河北中醫(yī)學院(石家莊 050200)

潘麗佳 張俊茶 范璽勝 張曉琪 劉 君 邢海嬌 張選平 楊延巍 佘延芬

刮痧對正常大鼠局部肥大細胞功能狀態(tài)的影響*

河北中醫(yī)學院(石家莊 050200)

潘麗佳 張俊茶 范璽勝 張曉琪 劉 君 邢海嬌 張選平 楊延巍 佘延芬

目的：觀察刮痧前后局部肥大細胞的功能狀態(tài)，揭示刮痧療法的部分作用機制。方法：正常Wistar大鼠隨機分為刮痧前組、刮痧后即刻組，刮痧后30 min組、刮痧后60 min組、刮痧后90 min組，每組10只。除刮痧前組外，其余各組均給予刮痧干預，刮拭部位為大鼠背部督脈、兩側(cè)膀胱經(jīng)，刮拭方法為刮法，頻次為60次/分，刮拭時間30 s。各組分別于刮痧前、刮痧后即刻、30、60、90 min脫頸處死，于大鼠背部一側(cè)膀胱經(jīng)上出痧最明顯處取材。分別采用甲苯胺藍染色、免疫組化的方法觀察肥大細胞數(shù)量以及脫顆粒情況、類胰蛋白酶表達情況。結果：各組肥大細胞數(shù)比較差異無顯著性，P>0.05；各組肥大細胞脫顆粒率比較差異無顯著性，P>0.05；各組類胰蛋白酶陽性細胞數(shù)比較差異無顯著性，P>0.05。結論：刮痧后以及刮痧后的90 min內(nèi)肥大細胞的功能狀態(tài)并未發(fā)生明顯改變，刮痧即刻未對正常大鼠局部肥大細胞產(chǎn)生影響，推測刮痧療法的即刻效應與肥大細胞無關。

肥大細胞；刮痧；類胰蛋白酶；大鼠；實驗研究

刮痧是應用特制的刮痧工具，在人體體表的腧穴、經(jīng)絡及病變部位進行刮拭，達到防病、治病目的的一種治療方法，具有方法獨特、簡便安全、患者易于接受、適應癥廣、療效可靠等特點。[1]如今刮痧療法不僅在國內(nèi)受到群眾的歡迎，在國際上也受到越來越多的關注和應用，而其治療機理卻尚不明確，相關研究也有待進一步深化。[2]皮膚毛細血管、神經(jīng)末梢豐富，是體表防衛(wèi)、溫度調(diào)節(jié)的重要器官，刮痧主要通過刺激局部皮膚而發(fā)揮作用，刮痧的作用機制復雜與刺激皮膚后通過多種途徑發(fā)揮作用密切相關。而肥大細胞廣泛分布于皮膚及內(nèi)臟黏膜下的微血管周圍，目前許多研究表明，肥大細胞不僅參與肌體過敏、炎癥、組織損傷修復、免疫等反應，還與很多生理病理過程有關。[3]在針刺效應機理研究中，肥大細胞的功能狀態(tài)被認為是針刺起效的關鍵節(jié)點之一，在刮痧的效應機理研究中，肥大細胞的功能作用研究極少，刮痧后穴位處的肥大細胞功能狀態(tài)是否發(fā)生變化，刮痧是否也通過激活肥大細胞發(fā)揮效應目前尚不清楚。因此，本研究從刮痧作用于正常大鼠皮膚后的出痧部位入手，觀察刮痧后90 min內(nèi)肥大細胞功能狀態(tài)的變化以及類胰蛋白酶檢測肥大細胞活性變化，探討肥大細胞在刮痧療法即刻療效中的作用機制，以揭示刮痧療法的部分作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料 選用健康雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量(250±20) g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(冀)2013-1-003]。所有大鼠實驗前適應性飼養(yǎng)1周，不限進食、飲水，自然光照，室溫22℃～24℃，相對濕度(50%±5%)。

1.2 主要實驗試劑與儀器 肥大細胞類胰蛋白酶鼠單克隆抗體[AA1]，山羊抗小鼠Ig G/HP聚合物，DAB顯色試劑盒(20×)，脫毛膏；病理圖文分析系統(tǒng)，光學顯微鏡，冰凍切片機。

1.3 實驗分組 采用隨機數(shù)字表法將動物隨機分為5組，根據(jù)刮痧后觀察時間的不同分為刮痧前組、刮痧后即刻組、刮痧后30 min組、刮痧后60 min組、刮痧后90 min組，每組10只。

1.4 各組干預方 各組大鼠于實驗干預前24 h脫毛膏備皮，刮痧前組不給予刮痧干預，但給予同樣時間的抓取和固定，其余各組均給予刮痧干預。刮拭部位：大鼠背部督脈、兩側(cè)膀胱經(jīng)，參照《常用實驗動物穴位定位圖譜》、《腧穴名稱與定位》(GB/T12346-2006)結合比較解剖學進行定位，刮拭方法為刮法，手法為平補平瀉，刮拭次數(shù)為20次，操作方法參照“新世紀全國高等中醫(yī)藥院校創(chuàng)新教材”《刮痧療法》。刮痧前組、刮痧后即刻組、刮痧后30 min組、刮痧后60 min組、刮痧后90 min組分別于刮痧前，刮痧后即刻、30、60、90 min處死取材。

1.5 標本采集及指標檢測方法 各組大鼠干預結束后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，取大鼠背部一側(cè)膀胱經(jīng)上出痧最明顯處體積約為5×5×3 mm3的組織塊標本(包括皮膚、肌肉)。

1.5.1 肥大細胞甲苯胺藍染色：組織塊經(jīng)4%多聚甲醛固定液固定，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，制作連續(xù)切片(片厚4 μm)。石蠟切片經(jīng)脫蠟脫水后，TB溶液染色，冰醋酸液分化，脫水透明后封片。在10×40倍光鏡下觀察細胞形態(tài)。肥大細胞甲苯胺藍染色特征：成熟肥大細胞呈圓型或卵圓型，輪廓清晰，胞體較大，細胞核常位于細胞中央，胞漿內(nèi)顆粒被染成紫藍色，細胞核著色較淺。脫顆粒肥大細胞失去原有形態(tài)，細胞輪廓不完整，紫藍色顆粒游離于細胞外。

計數(shù)方法：取2張不連續(xù)切片，均在高倍視野(×400)下選取肥大細胞數(shù)目最多的5個不重復視野進行計數(shù)，記錄5個視野細胞總數(shù)和脫顆粒細胞數(shù)，脫顆粒率=(脫顆粒細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%，取2張切片平均值。[4-5]

1.5.2 類胰蛋白酶免疫組化：石蠟切片經(jīng)脫蠟水化后，用脫蠟修復液(pH 6.0)微波修復抗原，滴加肥大細胞類胰蛋白酶鼠單克隆抗體，冰箱40℃過夜，PBS沖洗后，滴加山羊抗小鼠IgG/HP聚合物，室溫孵育30 min，再用PBS沖洗后，DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明后封片。觀察結果判定：細胞核和/或細胞漿呈棕黃色或黃褐色為陽性細胞。

計數(shù)方法：取2張不連續(xù)切片，均在高倍視野(×400)下選取陽性表達最強的5個不重復視野進行計數(shù)，取2張切片平均值。[6]

2 結果

2.1 各組大鼠組織中肥大細胞數(shù)、肥大細胞脫顆粒率比較 各組大鼠組織中肥大細胞數(shù)比較差異無顯著性，P>0.05，各組大鼠組織中肥大細胞脫顆粒率比較差異無顯著性，P>0.05，詳見表1。

表1

各組刮痧前后肥大細胞數(shù)、肥大細胞脫顆粒率比較 ±s,n=10)

2.2 各組大鼠組織中類胰蛋白酶陽性細胞數(shù)比較 各組大鼠組織中類胰蛋白酶陽性細胞數(shù)比較，差異無顯著性，P>0.05，詳見表2。

表2 各組大鼠組織中類胰蛋白酶陽性細胞數(shù)比較 ±s,n=10)

3 討論

刮痧是中醫(yī)外治疾病的主要方法之一，使用范圍涉及內(nèi)外婦兒等各科疾病和亞健康狀態(tài)的防治，且臨床療效十分顯著。[7]在刮痧作用機理研究中，Musial F研究團隊提出刮痧作為一種反射療法，可能在傷害感受器和脊髓水平作用于慢性疼痛；在外周可能通過C-纖維，Aδ-纖維連接傷害感受器，在脊髓水平通過脊髓丘腦束上行。[8-9]目前有研究結果顯示刮痧可升高局部皮膚溫度、血流量，改善局部微循環(huán)，促進組織細胞能量代謝，[10-13]并能使皮下毛細血管擴張和破裂，局部組織發(fā)生炎癥反應，使組織中的TNF-α、IL-6、IL-12、IL-23等炎癥因子上調(diào)，DCs(樹突狀細胞，dendritic cells)、T淋巴細胞、F4/80巨噬細胞等免疫激活細胞比率升高，細胞因子水平發(fā)生變化，對血液中的膽紅素、超氧化物歧化酶、細胞因子、血細胞及神經(jīng)遞質(zhì)等也有影響，刮痧后皮下組織和血液中相關化學物質(zhì)的變化是刮痧提高肌體免疫力，起到保健、治療作用的主要機理。[14-16]

經(jīng)穴處的肥大細胞較非經(jīng)穴處數(shù)目更集中，功能更為活躍，針刺可激活局部肥大細胞，釋放神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子、激素等多種信號分子，這些信號分子又可興奮周圍神經(jīng)末梢感受器，釋放大量化學物質(zhì)，物質(zhì)間相互作用，啟動針刺效應。[17-18]本實驗中刮痧前與刮痧后不同時間節(jié)點的肥大細胞數(shù)比較、肥大細胞脫顆粒率比較差異均無顯著性(P>0.05)，可見刮痧后90 min內(nèi)肥大細胞的功能狀態(tài)沒有發(fā)生明顯改變。推測可能與刺激方式不同有關，刮痧主要以對皮膚的按壓力和摩擦力為主，對皮膚下結締組織的影響相對較小，而針刺作為一種機械刺激，針體刺入皮下組織并進行提插捻轉(zhuǎn)時，針體可深入到穴位處的結締組織中，可導致穴區(qū)結締組織中的膠原纖維變形，細胞骨架重排，[19]有研究表明穴位處膠原纖維結構的破壞可明顯減弱肥大細胞脫顆粒程度及手針介導的鎮(zhèn)痛效應。[20]刮痧對皮膚的刺激是否可導致穴位處膠原纖維變形尚未可知，推測刮痧后肥大細胞功能狀態(tài)并未激活與刮痧刺激對穴位處膠原纖維的影響程度有關。另有研究結果顯示，皮下肥大細胞膜上存在具有機械敏感性的TRPV2通道，針刺的機械力傳遞給皮下的肥大細胞時，需要達到一定閾值，該通道才能被激活，進而引起胞內(nèi)Ca2+濃度增加，引發(fā)活性物質(zhì)的分泌釋放，從而作用于周圍的神經(jīng)末梢上行傳導針刺信號。[21]本實驗中刮痧前后肥大細胞功能狀態(tài)并未發(fā)生明顯改變也可能與刮痧產(chǎn)生的機械力并沒有達到一定的閾值，肥大細胞膜上的TRPV2通道沒有被激活有關。

肥大細胞活化后能釋放多種活性物質(zhì)，其中類胰蛋白酶是肥大細胞活化和釋放顆粒的特異性標志。[22]本實驗中，類胰蛋白酶免疫組織化學染色與肥大細胞甲苯胺藍特殊染色所得到的結果一致，刮痧前與刮痧后不同時間節(jié)點的類胰蛋白酶陽性細胞數(shù)比較差異均無顯著性(P>0.05)，但類胰蛋白酶標記的細胞數(shù)卻少于甲苯胺藍特殊染色所得到的肥大細胞數(shù)，推測與肥大細胞脫顆粒狀態(tài)有關。

本實驗研究結果顯示刮痧后以及刮痧后的90 min內(nèi)肥大細胞的功能狀態(tài)并未發(fā)生改變，但現(xiàn)有研究結果顯示刮痧后皮下組織增多物質(zhì)與肥大細胞激活后釋放的化學物質(zhì)有許多相似之處，如TNF-α、IL-6等，[15，18]推測刮痧后皮下增多的這些化學物質(zhì)可能是非肥大細胞源性，刮痧后短時間內(nèi)可能并沒有通過激活肥大細胞而發(fā)揮治療和保健效應。

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(2017-04-20 收稿)

Effect ofGuashaon the Functional Status of Partial Mast Cells in Normal RatsHebei University of Chinese Medicine

PANLi-jiaZHANGJun-chaFANXi-shengZHANGXiao-qiLIUJunXINGHai-jiaoZHANGXuan-pingYANGYan-weiSHEYan-fen

(Shijiazhuang 050200)

Objective: to observe the functional status of partial mast cells before and after scraping so as to reveal the functional mechanism ofGuashatherapy. Methods: The normal Wistar rats were randomly divided into pre-scraping group, instant group after scraping, 30 min group, 60 min group, and 90 min group, 10 rats each group. Except pre-scraping group, all the others were intervened withGuasha, scraping Du meridian and Bladder meridians, 60 times /min, for 30 seconds each time. The rats of each group were killed off before scraping, and instantly, 30 min, 60min and 90 min after scraping respectively, materials taken from the most obvious part of one Bladder meridian. Toluidine blue staining and Immunohistochemical tests were used to observe the number of mast cells, degranulations and tryptase expression. Results: there was no significant difference between the numbers of mast cells,P>0.05; degranulation rates of each group had no significant difference,P>0.05; there was no significant difference between numbers of positive tryptase,P>0.05. Conclusion: the functional status of mast cells has no obvious changes instantly after scraping and 90 min after scraping, that is,Guashadoes not affect the partial mast cells in normal rats instantly after scraping. It therefore can be predicted that the instant effect ofGuashatherapy is irrelative to mast cells.

mast cells;Guasha; tryptase; rats; experimental study

*河北省科技廳資助項目：No.132777236；河北省中醫(yī)藥管理局資助項目：No.2015083；河北中醫(yī)學院青年基金項目：No.QNZ2016016

佘延芬，女，博士，教授，碩士研究生導師。

R244.4

A

1007-5615(2017)04-0046-04

針灸推拿學研究