guān)的 LTR、高溫響應(yīng)相關(guān)的 HSE等，其中發(fā)現(xiàn)2個(gè)與ABA響應(yīng)相關(guān)的元件，分別在 ATG上游-1553和-2471；在該序列上還預(yù)測(cè)到多個(gè)與茉莉酸甲酯、乙烯、生長(zhǎng)素等植物激素響應(yīng)相關(guān)的元件（表 1）；除了生物鐘 circadian元件外，該啟動(dòng)子上還含有多個(gè)受光照調(diào)控的響應(yīng)元件。從啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析結(jié)果表明，該基因與茶樹的環(huán)境適應(yīng)密切相關(guān)。

表1 CsASR啟動(dòng)子區(qū)與逆境響應(yīng)相關(guān)的主要順式作用元件預(yù)測(cè)Table 1 Prediction of the major stress-responsive cis-elements in the promoter ofCsASRgene

2.3CsASR基因的表達(dá)分析

采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)CsASR基因的組織表達(dá)特異性及其在 ABA、干旱、高鹽和低溫脅迫下的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，CsASR在 4種組織中具有表達(dá)，且在根中的表達(dá)最低，在莖和花中具有較高的表達(dá)量（圖6-A）；ABA處理后，CsASR的表達(dá)被顯著抑制，在24 h的處理過(guò)程中其表達(dá)量均顯著地低于對(duì)照；PEG模擬干旱脅迫處理后，CsASR被迅速誘導(dǎo)表達(dá)，8 h時(shí)表達(dá)量最高，達(dá)8.32，干旱恢復(fù)處理 48 h后該基因的表達(dá)量降低至4.52，但仍顯著高于處理前的水平；NaCl處理能顯著上調(diào)CsASR基因的表達(dá)，在 4 h和24 h時(shí)間點(diǎn)上檢測(cè)的表達(dá)量均是處理前的 2倍以上；同樣，低溫脅迫條件下CsASR的表達(dá)隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，在 24 h達(dá)到最大，為3.17（圖 6-B～圖6-E）。表明該基因可能參與茶樹抗逆響應(yīng)。

3 討論

ASR基因是一類受干旱誘導(dǎo)的基因。本研究中，我們首先克隆了茶樹CsASR基因的全長(zhǎng) cDNA序列，該基因編碼 181個(gè)氨基酸序列，分子量為 19.98 kD，其大小與多種植物中的ASR大小相當(dāng)。ASR是植物特有的一類小分子蛋白，其蛋白質(zhì)大小主要在 200個(gè)氨基酸以下[1]。從香蕉、番茄、二穗短柄草、蘋果、谷子等植物中的ASR基因家族的編碼蛋白大小的結(jié)果中可以看出，幾種植物中已鑒定出的最小ASR僅編碼101個(gè)氨基酸（谷子 ASR6，Si011429），番茄 ASR4最大，也僅編碼297個(gè)氨基酸[3-4,20-22]。CsASR在C-端具有90個(gè)氨基酸左右的保守域，該保守域中包含了 ABA/WDS功能域，該功能域是干旱響應(yīng)相關(guān)基因編碼蛋白特有的一種結(jié)構(gòu)域，所有的ASR等均含有此功能域[1]。CsASR的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，它既可以定位在胞質(zhì)也可以在細(xì)胞核內(nèi)，說(shuō)明CsASR在胞內(nèi)可能具有多種功能。在多種植物中的研究顯示，ASR定位在細(xì)胞核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄因子的功能，參與相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[6,8-9,12-13,23]；在胞質(zhì)中，ASR作為一種分子伴侶，在逆境脅迫下大量積累，能夠維持細(xì)胞中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及增加胞質(zhì)濃度，進(jìn)而提高對(duì)逆境的抵御能力[1,11,24]。CsASR穩(wěn)定性較高，因此它可以在胞質(zhì)中穩(wěn)定存在并發(fā)揮相應(yīng)的分子伴侶功能。同時(shí)其可折疊序列占比達(dá)74.5%，表明該蛋白的結(jié)構(gòu)可以根據(jù)條件刺激發(fā)生改變進(jìn)而在多種生理活動(dòng)中起作用。因此，本研究獲得的CsASR不僅可作為轉(zhuǎn)錄因子參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，還可能以分子伴侶的形式行使其功能，其功能還有待通過(guò)轉(zhuǎn)基因等手段進(jìn)行深入研究。

圖6 CsASR的組織表達(dá)（A）及其在逆境脅迫中的表達(dá)（B-E）模式分析Fig. 6 Expression patterns of CsASR in tissues (A) and in response to stresses (B-E)

本研究中，還克隆了 CsASR基因的全長(zhǎng)基因組序列。CsASR由1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子構(gòu)成，其中第一個(gè)外顯子較長(zhǎng)，第二個(gè)外顯子較短（圖5）。由于其編碼基因較小，植物中的 ASR基因主要由2個(gè)外顯子組成，但有的木本植物中的ASR基因也含有3個(gè)外顯子，如蘋果ASR1和ASR3等，這可能與植物自身基因組大小及復(fù)雜度有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，茶樹CsASR的內(nèi)含子顯著大于其他植物中的ASR，其他植物中內(nèi)含子多在 600 bp以下，最短的只有100 bp左右，而蘋果中最長(zhǎng)的ASR2的內(nèi)含子也僅為1 587 bp，小于茶樹2 751 bp的長(zhǎng)度（圖5）。重復(fù)序列分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子中有7種不同類型的重復(fù)序列元件占內(nèi)含子長(zhǎng)度的12.15%，同時(shí)還含有2個(gè)DNA轉(zhuǎn)座子，從中可見茶樹基因組之復(fù)雜。此外，我們還克隆獲得了CsASR基因啟動(dòng)子序列2 554 bp，分析預(yù)測(cè)顯示在該啟動(dòng)子序列上含有多種參與逆境脅迫響應(yīng)的順式作用元件，如干旱、低溫和高溫響應(yīng)元件，同時(shí)還含有多種植物激素，如乙烯、生長(zhǎng)素和茉莉酸甲酯等相關(guān)的順式作用元件（表 1），表明該基因的表達(dá)受多種逆境脅迫調(diào)控。

本研究檢測(cè)了CsASR在ABA、干旱、高鹽和低溫脅迫下的表達(dá)模式，證實(shí)該基因與茶樹的逆境響應(yīng)密切相關(guān)。ABA和低溫刺激能夠快速誘導(dǎo)植物進(jìn)行響應(yīng)，我們的結(jié)果表明在ABA和低溫處理2 h后CsASR的表達(dá)水平就發(fā)生了顯著變化。其中，CsASR基因的表達(dá)在ABA處理過(guò)程中呈下調(diào)的模式（圖6-B），表明該基因在ABA響應(yīng)中可能起負(fù)調(diào)控作用。與茶樹中CsASR相似，水稻OsASR1、OsASR2和 OsASR3 的表達(dá)在 ABA（100 μmol·L-1）處理后在葉片中呈下調(diào)模式[25]，谷子ASR6在葉片中的表達(dá)也被ABA抑制[21]，而在小麥[8]、番茄和草莓[6]和遼寧堿蓬[19]等多種植物中的研究顯示ASR的表達(dá)受ABA誘導(dǎo)，在 ABA調(diào)控的抗逆中起正調(diào)控作用。然而，CsASR在干旱、高鹽和低溫脅迫處理后，其表達(dá)被顯著誘導(dǎo)（圖 6-C～圖 6-E），表明 CsASR可能參與了ABA介導(dǎo)的抗逆響應(yīng)調(diào)控。干旱后復(fù)水響應(yīng)也是植物抗旱機(jī)理研究中重要的內(nèi)容之一，本研究發(fā)現(xiàn)干旱誘導(dǎo)復(fù)水期間 CsASR仍具有較高的轉(zhuǎn)錄水平，表明該基因在茶樹干旱后恢復(fù)期間也可能發(fā)揮一定的功能。與其他處理不同，我們通過(guò)澆灌方式研究了鹽脅迫CsASR在茶樹葉片中的表達(dá)模式，并對(duì)該基因在 4 h和 24 h的表達(dá)量進(jìn)行了分析，表明CsASR在茶樹抵御鹽脅迫中也可能發(fā)揮功能。將不同植物中的 ASR通過(guò)轉(zhuǎn)基因到擬南芥等模式植物中均表明，過(guò)表達(dá) ASR基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的抗寒、抗旱、抗鹽脅迫等的能力。Li等[24]對(duì) OsASR5在水稻抗旱中的功能及作用機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsASR5能夠增強(qiáng)水稻的抗旱能力，深入研究發(fā)現(xiàn)該基因能夠參與 ABA和 H2O2介導(dǎo)的氣孔開閉調(diào)節(jié)，同時(shí)作為分子伴侶在胞內(nèi)能夠與逆境響應(yīng)相關(guān)的HSP40和含2OG-Fe (II)氧合酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合，參與植物抗旱響應(yīng)。過(guò)表達(dá)ASR基因的植株中，ASR能夠通過(guò)調(diào)控光合作用、呼吸作用、碳水化合物及植物激素等的代謝，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)、氣孔開閉，參與植物響應(yīng)干旱的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，促進(jìn)植物對(duì)逆境脅迫的抵御能力[7,19-21,26-27]。另外，有研究發(fā)現(xiàn) ASR基因在植物響應(yīng)鋁脅迫和抗病等方面也有重要的功能[4,9,13,28]，同時(shí) ASR基因與糖信號(hào)調(diào)控等也密切相關(guān)[12,29]。鑒于 ASR在植物抗逆中具有廣泛的功能，而擬南芥中不含 ASR基因，因此，后續(xù)可以在擬南芥中對(duì)CsASR的功能進(jìn)行鑒定，為茶樹抗逆機(jī)理研究及高抗品種選育提供理論支撐。

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Cloning and Expression Analysis of CsASR Gene in Tea Plant (Camellia sinensis)

YUE Chuan1,2, CAO Hongli1,2, HAO Xinyuan2, GUO Yuqiong1,YE Naixing1, WANG Xinchao2*, YANG Yajun2*
1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science in Universities of Fujian Province/Collaborative Innovation Center of Chinese Oolong Tea Industry, Fuzhou 350002, China; 2. Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Key Laboratory of Tea Plant Biology and Resources Utilization,Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Abiotic stress severely affects the growth and development of tea plant and the quality of tea. ASR(abscisic acid, stress, ripening) genes play crucial roles in the plant response to stresses. The full-length cDNA,genomic sequence and the promoter sequence of CsASR gene were cloned from tea cultivar Longjing 43 in this study,The bioinformatic and the expression analysis of CsASR in tissues under different stress treatments were performed.The results revealed that the full-length cDNA of CsASR was 875 bp, containing a 546 bp ORF encoding 181 amino acid. The predict protein molecular and theoretic isoelectric point of CsASR were 19.89 kD and 5.69. Most regionsof the amino acid sequence (74.5%) were predicted as the non-ordered regions, indicating that CsASR is a disordered protein. C-terminal of CsASR contained an ABA/WDS functional domain which was primarily located in both the cytoplasm and the nucleus. The homologous alignment and phylogenetic tree analysis showed that CsASR had the highest similarity (87%) with Phoenix dactylifera, and had the closest genetic relationship with Ziziphus nummularia.The genomic sequence of CsASR gene was comprised by two exons with 363 bp and 183 bp in length, respectively,and had a 2 750 bp intron which contained seven simple repeats and two DNA transposons. The promoter sequence of CsASR was 2 554 bp in length and was predicted to contain several stress-responsive elements related to drought,cold, high temperature stresses and ABA-signaling. The expression analysis showed that CsASR had the lowest level in roots, and its expression was repressed by ABA treatment. While the drought, NaCl and cold stresses could significantly up-regulate the expression of CsASR. The results revealed that CsASR might be closely related to stress response in tea plant.

tea plant, ASR gene, abiotic stress, gene cloning

S571.1；Q52

A

1000-369X（2017）04-399-12

2017-04-10

2017-05-14

國(guó)家自然科學(xué)基金（31600555）、福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2017J01616）、國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-23）

岳川，男，講師，主要從事茶樹種質(zhì)資源利用與茶葉品質(zhì)調(diào)控研究。*通訊作者