史秀云， 柳云恩， 張玉彪， 佟昌慈， 施 琳， 叢培芳， 劉 穎， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實(shí)驗(yàn)室遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016

·爆震傷·

小鼠腦爆震傷中PI3K/Akt通路及相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)情況

史秀云， 柳云恩， 張玉彪， 佟昌慈， 施 琳， 叢培芳， 劉 穎， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實(shí)驗(yàn)室遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016

目的 探討小鼠腦爆震傷后不同時間點(diǎn)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路及相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)情況。方法 將50只雄性小鼠通過隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(n=10)和模型組(n=40)，再將模型組根據(jù)造模成功后時間分為3 h組、6 h組、12 h組和24 h組，每組各10只。測定各組腦組織含水量與伊文思藍(lán)含量，并采用Western blot以及實(shí)時熒光定量PCR等技術(shù)檢測各組小鼠腦組織中PI3K、Akt、Bcl-2、Bax的含量和mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果 模型組各時間點(diǎn)腦組織含水量與伊文思藍(lán)含量較對照組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot檢測與實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果一致。Akt、PI3K和Bcl-2表達(dá)，3 h組、6 h組均較對照組顯著降低，6 h組達(dá)到最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；12 h組、24 h組較6 h組有所升高，但仍低于對照組，且與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Bax表達(dá)，3 h組、6 h組、12 h組均較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；24 h組較12 h組有所降低，但仍高于對照組，且與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 顱腦爆震傷中PI3K/Akt通路和凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)變化對其判斷和治療有一定提示作用。

顱腦爆震傷； 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路； Bcl-2； Bax

近年來，暴恐襲擊事件增多以及高能武器大量應(yīng)用使得爆震傷發(fā)生率逐年遞增[1]。爆震傷傷情復(fù)雜，死亡率高，其中以頭部損傷造成的后果最為嚴(yán)重[2-3]。由于腦部結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物機(jī)制多變，目前關(guān)于腦爆震傷的傷情特點(diǎn)及致傷機(jī)制的研究還處于起步階段。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路是重要的細(xì)胞存活信號通路，已被證實(shí)在腦缺血神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起調(diào)控作用[4]。而Bcl-2和Bax是研究較為深入的與凋亡調(diào)控相關(guān)的蛋白[5-6]。因此，本研究通過建立腦爆震傷的小鼠模型，檢測不同時間點(diǎn)腦組織含水量與伊文思藍(lán)含量，以及腦組織中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax的表達(dá)情況，探討PI3K/Akt通路及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax在腦爆震傷中的作用，旨在為研究爆震傷致腦損傷的損傷特點(diǎn)及機(jī)制提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 選取50只雄性昆明小鼠，由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供并飼養(yǎng)，食物、水由動物實(shí)驗(yàn)中心提供，確保不含對本研究結(jié)果引起干擾的成分。將50只雄性小鼠通過隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(n=10)和模型組(n=40)，再將模型組根據(jù)造模成功后時間分為3 h組、6 h組、12 h組和24 h組，每組各10只。

1.2 小鼠腦爆震傷模型構(gòu)建 將小鼠麻醉后，放于保護(hù)罩內(nèi)，保護(hù)小鼠其他部位，只顯露腦部，隨后將其固定于自主設(shè)計(jì)研發(fā)的高仿真爆震傷模型裝置的網(wǎng)狀部位，下方空氣壓縮裝置使空氣壓縮，將0.8 mm的鋁薄放于中間層固定，通電后鋁膜爆破，下方炮筒壓力達(dá)0.12 MPa，超壓波顯示壓力為0.55 MPa。

1.3 腦組織含水量與伊文思藍(lán)含量檢測 腦組織含水量采用干濕法中的Bliott公式計(jì)算，取全腦組織用電子天平稱質(zhì)量(濕質(zhì)量，精確到0.1 mg)，置于恒溫箱烘烤24 h后稱干質(zhì)量。伊文思藍(lán)含量檢測需在各組動物處死0.5 h前以2 ml/kg的比例尾靜脈注入2% EB。麻醉后打開胸腔，心內(nèi)灌注肝素生理鹽水200～300 ml，斷頭取腦稱取質(zhì)量后剪碎放于二甲基甲酰胺，經(jīng)37℃水浴24 h后,1 000 r/min離心5 min，取上清液測定光密度(OD)并記錄，計(jì)算后得到伊文思藍(lán)含量。

腦組織水含量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%

1.4 Western blot檢測 分別于腦爆震傷后3、6、12、24 h取小鼠腦組織并將取得的腦組織即刻置于液氮罐中凍存待用。將凍存在液氮中的腦組織取出，置于冰上融化，加入RIPA裂解液后制備成組織勻漿，離心后取上層蛋白溶液，測定其蛋白的濃度并配平，置于-80℃中備用。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜之后，加入一抗GADPH(購自Santa公司)、PI3K(購自Abcam公司)、Akt(購自Abcam公司)、Bcl-2(購自Abcam公司)及Bax(購自Abcam公司)，經(jīng)4℃雜交過夜，二抗孵育，ECL發(fā)光，最后通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測 取適量腦組織置于研缽中，加入液氮后將組織研碎，按Trizol試劑操作說明書進(jìn)行。RNA沉淀干燥后，加入DEPC水復(fù)溶。依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，得到表達(dá)的cDNA。通過SYBR Green實(shí)時熒光定量PCR法，對GADPH、PI3K、Akt、Bcl-2和STAT3進(jìn)行實(shí)時熒光定量分析。并以GAPDH為參比基因，計(jì)算各目的基因/參比基因的相對定量。

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量與伊文思藍(lán)含量檢測 模型組各時間點(diǎn)腦組織含水量與伊文思藍(lán)含量較對照組均明顯升高，在12 h達(dá)到高峰隨后降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 Western blot檢測 通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測小鼠腦組織中相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果見圖1。對AKT、PI3K、Bcl-2和Bax的條帶進(jìn)行半定量分析，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，Akt、PI3K和Bcl-2表達(dá)，3 h組、6 h組均較對照組顯著降低，6 h組達(dá)到最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；12 h組、24 h組較6 h組有所升高，但仍低于對照組，且與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Bax表達(dá)，3 h組、6 h組、12 h組均較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；24 h組較12 h組有所降低，但仍高于對照組，且與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組小鼠腦組織含水量及伊文思藍(lán)含量比較

注：與對照組比較，①P<0.05

2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測 通過實(shí)時熒光定量PCR檢測小鼠腦組織mRNA表達(dá)，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，AKT、PI3K、Bcl-2和Bax的表達(dá)水平與Western blot結(jié)果相一致。Akt、PI3K和Bcl-2表達(dá)，3 h組、6 h組均較對照組顯著降低，6 h組達(dá)到最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；12 h組、24 h組較6 h組有所升高，但仍低于對照組，且與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Bax表達(dá)，3 h組、6 h組、12 h組均較對照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；24 h組較12 h組有所降低，但仍高于對照組，且與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖3。

圖1 Western blot結(jié)果

圖2 Western blot半定量分析結(jié)果(與對照組比較，①P<0.05)

組別AKTPI3KBcl-2Bax對照組7.92±1.121.89±0.283.28±0.352.77±0.323h組4.35±1.32①0.92±0.19①1.93±0.21①5.67±1.31①6h組3.56±0.88①0.82±0.17①1.52±0.23①5.77±0.99①12h組5.67±1.011.52±0.342.91±0.255.75±0.84①24h組5.78±1.111.63±0.272.43±0.373.51±0.47

注：與對照組比較，①P<0.05

3 討論

爆震傷導(dǎo)致的顱腦損傷是爆震傷死亡率居高不下的原因之一，其特點(diǎn)是外輕內(nèi)重、傷情變化快且傷情復(fù)雜[7]。爆震傷對腦組織造成的損傷是由炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等多方面作用的結(jié)果，神經(jīng)凋亡在其中處于關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[8-9]。PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路作為細(xì)胞生存重要通路之一，通過影響下游通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄或其轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的生成,常參與調(diào)節(jié)機(jī)體凋亡和創(chuàng)傷反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[10]。其相關(guān)凋亡蛋白參與腦損傷的修復(fù)和發(fā)生的研究已經(jīng)得到較為廣泛的重視。其中，PI3K激活的Akt可以通過磷酸化作用，進(jìn)一步激活或抑制其下游靶蛋白Bad、caspase9、NF-κB等因子促進(jìn)細(xì)胞存活，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子[11]。PI3K/Akt信號分子的下調(diào)提示顱腦爆震傷初期神經(jīng)凋亡的發(fā)生[12]。有研究通過小鼠液壓傷模型發(fā)現(xiàn)，Akt在造模后1h表達(dá)減少,4 h回升,24 h達(dá)到正常水平[13]，與爆震傷顱腦外傷變化趨勢趨于一致。同時，細(xì)胞凋亡過程中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，且呈時間依賴性，并伴有促凋亡蛋白Bax的表達(dá)升高，導(dǎo)致抗凋亡和促凋亡因素的比例下降，使細(xì)胞走向凋亡。

圖3 實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果(與對照組比較，①P<0.05)

腦組織含水量變化可提示腦水腫的發(fā)生，爆震傷小鼠的血腦屏障通透性改變與腦組織含水量顯著降低是顱腦爆震傷的病理性過程，對于后續(xù)相關(guān)分子改變和疾病的發(fā)展有重要影響[14-15]。因此，本研究通過測定爆震傷后腦組織水含量和伊文思藍(lán)含量，并在不同時間點(diǎn)測量腦組織中PI3K、Akt、Bcl-2和Bax的變化，進(jìn)一步明確PI3K/Akt通路和相關(guān)凋亡蛋白在腦爆震傷中的作用。結(jié)果表明，相關(guān)蛋白表達(dá)的變化趨勢和mRNA的變化趨勢一致，進(jìn)一步證明顱腦爆震傷發(fā)生時相關(guān)凋亡因子的變化情況。

綜上所述，顱腦爆震傷后機(jī)體產(chǎn)生復(fù)雜的應(yīng)激反應(yīng)。其中，PI3K/Akt 信號通路和相關(guān)的凋亡蛋白參與顱腦爆震傷的發(fā)生和發(fā)展，其表達(dá)量與損傷時間相關(guān)。因此，干預(yù)其通路的表達(dá)可能成為爆震導(dǎo)致腦損傷的有效治療方法之一。

[1] Chang R,Holcomb JB.Optimalfluid therapy for traumatic hemorrhagic shock[J].Crit Care Clin,2017,33(1):15-36.

[2] Shein SL,Shellington DK,Exo JL,et al.Hemorrhagic shock shifts the serum cytokine profile from pro- to anti-inflammatory after experimental traumatic brain injury in mice[J].J Neurotrauma,2014,31(16):1386-1395.

[3] Mcmahon CG,Kenny R,Bennett K,et al.The effect of acute traumatic brain injury on the performance of shock index[J].J Trauma,2010,69(5):1169-1175.

[4] Tejeda GS,Ayuso-Dolado S,Arbeteta R,et al.Brainischaemia induces shedding of a BDNF-scavenger ectodomain from TrkB receptors by excitotoxicity activation of metalloproteinases and γ-secretases[J].J Pathol,2016,238(5):627-640.

[6] Wennersten A,Holmin S,Mathiesen T.Characterization of Bax and Bcl-2 in apoptosis after experimental traumatic brain injury in the rat[J].Acta Neuropathol,2003,105(3):281-288.

[7] 柳云恩,劉 穎,史秀云,等.爆震沖擊波對大鼠腦組織炎癥因子IL-1β、IL-6及IL-10表達(dá)影響[J].創(chuàng)傷與急危重病醫(yī)學(xué),2016,4(6):336-340.

[8] Koliatsos VE,Cernak I,Xu L,et al.A mouse model of blast injury to brain:initialpathological,neuropathological,and behavioral characterization[J].J Neuropathol Exp Neurol,2011,70(5):399-416.

[9] Sponheim SR,Mc Guire KA,Kang SS,et al.Evidence of disrupted functional connectivity in the brain after combat-related blast injury[J].Neuroimage,2011,54(Suppl 1):S21-S29.

[10] Chen SF,Tsai HJ,Hung TH,et al.Salidroside improves behavioral and histological outcomes and reduces apoptosis via PI3K/Akt signaling after experimental traumatic brain injury[J].PLoS One,2012,7(9):e45763.

[11] Chang F,Lee JT,Navolanic PM,et al.Involvement of PI3K/Akt pathway in cell cycle progression,apoptosis,and neoplastic transformation:a target for cancer chemotherapy[J].Leukemia,2003,17(3):590-603.

[12] Zhuang Z,Zhao X,Wu Y,et al.The anti-apoptotic effect of PI3K-Akt signaling pathway after subarachnoid hemorrhage in rats[J].Ann Clin Lab Sci,2011,41(4):364-372.

[13] Noshita N,Lewén A,Sugawara T,et al.Akt phosphorylation and neuronal survival after traumatic brain injury in mice[J].Neurobiol Dis,2002,9(3):294-304.

[14] 戴 晶,劉學(xué)磊,金紅旭.輕度顱腦爆震傷與血腦屏障關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2017,26(5):493-497.

[15] 張廣林,王本瀚,高國棟,等.原發(fā)性顱腦爆震傷犬早期病理生理機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2014,13(10):999-1002.

Expression of PI3K/Akt pathway and related apoptotic proteinsinmouse braininduced by traumatic shock

SHI Xiu-yun,LIU Yun-en,ZHANG Yu-biao,TONG Chang-ci,SHI Lin,CONG Pei-fang,LIU Ying,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao

(Emergency Medicine Department of General Hospital of Shenyang Military Command, Laboratory of Rescue Center of Severe Wound and Trauma PLA, Severe Trauma and Organ Protection key Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110016, China)

Objective To investigate the expression of PI3K/Akt pathway and related apoptosis proteins Bcl-2 and Bax at different time points after blast injury.Methods A total of 50 experimental male rats were randomly divided into the control group(n=10)and the model group(n=40).The rats in the model group were divided into the group of 3 hours,6 hours and 24 hours,with 10 rats in each group.Brain water content and Evans blue content were detected in brain tissues.Western-blot and Real-time PCR methods were used for determination of PI3K,Akt,Bcl-2 and Bax content and expression changes of mRNA in mouse brain tissues.Results The brain water content and Evans blue content in model groups at each time point were significantly improved after modeling,and the differences between the groups had statistical significance(P<0.05).Compared with the control group,the expression of PI3K,Akt and anti-apoptotic factor Bcl-2 were significantly lower than those of the control group,and the expression in groups of 12 hours and 24 hours increased back to normal(P<0.05);the expression of pro-apoptotic factor Bax was significantly increased(P<0.05).Conclusion The changes of PI3K/Akt pathway and Bcl-2 and Baxmayhelpdetermine and carry out treatment of craniocerebralblast injury.

Traumatic brain blast injury; PI3K/Akt pathway; Bcl-2; Bax

全軍十二五面上項(xiàng)目(CSY12J002)；全軍重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目(2013ZX09J13109-02B)；全軍十二五面上項(xiàng)目(CSY13J002)； 總后衛(wèi)生部重大新上(ASM14L008)

史秀云(1991-)，女，遼寧鐵嶺人，技師，碩士

侯明曉，E-mail：houmingxiao188@163.com

2095-5561(2017)04-0215-05 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.04.05

2017-5-22