沈文鳳， 王月明， 徐志祥， 崔文甲， 弓志青，石賢權(quán)， 王文亮,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 山東 泰安 271018；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 濟(jì)南 250100)

?

香菇調(diào)味料酶解工藝研究

沈文鳳1,2， 王月明2， 徐志祥1， 崔文甲2， 弓志青2，石賢權(quán)2， 王文亮1,2,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 山東 泰安 271018；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 濟(jì)南 250100)

為提高香菇酶解液的酶解效率和感官品質(zhì)，研究了3種酶復(fù)合酶解香菇的較佳工藝。首先通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了纖維素酶的酶解條件，纖維素酶的較佳酶解條件為溫度40 ℃、時(shí)間1 h、加酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%。然后以感官評(píng)分和α -氨基態(tài)氮含量為指標(biāo)篩選出菠蘿蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶2種蛋白酶，最后通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了復(fù)合酶的較佳酶解條件。結(jié)果表明，3種酶同時(shí)酶解香菇液為較佳酶解方式，復(fù)合酶的較佳酶解條件為溫度58.6 ℃、時(shí)間2.02 h、質(zhì)量濃度15.24 mL/g(即超純水體積與香菇粉質(zhì)量的比例)。在此條件下得到的α -氨基態(tài)氮的密度為0.090 1 g/100 mL，感官評(píng)分為7.4，屬于喜歡范疇。

香菇； 蛋白酶； 水解； α -氨基態(tài)氮

香菇又名花菇、香蕈等[1]是一種常見(jiàn)的大型真菌，藥食同源，具有很高的保健和藥用價(jià)值[2-4]，不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖，還含有較多的雙鏈核糖核酸、香菇嘌呤[5]、麥角甾醇、維生素、鈣、鐵、磷等多種功能性成分[6]，具有降血脂、抗腫瘤等功效[7-8]，被贊譽(yù)為“菇中皇后”[9]。香菇中含有豐富的呈味物質(zhì)，但存在多數(shù)小分子呈味物質(zhì)提取不完全，營(yíng)養(yǎng)成分損失嚴(yán)重、主要非揮發(fā)性呈味物質(zhì)呈味效果差、綜合利用率低，產(chǎn)品質(zhì)量不高等問(wèn)題。酶解工藝是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵[10]，高珊[11]研究了有效破壁對(duì)酶解的作用。王麗君[12]研究了微波等輔助作用對(duì)酶解的影響。程玉[13]利用響應(yīng)面得出了酶解的最佳工藝條件。另外，其他團(tuán)隊(duì)也對(duì)酶解工藝進(jìn)行了研究[14-16]。本文利用多種酶復(fù)合酶解香菇，從而提高其酶解液的風(fēng)味物質(zhì)含量，為香菇的精深加工提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

香菇，購(gòu)于濟(jì)南大潤(rùn)發(fā)超市；纖維素酶，南寧龐博生物工程有限公司；菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

ZN- 20L型小型粉碎機(jī)，北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司；GZX- 9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV- 6100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；CR22DⅢ型高速冷凍離心機(jī)，日立有限公司；SG2型便攜式pH計(jì)，梅特勒- 托利多儀器(上海)有限公司；pk- 8D型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AR423CN型天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶解操作

取已制備好的香菇粉2.0 g(以干質(zhì)量計(jì))，按較佳酶活力加入相應(yīng)的酶，按適當(dāng)質(zhì)量濃度加入超純水，自然pH值，在適當(dāng)?shù)臏囟认旅附膺m當(dāng)?shù)臅r(shí)間，后于100 ℃水中滅酶10 min，7 000 r/min、4 ℃條件下冷凍離心15 min，取上清液測(cè)α -氨基態(tài)氮的密度含量。做3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 蛋白質(zhì)測(cè)定

使用考馬斯亮藍(lán)法[17]。

1.3.3 α -氨基態(tài)氮含量的測(cè)定

使用甲醛電位滴定法[18]。

1.3.4 感官評(píng)定

選實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的11人(5男6女)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。評(píng)定員對(duì)不同風(fēng)味的樣品的總體接受程度按照9點(diǎn)快感類別量表測(cè)定方法評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1，極不喜歡；2，非常不喜歡；3，不喜歡；4，較不喜歡；5，一般不喜歡；6，較喜歡；7，喜歡；8，非常喜歡；9，極喜歡。

1.3.5 纖維素酶的優(yōu)化

1.3.5.1 纖維素酶的單因素設(shè)計(jì)

溫度的單因素實(shí)驗(yàn)。酶活力按200 U/g，質(zhì)量濃度按10 mL/g加入超純水，控制溫度分別在35，40，45，50，55 ℃條件下酶解1 h。

時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)。酶活力按200 U/g，質(zhì)量濃度按10 mL/g加入超純水，控制溫度在45 ℃條件下分別酶解0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h。

加酶量的單因素實(shí)驗(yàn)。控制加酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為底料的0.3%，0.5%，1.0%，質(zhì)量濃度按10 mL/g加入超純水，在45 ℃條件下酶解1 h。

1.3.5.2 纖維素酶的正交設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)以香菇水解后的蛋白含量為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)的方法優(yōu)化纖維素酶，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定纖維素酶的溫度、時(shí)間、加酶量3個(gè)因素，根據(jù)酶的性質(zhì)，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平。

1.3.6 確定較優(yōu)蛋白酶組合的實(shí)驗(yàn)

取制備好的香菇粉4組，每份各2.0 g，選擇菠蘿蛋白酶分別與復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)合，調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度為20 mL/g，各加酶量為2 000 U/g，自然pH值，各自最適溫度下酶解3 h后，測(cè)α -氨基態(tài)氮的密度含量，同時(shí)根據(jù)感官評(píng)分選出較優(yōu)蛋白酶組合。每組做3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 纖維素酶添加方式的確定

實(shí)驗(yàn)分4組進(jìn)行，第1組不加纖維素酶直接加風(fēng)味蛋白酶和菠蘿蛋白酶，40 ℃條件下酶解3 h；第2組同時(shí)加入纖維素酶、風(fēng)味蛋白酶和菠蘿蛋白酶40 ℃條件下酶解3 h；第3組先加入纖維素酶45 ℃條件下酶解1 h后，加風(fēng)味蛋白酶、菠蘿蛋白酶40 ℃條件下酶解3 h；第4組先加風(fēng)味蛋白酶和菠蘿蛋白酶40 ℃條件下酶解3 h后，再加纖維素酶45 ℃條件下酶解1 h，4組實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量濃度都按20 mL/g的比例添加超純水40 mL，測(cè)定α -氨基態(tài)氮的密度含量，同時(shí)根據(jù)感官評(píng)分選出較優(yōu)蛋白酶組合。每組做3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 復(fù)合酶條件的優(yōu)化

1.3.8.1 復(fù)合酶的單因素設(shè)計(jì)

取已制備好的香菇粉2.0 g，按纖維素酶的200 U/g酶活添加纖維素酶，按風(fēng)味蛋白酶的2 000 U/g酶活添加風(fēng)味蛋白酶，按復(fù)合蛋白酶的2 000 U/g酶活添加復(fù)合蛋白酶，按10，15，20，25 mL/g的質(zhì)量濃度加入超純水，分別在35，40，45，50，55，60，65 ℃條件下酶解0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，后測(cè)定α -氨基態(tài)氮的密度含量，同時(shí)根據(jù)感官評(píng)分選出較佳復(fù)合酶解條件。每組做3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.8.2 復(fù)合酶的響應(yīng)面設(shè)計(jì)

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定復(fù)合酶的溫度、時(shí)間、液料比3個(gè)因素，根據(jù)每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以α -氨基態(tài)氮的密度為指標(biāo)，利用響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，根據(jù)感官評(píng)分選出復(fù)合酶的較佳酶解條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶條件的優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上確定了纖維素酶的適合酶解條件是在溫度45 ℃的條件下酶解1 h，加酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，為進(jìn)一步確定纖維素酶的較佳酶解條件運(yùn)用L9(33)正交試驗(yàn)表進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1極差分析可以看出，RC>RA>RB各因素影響的主次依次為：加酶量、溫度、時(shí)間。根據(jù)各因素的k1、k2、k3選擇各因素的較優(yōu)組合：溫度40 ℃、時(shí)間1 h、加酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%。

2.2 較優(yōu)蛋白酶組合的確定

選擇菠蘿蛋白酶分別與復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行復(fù)合，以α -氨基態(tài)氮的密度為指標(biāo)測(cè)定酶解液，結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 纖維素酶的正交試驗(yàn)因素水平表

圖1 4組蛋白酶對(duì)香菇酶解液α -氨基態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of proteases on α -amino nitrogen content and sensory evaluation of mushroom hydrolysis

由圖1可知，4組蛋白酶對(duì)于香菇α -氨基態(tài)氮的密度含量和感官評(píng)分均有顯著的影響。顯然，菠蘿蛋白酶與復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合的酶解液中α -氨基態(tài)氮的密度含量高，表明蛋白酶酶解出了較多的呈味物質(zhì)，但同時(shí)也酶解出了較多的苦味物質(zhì)，這嚴(yán)重影響了酶解液的整體感官評(píng)分。菠蘿蛋白酶與木瓜蛋白酶水解出的呈味物質(zhì)少導(dǎo)致感官評(píng)分低，綜上所述，選菠蘿蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組合對(duì)香菇進(jìn)行下一步的酶解實(shí)驗(yàn)。

2.3 纖維素酶添加方式的確定

將纖維素酶以不同方式添加到香菇粉中進(jìn)行酶解，得到如下4組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 纖維素酶添加方式對(duì)α -氨基態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effects of cellulase adding ways on α -amino nitrogen content

由圖2可以看出不加纖維素酶與加纖維素酶有明顯的不同。先加纖維素酶的酶解液中雖然α -氨基態(tài)氮密度高，但水解出的苦味呈味物質(zhì)影響了感官評(píng)分，所以選同時(shí)加入3種酶的方式，該酶解方式不僅α -氨基態(tài)氮密度含量與感官評(píng)分高，同時(shí)能縮短酶解時(shí)間，提高酶解效率，降低生產(chǎn)成本。

2.4 復(fù)合酶酶解條件的優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上確定了復(fù)合酶的適合酶解條件是在溫度55 ℃的條件下酶解2 h，質(zhì)量濃度為15 mL/g，為進(jìn)一步確定復(fù)合酶的較佳酶解條件運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.2 方差分析與顯著性分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design -Expert 8.0.6.0軟件，以α -氨基態(tài)氮的密度為響應(yīng)值，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到回歸方程為：

y=-0.733 36+0.025 492x1+0.096 415x2+

4.068 20×10-3x3+1.470 80×10-4x1x2+

8.460 52×10-5x1x3-2.364 00×

表3 方差分析結(jié)果

2.4.3 響應(yīng)面結(jié)果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design -Expert 8.0.6.0軟件得到復(fù)合酶的較佳酶解條件為溫度58.64 ℃，時(shí)間2.02 h，質(zhì)量濃度15.24 mL/g，得到的α -氨基態(tài)氮密度含量最高為0.094 97 g/100 mL。根據(jù)實(shí)際情況，較佳酶解條件為溫度58.6 ℃，時(shí)間2.02 h，質(zhì)量濃度為15.24 mL/g，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，得到的α -氨基態(tài)氮的密度為0.090 1 g/100 mL，酶解液具有較強(qiáng)的香菇特征風(fēng)味和較強(qiáng)的鮮味，幾乎無(wú)苦味，感官評(píng)分為7.4，屬于喜歡范疇，與預(yù)測(cè)值有較好擬合性，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到的復(fù)合酶酶解條件具有實(shí)際參考價(jià)值。

3 結(jié) 論

纖維素酶水解的較佳條件為溫度40 ℃、時(shí)間1 h、加酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%。綜合考慮α -氨基態(tài)氮的密度和感官評(píng)分結(jié)果，選擇菠蘿蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組合對(duì)香菇進(jìn)酶解?？紤]α -氨基態(tài)氮的密度和感官評(píng)分，再加上生產(chǎn)流程和生產(chǎn)成本綜合考慮，選擇3種酶同時(shí)加入的酶解方式。優(yōu)化的較佳酶解條件為溫度58.6 ℃，時(shí)間2.02 h，質(zhì)量濃度為15.24 mL/g，在此條件下得到的α -氨基態(tài)氮的密度含量為0.090 1 g/100 mL，酶解液具有較強(qiáng)的香菇特征風(fēng)味和較強(qiáng)的鮮味，幾乎無(wú)苦味，感官評(píng)分為7.4，屬于喜歡范疇。

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(責(zé)任編輯：李 寧)

Study on Enzymolysis Technology of Shiitake Mushroom Seasoning

SHEN Wenfeng1,2, WANG Yueming2, XU Zhixiang1, CUI Wenjia2, GONG Zhiqing2, SHI Xianquan2, WANG Wenliang1,2,*

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,ShandongAgricultureUniversity,Tai’an271018,China; 2.InstituteofAgro-ProductsProcessingScienceandTechnology/ShandongProvincialKeyLaboratoryofAgro-ProductsProcessingTechnology,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan250100,China)

In this study, the optimal processing of enzymatic hydrolysis of shiitake mushrooms has been studied using three enzymes, in order to improve the enzymatic efficiency and sensory evaluation. First, the hydrolysis conditions of cellulase were optimized by orthogonal experiments. The results showed that the optimum hydrolysis conditions were temperature 40 ℃, hydrolysis time 1 h, and enzyme dosage 0.5%. Second, bromelain and flavourzyme were screened out using α - amino nitrogen content and sensory evaluation as indicators. Third, the enzyme hydrolysis conditions were optimized by the response surface test. The results showed that the optimum conditions were hydrolysis temperature 58.6 ℃, hydrolysis time 2.02 h, and concentration 15.24 mL/g (water volume: shiitake mushroom powder quantity). Under the optimum conditions, the α -amino nitrogen content was 0.090 1 g/100 mL and the sensory score was 7.4, belonging to the category of favorite.

shiitake mushroom; protease; hydrolysis;α-amino nitrogen

10.3969/j.issn.2095 -6002.2017.03.012

2095 -6002(2017)03 -0078 -05

沈文鳳， 王月明， 徐志祥, 等. 香菇調(diào)味料酶解工藝研究[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2017,35(3):78-82.

SHEN Wenfeng, WANG Yueming, XU Zhixiang, et al. Study on enzymolysis technology of shiitake mushroom seasoning[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(3):78-82.

2016 -09 -08

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌產(chǎn)后加工崗位專家項(xiàng)目(SDAIT -07 -08)；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題(魯財(cái)農(nóng)指[2014]38)。

沈文鳳，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全；

TS202.3

A

*王文亮，男，副研究員，主要從事食用菌精深加工等方面的研究，通信作者。