徐 茜，馬雪萍，賀家勇

·基礎(chǔ)研究·

維藥神香草對(duì)治療哮喘大鼠的免疫機(jī)制研究

徐 茜，馬雪萍，賀家勇

目的觀察維藥神香草對(duì)哮喘大鼠白介素(interleukin，IL)-6、嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)的影響，探討其治療哮喘的部分免疫機(jī)制。方法將健康Wistar大鼠50只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、哮喘模型組、地塞米松組、神香草多糖低劑量組、神香草多糖高劑量組5組，每組10只。正常對(duì)照組腹腔注射1 mL無(wú)菌生理鹽水；其余4組激發(fā)致敏引喘，每天灌胃給藥1mL(地塞米松組給藥為0.5 mg/kg，神香草多糖低、高劑量組灌胃分別為0.65、2.60 g/kg)。藥物干預(yù)1周后，末次激發(fā)結(jié)束后24 h內(nèi)，每組隨機(jī)取8只大鼠，支氣管肺泡灌洗，收取支氣管肺泡灌洗液，測(cè)量EOS。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中IL-6的表達(dá)水平。用圖像Pro-Plus分析軟件進(jìn)行灰度分析。結(jié)果5組間支氣管肺泡灌洗液中EOS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。哮喘模型組EOS高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。神香草多糖低、高劑量組EOS明顯低于哮喘模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；神香草多糖低劑量組EOS高于地塞米松組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；神香草多糖高劑量組EOS與地塞米松組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。IL-6在胞漿表達(dá)，支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞和浸潤(rùn)的炎細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，肺泡間質(zhì)也出現(xiàn)少量的表達(dá)。哮喘模型組IL-6的表達(dá)高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；神香草多糖低、高劑量組IL-6的表達(dá)低于哮喘模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；神香草多糖低、高劑量組IL-6與地塞米松組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論神香草多糖可抑制哮喘大鼠IL-6的分泌，降低肺泡灌洗液中EOS，減輕哮喘大鼠的炎癥反應(yīng)，提示神香草多糖具有較好的抗炎作用。

維藥；神香草；哮喘；免疫機(jī)制；白介素-6；大鼠

支氣管哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞參與的慢性氣道炎性疾病[1-2]。哮喘的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前研究哮喘發(fā)病的關(guān)鍵在于氣道變應(yīng)性炎癥。變應(yīng)性哮喘發(fā)生過(guò)程中重要的免疫學(xué)改變是輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)1/Th2失衡，主要表現(xiàn)為Th2細(xì)胞因子白介素(interleukin，IL)-4、IL-6等產(chǎn)生增多，而Th1數(shù)量減少，功能減弱，細(xì)胞因子IL-12、γ-干擾素等減少[3-4]。目前治療哮喘的藥物主要分為緩解哮喘發(fā)作和控制哮喘發(fā)作2類藥物，由于這些藥物治療時(shí)間較長(zhǎng)，尤其是糖皮質(zhì)激素具有一定的副作用[5]，有必要尋找新的藥物治療哮喘。維藥神香草為唇形科多年生草本植物，維吾爾名為祖帕奇尼(祖帕)，維吾爾醫(yī)學(xué)常用其治療氣管炎咳嗽、氣喘、感冒發(fā)熱和風(fēng)濕等病癥[6-7]。本研究通過(guò)制備哮喘動(dòng)物模型，分析維藥神香草對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子的影響，旨在探討維藥神香草對(duì)哮喘大鼠的免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 6周齡健康Wistar大鼠50只，體重170～200 g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK-(新)2003-2001]，將50只大鼠隨機(jī)分為5組(n＝10)，即正常對(duì)照組、哮喘模型組、地塞米松組、神香草多糖低劑量組、神香草多糖高劑量組。

1.1.2 試藥與主要儀器 神香草購(gòu)于新疆維吾爾醫(yī)院，由李永和主任藥師鑒定為唇形科神香草屬神香草。按參考文獻(xiàn)[8]制備神香草多糖提取液，根據(jù)人的推薦劑量3～6 g，設(shè)定神香草多糖低劑量組和高劑量組灌胃劑量分別為0.65 g/kg和2.60 g/kg。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備與藥物干預(yù) 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，實(shí)驗(yàn)第1天和第8天，正常對(duì)照組腹腔注射無(wú)菌生理鹽水1 mL，其余4組腹腔注射由10 mg卵清蛋白(ovalbumin，OVA)+100 mg氫氧化鋁+0.2 mL百白破混合疫苗組成的混懸液1mL以致敏。從第15天開始，除正常對(duì)照組外，其余4組以10% OVA生理鹽水霧化吸入20 min以激發(fā)引喘，觀察大鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、有明顯的腹式呼吸、皮膚瘙癢、嗆咳等癥狀時(shí)，提示引喘成功。各用藥組于每天激發(fā)前30 min灌胃給藥1 mL(地塞米松組給藥為0.5 mg/kg，神香草多糖低、高劑量組灌胃分別為0.65、2.60 g/kg)。實(shí)驗(yàn)第21天(藥物干預(yù)1周后)，末次激發(fā)結(jié)束后24 h內(nèi)，每組隨機(jī)取8只大鼠，用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，于腹主動(dòng)脈取血，立即行氣管插管，支氣管肺泡灌洗，收取支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，4℃，1 500 r/min離心10 min，棄上清，沉渣以lmL Hanks液緩慢重懸。取50μL細(xì)胞沉淀涂片，干燥固定，瑞氏染色顯微鏡下觀察至少4個(gè)視野，且至少500個(gè)白細(xì)胞中EOS。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中IL-6的表達(dá)水平 收集各組大鼠右肺中葉，用10%甲醛溶液固定，肺組織切片經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后制成4 μm組織切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中IL-6的表達(dá)水平。肺組織胞漿出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。采用400倍鏡下觀察，隨機(jī)選取8個(gè)視野，用圖像Pro-Plus分析軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，5組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用最小顯著差數(shù)法t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 正常對(duì)照組大鼠未發(fā)現(xiàn)明顯變化；其余各組OVA超聲霧化吸入后，明顯有煩躁不安、頻繁撓鼻、嗆咳、點(diǎn)頭呼吸、呼吸急促現(xiàn)象。經(jīng)連續(xù)激發(fā)后，大鼠活動(dòng)明顯減少，有的大鼠俯伏不動(dòng)，體重不增長(zhǎng)或增長(zhǎng)緩慢，毛發(fā)的光澤度下降。地塞米松組大鼠僅個(gè)別見頭面部瘙癢表現(xiàn)，其余大鼠均未見明顯異常表現(xiàn)。

2.2 BALF中EOS 5組間BALF中EOS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝228.031，P＜0.001)。哮喘模型組EOS高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝-13.169，P＜0.001)。神香草多糖低、高劑量組EOS明顯低于哮喘模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為-8.192、12.610，P均＜0.001)。神香草多糖低劑量組EOS高于地塞米松組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝12.547，P＜0.01)；神香草多糖高劑量組EOS與地塞米松組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝0.256，P＝0.805)。見表1。

2.3 IL-6在大鼠肺組織中的表達(dá) IL-6在胞漿表達(dá)，支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞和浸潤(rùn)炎細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，肺泡間質(zhì)也出現(xiàn)少量的表達(dá)(圖1)。

圖1 IL-6在大鼠肺組織中的表達(dá)

哮喘模型組IL-6水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝23.634，P＜0.001)；神香草多糖低、高劑量組IL-6水平低于哮喘模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為14.576、12.251，P均＜0.001)；而神香草多糖低、高劑量組IL-6水平與地塞米松組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為 2.043、1.697，P均＞0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織中IL-6表達(dá)

3 討論

神香草為唇形科植物硬尖神香草的干燥地上部分，主要產(chǎn)于新疆北部(阿爾泰地區(qū))山區(qū)，是維吾爾醫(yī)學(xué)常用藥材。已在新疆維吾爾自治區(qū)人工種植成功，近年來(lái)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。研究表明，神香草精油具有解除支氣管痙攣、鎮(zhèn)咳作用，在減輕氣道炎癥反應(yīng)和改善細(xì)胞因子的平衡方面也起到了重要的作用[7]。研究報(bào)道，維藥神香草乙酸乙酯部位能明顯降低哮喘大鼠血清中內(nèi)皮素-1、IL-2、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，其呈劑量依賴性趨勢(shì)，提示維藥神香草可通過(guò)抑制IL-2、IL-6、TNF-α的分泌減輕哮喘的炎癥反應(yīng)[9]。Calin等[10]通過(guò)止咳實(shí)驗(yàn)、祛痰實(shí)驗(yàn)制備哮喘動(dòng)物模型，分析維藥神香草對(duì)哮喘相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平的影響，為開發(fā)治療哮喘的新藥提供理論依據(jù)。

哮喘發(fā)病過(guò)程中的病理生理學(xué)改變與EOS的聚集、活化和脫顆粒密切相關(guān)，T淋巴細(xì)胞中EOS相互作用是哮喘發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，主要靶細(xì)胞是Th2，誘發(fā)EOS炎癥反應(yīng)。哮喘發(fā)作時(shí)支氣管肺泡灌洗液中有大量炎癥細(xì)胞。本研究通過(guò)建立Wistar大鼠哮喘模型，從大鼠行為學(xué)改變證實(shí)建模成功。EOS是哮喘氣道反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，其活性直接決定了哮喘發(fā)作和氣道高反應(yīng)的嚴(yán)重程度[11-12]。本研究采用OVA生理鹽水霧化激發(fā)的方法制備大鼠哮喘模型，測(cè)定其BALF中EOS，結(jié)果顯示哮喘模型組大鼠BALF中EOS明顯升高，神香草低劑量組EOS與地塞米松組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，神香草高劑量組EOS與地塞米松組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示神香草多糖高劑量可減少肺內(nèi)EOS浸潤(rùn)，改善肺功能。

IL-6是具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，也是機(jī)體復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，它可以調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子的作用。IL-6來(lái)源于單核細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞等，是一種具有復(fù)雜生理學(xué)功能的細(xì)胞因子，除參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和抗感染防御機(jī)制外，還與某些呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。IL-6能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與免疫調(diào)節(jié)，可平衡前炎癥細(xì)胞因子或早期細(xì)胞因子的損傷效應(yīng)[13-14]。IL-6在哮喘的病理學(xué)作用還不十分清楚。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法對(duì)各組大鼠肺組織IL-6表達(dá)及定位、定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)IL-6在胞漿陽(yáng)性表達(dá)，主要表達(dá)在肺組織、支氣管上皮細(xì)胞和浸潤(rùn)的炎細(xì)胞。經(jīng)灰度值測(cè)定后發(fā)現(xiàn)：哮喘模型組IL-6表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組；神香草多糖低、高劑量組IL-6表達(dá)水平均下降，以神香草多糖高劑量組IL-6水平下降明顯，與哮喘模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，而與地塞米松組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示神香草多糖高劑量對(duì)IL-6的作用與地塞米松相當(dāng)，可以降低IL-6的表達(dá)，減輕哮喘的炎癥反應(yīng)。李玉秀和苗英慧[15]研究顯示，支氣管哮喘患者在哮喘急性發(fā)作期血清中IL-6、TNF-α的濃度均高于恢復(fù)期和正常對(duì)照組。提示細(xì)胞因子IL-6參與了哮喘的發(fā)病過(guò)程，檢測(cè)其水平變化對(duì)探討支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制和預(yù)后評(píng)估具有重要的臨床意義。

本研究以Wistar大鼠為研究對(duì)象，采用霧化吸入OVA致敏的方法制備大鼠哮喘模型，給予神香草多糖進(jìn)行干預(yù)，神香草多糖可明顯抑制哮喘大鼠IL-6的分泌，降低肺泡灌液中EOS，減輕哮喘大鼠的炎癥反應(yīng)。另外，Th1/Th2失衡是變應(yīng)性哮喘發(fā)生過(guò)程中重要的免疫學(xué)特征性改變，主要表現(xiàn)為Th2數(shù)目增多和功能亢進(jìn)[16]。本研究?jī)H探討Th2細(xì)胞因子IL-6在哮喘中的表達(dá)水平與作用，神香草是否能糾正Th1/Th2失衡、Th1在哮喘中的作用有待于更進(jìn)一步的研究。

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The immunemechanism of Uygur medicine Hyssopus officinalis in asthmatic rats

XU Qian1，MA Xueping1，HE Jiayong2
(1.Department of Immunology，College of Preclinical Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi Xinjiang 830054，China；2.Department of Surgery，Staff-worker Hospital of Urumqi Petrochemical Subsidiary China National Petroleum，Urumqi Xinjiang 830019，China)

ObjectiveTo observe the effects of Uygurmedicine Hyssopus officinalis on interleukin-6(IL-6)and eosinophil(EOS)in asthmatic rats and to explore the mechanism of partial immunization of asthma.MethodsFifty healthy Wistar rats were randomly divided into normal control group，asthmatic model group，dexamethasone group，low dose Hyssopus officinalis polysaccharide group and high dose Hyssopus officinalis polysaccharide group.The negative normal control group was intraperitoneally injected with 1 mL sterile saline，the other four groupswere sensitized and induced asthma，the rats in treatment group were administered 1 mL per day(dexamethasone group with the concentration of 0.5 mg/kg，low dose Hyssopus officinalis polysaccharide and high dose Hyssopus officinalis polysaccharide group with 0.65 g/kg and 2.60 g/kg，resectively.After 1 week，at the end of excitation，each group were randomly selected 8 rats，bronchoalveolar lavage fluid (BALF)was collected for EOS.The expression of IL-6 in lung tissuesweremeasured by immunohistochemistry.ResultsThe EOS of BALF was statistically significant(P＜0.001).EOS in asthmatic model group was higher than that in the normal control group，the difference was statistically significant(P＜0.001).EOS counts in the low and high dose groupswere significantly lower than those inthe asthmaticmodel group(P＜0.001).EOS in low dose Hyssopus officinalis polysaccharide group was higher than that in dexamethasone group，the difference was statistically significant(P＜0.01). There was no significant difference in the EOS counts between the high dose group and the dexamethasone group(P＞0.05).The expression of IL-6 in cytoplasm，positive expression of IL-6 located in bronchial ciliated columnar epithelial cells and infiltrating inflammatory cells.The expression of IL-6 in the lung tissue of the asthma group was higher than that in the normal control group，the difference was statistically significant(P＜0.001).The expression of IL-6 in low dose group and high dose Hyssopus officinalis polysaccharide group was lower than that in asthmaticmodel group(P＜0.001).The level of IL-6 in the high and low dose group was slightly higher than that in the dexamethasone group，but the difference was not statistically significant(P＞0.05).ConclusionThe Hyssopus officinalis polysaccharide can inhibit the secretion of IL-6 and decrease the EOS content in BALF and relieve the inflammatory reaction in asthmatic rat.The polysaccharide of Hyssopusofficinalis may have a good anti-inflammatory effect.

Uygurmedicine；Hyssopus officinalis；Asthmatic；Immunemechanism；Interleukin-6(IL-6)；Rats

R291.5

A

2095-3097(2017)04-0203-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.04.003

2016-12-07 本文編輯：張?jiān)谖?

新疆重大疾病醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(SKLIB-XJMDR-2015-Y8)

830054新疆烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室(徐 茜，馬雪萍)；830019新疆 烏魯木齊，中國(guó)石油烏魯木齊石化公司職工醫(yī)院外科(賀家勇)

賀家勇，E-mail：29320508＠qq.com