岳雨霞

摘 要：該文以海藻酸鈉和聚乙烯醇（PVA）為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，對(duì)拜氏梭菌進(jìn)行了固定化技術(shù)的研究。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，以總?cè)軇┖投〈籍a(chǎn)量及固定化小球的完整性為考核指標(biāo)，確定了影響拜氏梭菌固定化技術(shù)的主要工藝參數(shù)：海藻酸鈉濃度為2%，PVA濃度7%，戊二醛添加量為2%，交聯(lián)時(shí)間4 h，交聯(lián)溫度37 ℃，丁醇產(chǎn)量最高可達(dá)11.72 g/L，總?cè)軇┊a(chǎn)量最高可達(dá)21.51 g/L。

關(guān)鍵詞：海藻酸鈉 PVA 交聯(lián) 拜氏梭菌 固定化

中圖分類號(hào)：Q81 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2017）06（a）-0139-02

固定化細(xì)胞技術(shù)是20世紀(jì)70年代興起的一種新型生物技術(shù)，是指利用物理或化學(xué)手段將游離的細(xì)胞或酶與固態(tài)的不溶性載體相結(jié)合，使其保持活性并可反復(fù)使用的一種技術(shù)[1]。該技術(shù)可以大幅度提高催化效率，減少所用微生物數(shù)量，微生物被高分子材料包埋，耐環(huán)境沖擊，產(chǎn)物易分離提取，操作穩(wěn)定性好[2]。因此，固定化細(xì)胞技術(shù)在發(fā)酵工業(yè)中具有廣闊發(fā)展前景[3]。

微生物細(xì)胞的固定方法中吸附法具有操作簡(jiǎn)單、固定化條件溫和、細(xì)胞活性損失小、載體可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用和研究。海藻酸鈉具有化學(xué)穩(wěn)定性好、無毒、包埋效率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于固定活細(xì)胞或敏感細(xì)胞，但其不耐熱，易破碎溶解，凝膠強(qiáng)度不夠，不利于多次使用。而聚乙烯醇凝膠強(qiáng)度較高，化學(xué)穩(wěn)定性好，抗分解性能強(qiáng)，同時(shí)戊二醛能和細(xì)胞表面的基團(tuán)發(fā)生交聯(lián)并形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)從而得到機(jī)械強(qiáng)度好的凝膠，因此，將PVA和海藻酸鈉結(jié)合，同時(shí)采用戊二醛[7]交聯(lián)可以使優(yōu)勢(shì)得到加強(qiáng)。

文章以海藻酸鈉和PVA為載體，采用戊二醛交聯(lián)后吸附拜氏梭菌進(jìn)行細(xì)胞固定化，研究了載體成球方式和固定化方法對(duì)溶劑產(chǎn)量的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 菌種

拜氏梭菌，實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基

完全培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉3.0 g，牛肉膏10.0 g，胰蛋白胨10.0 g，可溶性淀粉1.0 g，葡萄糖5.0 g，L-半胱氨酸0.50 g，NaCI 5.0 g，NaAc 3.0 g，pH8.5。斜面培養(yǎng)基另加瓊脂20.0 g/L。121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 基本發(fā)酵培養(yǎng)基

P2培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖，酵母粉，P2營養(yǎng)液。

P2營養(yǎng)液組成：（1）維生素液（g/L）：對(duì)-氨基苯甲酸0.10 g，硫胺素0.10 g，生物素0.001 g，（2）微量元素液（g/L）：KH2PO4 50.0 g，K2HPO4 50.0 g，NH4COOH 22.0 g，MgSO4.7H2O 20.0 g，MnSO4.H2O 1.0 g， FeSO4.7H2O 1.0 g，NaCl 1.0 g。0.45 μm濾膜過濾滅菌。接種前將P2營養(yǎng)液以一定比例加入P2培養(yǎng)基中。

1.3 培養(yǎng)條件

1.3.1 種子培養(yǎng)

菌種由固體斜面接入種子培養(yǎng)基，39 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)液75 ℃恒溫水浴下熱處理10 min后接種入發(fā)酵培養(yǎng)基，39 ℃下靜置培養(yǎng)72 h。

1.4 主要儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)中主要的儀器設(shè)備有：蒸汽滅菌器、電熱培養(yǎng)箱、氣相色譜、超聲波清洗器、離心機(jī)、精密電子天平。

1.5 試劑

實(shí)驗(yàn)中使用的主要試劑有：硼酸、酵母浸提物、氯化鈣、海藻酸鈉、氫氧化鈉、乙醇、氯化鈉、戊二醛、丙酮、丁酸等。

1.6 固定化工藝

1.6.1 工藝流程

載體→溶解→固化交聯(lián)→吸附菌體→發(fā)酵

1.6.2 操作要點(diǎn)

（1）溶解：先將PVA與海藻酸鈉浸泡6～12 h，再加熱溶解，滅菌備用。

（2）固化交聯(lián)：吸取PVA與海藻酸鈉溶液，無菌環(huán)境下滴入已配置好的含戊二醛和氯化鈣的硼酸飽和溶液中使成小球，設(shè)定溫度下靜置一段時(shí)間。

（3）吸附菌體：在無菌三角瓶中，將小球與菌液吸附一段時(shí)間后倒出菌液。

（4）發(fā)酵：將培養(yǎng)基倒入三角瓶中，39 ℃靜置培養(yǎng)72 h，檢測(cè)溶劑產(chǎn)量。

1.7 分析方法

1.7.1 溶劑產(chǎn)量的測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

計(jì)算：根據(jù)溶劑和內(nèi)標(biāo)的峰面積比和質(zhì)量比，結(jié)果如下：

乙醇：y=1.4546x-7E-05，R2=0.9991

丙酮：y=1.3689x-0.0343，R2=0.9984

丁醇：y=1.0491x-0.047，R2=0.9966

式中：x為與內(nèi)標(biāo)的峰面積比，y為與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量比。

（2）樣品中溶劑的檢測(cè)。

發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min后，取上清液，與內(nèi)標(biāo)異丁醇混合后采用氣相色譜儀進(jìn)樣檢測(cè)。色譜柱為KB-5MS，25 m×0.53 mm×1.00 μm；檢測(cè)器FID；進(jìn)樣口溫度240 ℃；檢測(cè)器溫度260 ℃；柱溫80 ℃（保溫5 min）～120 ℃（保溫3 min）；進(jìn)樣量1μL。

1.7.2 pH值的測(cè)定

用pH計(jì)測(cè)定溶液pH值。

2 結(jié)果與分析

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，分析結(jié)果可知：影響結(jié)果的順序，為交聯(lián)時(shí)間>交聯(lián)聯(lián)溫度>PVA濃度>戊二醛濃度，最佳配比A2B2C2D3，即PVA濃度為7%，戊二醛濃度為2%，交聯(lián)時(shí)間4 h，交聯(lián)溫度37 ℃，此時(shí)丁醇產(chǎn)量可達(dá)11.72 g/L，總?cè)軇┊a(chǎn)量最高可達(dá)12.51 g/L。

3 結(jié)語

（1）單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PVA為7%，海藻酸鈉2%，戊二醛2%，固定化交聯(lián)時(shí)間4 h，固定化交聯(lián)溫度37 ℃時(shí)，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量較高。

（2）正交實(shí)驗(yàn)的確定了固定化交聯(lián)條件：PVA濃度為7%，戊二醛濃度為2%，交聯(lián)時(shí)間4h，交聯(lián)溫度37 ℃，此時(shí)丁醇產(chǎn)量可達(dá)11.72 g/L，總?cè)軇┊a(chǎn)量最高可達(dá)21.51 g/L。

（3）由于時(shí)間的原因未對(duì)固定化條件、固定化小球特性、固定化小球的回收利用等進(jìn)行詳細(xì)研究，需要在以后的工作中多查閱文獻(xiàn)合理安排時(shí)間。

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