徐黎青，韋江啟（新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院心胸外科，河南新鄉(xiāng) 453000）

烏司他丁通過誘導miR-155抑制體外循環(huán)心臟手術(shù)患者炎癥反應的作用機制研究

徐黎青＊，韋江啟（新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院心胸外科，河南新鄉(xiāng) 453000）

目的：研究烏司他丁在體外循環(huán)（CPB）心臟手術(shù)中對患者炎癥因子抑制作用的機制。方法：選取2012年7月－2016年7月于我院擇期行CPB心臟手術(shù)的40例患者為研究對象，按照隨機數(shù)字表法分為對照組和觀察組，各20例。觀察組患者于麻醉誘導后即給予30萬U烏司他丁靜脈泵注，以2.5 mL/min的速率在20 min內(nèi)完成，再將70萬U烏司他丁以0.2 mL/min的速率使用微量泵持續(xù)靜脈泵注至術(shù)畢；對照組患者給予等容量生理鹽水。分別于麻醉誘導前（術(shù)前）和CPB停止（術(shù)后）6、12、24 h采集患者血液標本，以實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測外周血單核細胞中微小核糖核酸155（miR-155）及其靶基因髓樣分化因子88（MyD88）的表達情況；以酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）和IL-8的表達情況；采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析觀察組患者術(shù)后24 h的miR-155與TNF-α、IL-6、IL-8表達的相關(guān)性。結(jié)果：與對照組比較，觀察組患者的miR-155表達水平顯著升高，其靶基因MyD88的表達水平顯著降低，炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。觀察組患者術(shù)后24 h的miR-155與TNF-α、IL-6、IL-8的表達水平呈顯著負相關(guān)（P＜0.01）。結(jié)論：烏司他丁可通過誘導miR-155的表達來抑制炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的釋放，這可能是該藥在CPB心臟手術(shù)中發(fā)揮抗炎作用的新機制。

烏司他??；體外循環(huán)；心臟手術(shù)；微小核糖核酸155；炎癥反應

體外循環(huán)（Cardiopulmonary bypass，CPB）心臟手術(shù)是近年來開展較多的一類手術(shù)方式，CPB現(xiàn)已成為心內(nèi)直視術(shù)的輔助手段。但是，手術(shù)期間由于血液與人工管道的接觸、各臟器的低灌注及手術(shù)器械對機體的機械性損傷，加之器官缺血再灌注、疼痛等多因素的強烈刺激，從而激活體內(nèi)的中性粒細胞、單核-巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等釋放大量的炎癥因子，進而激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)誘發(fā)級聯(lián)炎癥反應，導致全身炎癥反應及多器官功能障礙綜合征，甚至引起患者死亡[1-2]。因此，對此類手術(shù)患者在圍術(shù)期的防控干預對其臟器的功能狀態(tài)有著較大的影響，直接關(guān)系到手術(shù)的效果和預后。目前，臨床常用一些蛋白酶抑制劑改善CPB引起的炎癥反應，其中烏司他丁（Ulinastain）作為一種廣譜蛋白水解酶抑制劑，對體內(nèi)多種蛋白水解酶的活性發(fā)揮了廣泛的抑制作用。其可清除氧自由基，減少炎癥介質(zhì)釋放和炎癥細胞浸潤[3-4]，從而減輕CPB心臟手術(shù)后患者的炎癥反應，對CPB造成的心肌損傷發(fā)揮重要的保護作用，但目前關(guān)于其對心肌損傷的保護機制尚需要進一步研究。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，心肌中的微小核糖核酸（miRNA）在心肌損傷的保護功能中起到重要的調(diào)控作用[5-7]，這為臨床上進行心肌保護治療提供了新的靶點。那么烏司他丁減輕CPB心臟手術(shù)后患者的炎癥反應、對心肌的保護作用是否與調(diào)節(jié)miRNA相關(guān)？研究發(fā)現(xiàn)，miR-155是一個重要的心肌功能調(diào)控miRNA，可通過抑制Toll樣受體（TLRs）信號通路中重要的轉(zhuǎn)導蛋白髓樣分化因子88（MyD88）進而抑制核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（NF-κB）信號通路的激活，減少炎癥因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）和IL-8]的分泌[8]。因此，本研究中，筆者考察了烏司他丁對CPB心臟手術(shù)患者miR-155、TNF-α、IL-6和IL-8表達的影響，探討了烏司他丁通過誘導miR-155進而抑制CPB心臟手術(shù)患者炎癥反應、發(fā)揮心肌保護作用的機制。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準

納入標準：（1）擬擇期行全身麻醉下CPB心臟手術(shù)的患者；（2）美國紐約心臟病協(xié)會（NYHA）分級1～3級；（3）年齡＜65歲。

排除標準：（1）伴有嚴重呼吸、循環(huán)系統(tǒng)基礎(chǔ)疾病者；（2）肝腎功能和凝血功能異常者；（3）心率＜60次/min或心律失常者；（4）血氣分析和（或）電解質(zhì)異常、血紅蛋白＜110 g/L者。

1.2 研究對象

選取2012年7月－2016年7月于我院進行CPB心臟手術(shù)的40例患者，按照隨機數(shù)字表法分為對照組和觀察組，各20例。兩組患者的性別、年齡、體質(zhì)量、手術(shù)類型、手術(shù)時間、CPB時間等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，詳見表1。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過，所有患者或其家屬術(shù)前均閱讀并簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較（n＝20）Tab 1 Comparison of general information of patients between 2 groups（n＝20）

1.3 治療方法

兩組患者術(shù)前均常規(guī)禁食禁飲且均未用藥。采用氣管插管靜吸復合麻醉常規(guī)CPB的方法進行手術(shù)；麻醉誘導均采用咪達唑侖4 mg+芬太尼15μg/kg+順苯磺酸阿曲庫銨0.15 mg/kg+依托咪酯0.2 mg/kg；麻醉維持采用七氟醚最小肺泡濃度（MAC）的0.8～1.5倍量。術(shù)中連續(xù)監(jiān)測患者的平均動脈壓、中心靜脈壓、心電圖、尿量，并進行血氣分析。觀察組患者在麻醉誘導后即給予注射用烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H19990134，批號：031604143，規(guī)格：10萬U）30萬U溶入50 mL生理鹽水中靜脈泵注，以2.5 mL/min的速率在20 min內(nèi)完成，再將70萬U（溶入50 mL生理鹽水中）烏司他丁以0.2 mL/min的速率使用微量泵持續(xù)靜脈泵注至術(shù)畢。對照組患者給予等容量生理鹽水。兩組其他預充液及CPB方法相同。

1.4 觀察指標

（1）比較兩組患者麻醉誘導前（術(shù)前）和CPB停止（術(shù)后）6、12、24 h外周血單核細胞中miR-155及其靶基因MyD88的表達情況。（2）比較兩組患者術(shù)前及術(shù)后6、12、 24 h血清炎癥因子（TNF-α、IL-6和IL-8）的表達結(jié)果。（3）分析觀察組患者術(shù)后24 h的miR-155與炎癥因子表達情況的相關(guān)性。（4）觀察兩組患者不良反應發(fā)生情況。

1.5 檢測方法

（1）兩組患者分別于術(shù)前和術(shù)后6、12、24 h由中心靜脈導管采集血液標本，按照Ficoll-Paque PREMIUM細胞分離液（瑞典GE公司）說明書分離外周血單核細胞；依據(jù)Trizol試劑（美國Invitrogen公司）說明書提取細胞總RNA，采用miRNA實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒（美國GeneCopeia公司）檢測外周血單核細胞中miR-155的表達情況。miR-155上游引物：5′-CTCCTACATATTAGCATTAACA-3′；下游引物：由試劑盒提供；以snRNA U6為內(nèi)參，內(nèi)參上游引物：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′；下游引物：5′-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3′。以循環(huán)閾值（Ct值）為統(tǒng)計參數(shù)，采用2－ΔΔCt計算方法，用相對定量法（目的基因Ct值/snRNA U6內(nèi)參基因Ct值）對miR-155的表達進行相對定量。（2）采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法檢測外周血單核細胞中miR-155靶基因MyD88的表達情況：外周血單核細胞經(jīng)RIPA裂解液（上海碧云天生物公司）裂解，離心，取上清，采用BCA試劑盒（上海碧云天生物公司）測定蛋白濃度。取等量蛋白通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，以半干法轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h；將膜分別置于兔抗MyD88多克隆抗體（美國CST公司）、兔抗β-actin多克隆抗體（美國CST公司）一抗稀釋液（稀釋比例均為1∶1 000，V/V）中，4℃孵育過夜，用含吐溫20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗膜3次，每次10 min；再將膜置于辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠免疫球蛋白（Ig）G（北京中杉公司）二抗稀釋液（稀釋比例均為1∶10 000，V/V）中室溫孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10 min。將增強型化學發(fā)光（ECL）底物（美國Millpore公司）滴加至PVDF膜上，于化學發(fā)光檢測儀收集熒光信號，用Gel-Pro Analyzer分析軟件分析蛋白的灰度值，與內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值進行相對定量（目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值）。（3）應用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國R&D Systems公司）測定患者血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8的表達情況。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)表示，采用χ2檢驗；應用Pearson相關(guān)系數(shù)分析miR-155與TNF-α、IL-6、IL-8表達的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者手術(shù)前后外周血單核細胞中miR-155及其靶基因MyD88的表達情況

術(shù)前，兩組患者外周血單核細胞中miR-155的表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與術(shù)前比較，對照組患者術(shù)后6、12、24 h外周血單核細胞中miR-155的表達水平均顯著降低，觀察組患者的表達水平均顯著升高；且觀察組患者術(shù)后各時點miR-155的表達水平均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或 P＜0.01），詳見表2。

表2 兩組患者手術(shù)前后外周血單核細胞中miR-155的表達結(jié)果（±s，n＝20）Tab 2 Expression of miR-155 in peripheral blood mononuclear cells in 2 groups before and after surgery（±s，n＝20）

表2 兩組患者手術(shù)前后外周血單核細胞中miR-155的表達結(jié)果（±s，n＝20）Tab 2 Expression of miR-155 in peripheral blood mononuclear cells in 2 groups before and after surgery（±s，n＝20）

注：與術(shù)前比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與對照組比較，#P＜0.01Note：vs.before operation，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.control group，#P＜0.01

術(shù)后24 h 0.317±0.035＊＊6.573±0.334＊＊#組別對照組觀察組術(shù)前1.123±0.105 1.037±0.103術(shù)后6 h 0.820±0.030＊1.560±0.105＊＊#術(shù)后12 h 0.543±0.080＊＊3.340±0.248＊＊#

術(shù)前及術(shù)后6 h，兩組患者外周血單核細胞中MyD88的表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與術(shù)前比較，兩組患者術(shù)后12、24 h外周血單核細胞中MyD88的表達水平均顯著升高，但觀察組患者顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），詳見表3。

表3 兩組患者手術(shù)前后外周血單核細胞中MyD88的表達結(jié)果（±s，n＝20）Tab 3 Expression of MyD88 in peripheral blood mononuclear cells in 2 groups before and after surgery（±s，n＝20）

表3 兩組患者手術(shù)前后外周血單核細胞中MyD88的表達結(jié)果（±s，n＝20）Tab 3 Expression of MyD88 in peripheral blood mononuclear cells in 2 groups before and after surgery（±s，n＝20）

注：與術(shù)前比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與對照組比較，#P＜0.01Note：vs.before operation，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.control group，#P＜0.01

術(shù)后24 h 4.323±0.485＊＊2.125±0.283＊＊#組別對照組觀察組術(shù)前0.512±0.078 0.525±0.068術(shù)后6 h 0.699±0.081 0.598±0.072術(shù)后12 h 2.321±0.312＊＊1.413±0.202＊#

2.2 兩組患者手術(shù)前后血清炎癥因子的表達情況

術(shù)前，兩組患者各血清炎癥因子表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與術(shù)前比較，兩組患者術(shù)后6、12、24 h的TNF-α、IL-6和IL-8水平均顯著升高，但觀察組顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），詳見表4。

表4 兩組患者手術(shù)前后血清TNF-α、IL-6和IL-8的表達結(jié)果（±s，n＝20，pg/mL）Tab 4 The expression of serum TNF-α，IL-6 and IL-8 in 2 groups before and after surgery（±s，n＝20，pg/mL）

表4 兩組患者手術(shù)前后血清TNF-α、IL-6和IL-8的表達結(jié)果（±s，n＝20，pg/mL）Tab 4 The expression of serum TNF-α，IL-6 and IL-8 in 2 groups before and after surgery（±s，n＝20，pg/mL）

注：與術(shù)前比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與對照組比較，#P＜0.01Note：vs.before operation，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.control group，#P＜0.01

組別對照組觀察組TNF-α IL-6 IL-8術(shù)后24 h 25.82±9.56＊＊13.73±6.15＊#術(shù)前30.23±10.78 28.56±6.35術(shù)后6 h 178.28±38.33＊＊112.58±34.62＊＊#術(shù)后12 h 135.46±25.63＊＊75.33±28.59＊＊#術(shù)后24 h 88.56±25.48＊＊65.49±22.60＊＊#術(shù)前13.51±4.54 15.34±5.12術(shù)后6 h 125.35±28.11＊＊62.15±16.46＊＊#術(shù)后12 h 98.45±18.37＊＊43.21±11.78＊＊#術(shù)后24 h 67.21±18.05＊＊34.78±11.05＊#術(shù)前10.12±3.85 9.12±2.57術(shù)后6 h 55.33±9.67＊＊28.17±5.47＊＊#術(shù)后12 h 42.72±10.16＊＊18.62±4.49＊＊#

2.3 烏司他丁誘導表達miR-155與炎癥因子表達的相關(guān)性

采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析觀察組患者術(shù)后24 h的miR-155與炎癥因子表達的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)烏司他丁誘導表達的miR-155水平與TNF-α（r＝－0.760，P＜0.01）、IL-6（r＝－0.726，P＜0.01）、IL-8（r＝－0.767，P＜0.01）的表達水平均呈顯著負相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果見圖1。

3 討論

CPB過程中有大量炎癥因子產(chǎn)生，形成復雜的炎癥因子網(wǎng)絡和級聯(lián)炎癥反應[9]。其中，TNF-α是主要由單核-巨噬細胞產(chǎn)生的早期炎癥細胞因子，是CPB圍術(shù)期炎癥反應中最主要的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)，在級聯(lián)炎癥反應中起核心作用[10]。TNF-α可刺激多種炎癥細胞產(chǎn)生IL-6，而IL-6是具有代表性的炎癥因子，其表達水平變化可作為早期機體損傷的參考指標，與多種心血管疾病的病理生理過程密切相關(guān)，也是后續(xù)嚴重臨床并發(fā)癥的預測因子[11]。TNF-α還可誘導單核-巨噬細胞產(chǎn)生IL-8，使中性粒細胞釋放活性氧自由基、蛋白水解酶及其他細胞因子，共同引起組織器官損傷[12]。因此，如何降低CPB過程中對機體的損傷成為臨床干預及治療的研究熱點。

圖1 觀察組患者術(shù)后24 h的miR-155與TNF-α、IL-6、IL-8表達的相關(guān)性分析結(jié)果Fig 1 Correlation of the expression of miR-155 with the expression of TNF-α，IL-6 and IL-8 in observation group 24 h after surgery

烏司他丁是從男性新鮮尿液中分離純化而來的一種酸性糖蛋白，是一種廣譜的酶抑制劑，對多種蛋白酶、水解酶具有顯著抑制作用，可抑制中性粒細胞過度激活、清除氧自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放、降低炎癥損傷程度[13]。目前臨床上常將烏司他丁用于CPB過程中改善器官缺血再灌注損傷和保護心肌，但關(guān)于其作用機制尚缺乏相關(guān)報道。

miRNA在生物體各個組織器官的生長發(fā)育和某些疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮著極其重要的調(diào)節(jié)作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多的miRNA參與了機體多種病理生理的發(fā)展過程。其中，miR-155是一個重要的抗炎miRNA，在造血細胞分化、免疫、炎癥以及心血管功能方面發(fā)揮重要作用[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，心臟手術(shù)患者在CPB過程中應用烏司他丁可顯著誘導外周血單核細胞中miR-155的表達，并抑制miR-155靶基因MyD88的表達，從而抑制MyD88介導的NF-κB炎癥信號通路的活化，減弱炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8的表達；進一步的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)烏司他丁誘導表達的miR-155水平與TNF-α、IL-6、IL-8的表達水平呈顯著負相關(guān)。這提示烏司他丁抑制炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的表達與誘導抗炎分子miR-155的表達相關(guān)。

綜上所述，烏司他丁可通過誘導miR-155的表達來抑制炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8的釋放，這可能是該藥在CPB心臟手術(shù)中發(fā)揮抗炎作用的新機制。但本研究并未檢測烏司他丁對其他炎癥相關(guān)的miRNA的表達以及其他炎癥信號通路的作用效應，鑒于miRNA對基因的表達調(diào)控是一個復雜的網(wǎng)絡調(diào)控系統(tǒng)，且炎癥信號通路是相互關(guān)聯(lián)的，故今后的研究可進一步探討烏司他丁對多種miRNA及炎癥信號通路串聯(lián)的調(diào)控機制，從而為更加深入地闡明該藥對機體多器官的保護作用機制以及指導臨床合理用藥提供依據(jù)。

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（編輯：胡曉霖）

Study on the Mechanism of Ulinastain Inhibiting Inflammatory Reaction of Patients Underwent Cardiopulmonary Bypass Cardiac Surgery by Inducing miR-155

XU Liqing，WEI Jiangqi（Dept.of Cardiothoracic Surgery，Xinxiang First People’s Hospital，Henan Xinxiang 453000，China）

OBJECTIVE：To study the mechianism of inhibitory effect of ulinastain on inflammatory factors of patients during cardiopulmonary bypass（CPB）cardiac surgery.METHODS：Totally 40 patients underwent selective CPB cardiac surgery collected from our hospital during Jul.2012-Jul.2016 were divided into control group and observation group according to random number table，with 20 cases in each group.Observation group was given 300 000 U of ulinastatin at 2.5 mL/min by intravenous pump within 20 min after anesthesia induction，then given 700 000 U of ulinastatin at 0.2 mL/min by continuous intravenous pump until operation finish.Control group was given equal volume of normal saline.Blood samples of patients were collected before anesthesia induction（before surgery）and 6，12，24 h after CPB（after surgery），respectively.The expression of miR-155 and its target gene MyD88 in peripheral blood mononuclear cells of each group were detected by Real-time PCR and Western blot.The expression of TNF-α，IL-6 and IL-8 were measured by ELISA.The correlation of miR-155 with the expression of TNF-α，IL-6 and IL-8 in patients of observation group 24 h after surgery were analyzed by using Pearson correlation analysis.RESULTS：Compared with control group，the expression of miR-155 in observation group was significantly increased，while the expression of its target gene MyD88 was significantly decreased；the expression of TNF-α，IL-6 and IL-8 were reduced significantly，with statistical significance（P＜0.01）.The expression of miR-155 was significantly negative correlation with the expression of TNF-α，IL-6 and IL-8 in the patients of observation group 24 h after surgery（P＜0.01）.CONCLUSIONS：Ulinastatin can inhibit the release of inflammatory factors TNF-α，IL-6 and IL-8 by inducing the expression of miR-155，which may be a new mechanism for the anti-inflammatory effect of the drug in CPB cardiac surgery.

Ulinastain；Cardiopulmonary bypass；Cardiac surgery；miR-155；Inflammatory reaction

R614

A

1001-0408（2017）20-2742-04

2017-02-08

2017-04-22）

＊副主任醫(yī)師。研究方向：心肌缺血再灌注損傷。電話：0373-3665261。E-mail：xliqing6997@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.20.02