宋文憑，張誠(chéng)玥，張燕，李毅，曹睿，葉程，張琳，邵榮光，李亮，趙軍陽(yáng)

人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞依托泊苷耐藥株的建立及其耐藥機(jī)制初探

宋文憑，張誠(chéng)玥，張燕，李毅，曹睿，葉程，張琳，邵榮光，李亮，趙軍陽(yáng)

目的通過(guò)構(gòu)建人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 Y79 細(xì)胞的依托泊苷耐藥株，比較耐藥株的藥物敏感性和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，觀(guān)察耐藥相關(guān)基因及細(xì)胞信號(hào)通路的變化，從而闡釋人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤對(duì)依托泊苷的耐藥機(jī)制。

方法以不同濃度梯度的依托泊苷處理 Y79 細(xì)胞，采用濃度遞增不間斷刺激法構(gòu)建依托泊苷耐藥株，觀(guān)察耐藥株細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況以及對(duì)依托泊苷細(xì)胞毒作用的敏感性；以 caspase 3/7 酶活性來(lái)評(píng)估耐藥株的細(xì)胞凋亡程度，并通過(guò) Western blot 方法研究與細(xì)胞增殖和耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。

結(jié)果成功構(gòu)建耐受依托泊苷的人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤耐藥株Y79/EDR，最大耐藥濃度為 500 nmol/L。和親本細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)增殖能力，倍增時(shí)間縮短 14.5 h（P＜ 0.001）；且對(duì)依托泊苷的敏感性顯著下降，耐藥指數(shù)達(dá) 29.47。Caspase 3/7 活性檢測(cè)結(jié)果顯示，給予親本及耐藥細(xì)胞不同濃度的依托泊苷后，耐藥細(xì)胞中 caspase 3/7 活性明顯低于親本細(xì)胞，凋亡減少，且呈藥物濃度依賴(lài)性。Western blot 結(jié)果表明，耐藥細(xì)胞中磷酸化 AKT（p-AKT）表達(dá)明顯高于親本細(xì)胞，提示其 p-AKT 的活性明顯增強(qiáng)，p-AKT 促進(jìn)其下游蛋白 MDM2 的磷酸化從而抑制 p53的磷酸化，而凋亡相關(guān)蛋白 Bax/Bcl-2 的比值明顯降低。多藥耐藥性蛋白 P-糖蛋白（P-gp）的表達(dá)下調(diào)，Rb1 蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，提示耐藥株 Y79/EDR 的耐藥并不依賴(lài)于 P-gp 而產(chǎn)生，且與 Rb1 蛋白無(wú)關(guān)，而可能通過(guò)增加腫瘤驅(qū)動(dòng)蛋白 AKT 的磷酸化，激活其所介導(dǎo)的下游信號(hào)通路，增加靶蛋白 MDM2 的表達(dá)，從而抑制抑癌蛋白 p53 的表達(dá)；同時(shí)增加抗凋亡蛋白 Bcl-2 和降低抑凋亡蛋白 Bax的表達(dá)水平；最終導(dǎo)致細(xì)胞通過(guò)增殖顯著增強(qiáng)和凋亡明顯減少而產(chǎn)生耐藥。

結(jié)論成功構(gòu)建依托泊苷耐藥株 Y79/EDR，初步結(jié)果表明，其耐藥細(xì)胞株可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致耐藥，這將為深入研究人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的病變機(jī)制，闡釋其對(duì)依托泊苷的耐藥機(jī)制，尋找有效的耐藥逆轉(zhuǎn)方案提供一定的前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤； 依托泊苷； 化療耐藥細(xì)胞株； Y79 細(xì)胞系

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(4):297-302

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，RB）是一種多發(fā)于兒童的眼內(nèi)惡性腫瘤，病因多為人類(lèi)首個(gè)發(fā)現(xiàn)的抑癌基因 RB1 及其等位基因的失活[1]。在全球每年新生兒中，該疾病發(fā)病率基本穩(wěn)定在1/16 000～1/18 000，大約每年新增 8000 例患者[2]。亞洲、非洲等欠發(fā)達(dá)國(guó)家的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者死亡率達(dá)到 40%～70%，歐美發(fā)達(dá)國(guó)家僅為 3% ～5%；而且欠發(fā)達(dá)國(guó)家包括中國(guó)在內(nèi)的患者多為高風(fēng)險(xiǎn)的 D、E 晚期，常伴有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后差[3]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療以保住患者性命為第一要?jiǎng)?wù)，其次是眼球和視力的保留[4]。

根據(jù)患者的發(fā)病年齡、腫瘤大小、腫瘤所在位置以及腫瘤周邊組織等情況，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤可以采用多種治療手段，如眼球摘除術(shù)、放射療法、經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?、激光光凝術(shù)、冷凍療法、多種給藥途徑的化學(xué)療法等[5]。上述一些治療手段易引發(fā)輻射性視網(wǎng)膜病變、白內(nèi)障、面部畸形以及誘發(fā)二次腫瘤等相關(guān)并發(fā)癥，因此，全身化療是治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的最好選擇[6]。目前，我國(guó)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的一線(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)療法是眼球摘除后三藥（卡鉑、依托泊苷、長(zhǎng)春新堿）聯(lián)合靜脈療法[4]。針對(duì)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的晚期高風(fēng)險(xiǎn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療仍為一大難題，大部分患者由于產(chǎn)生耐藥性而影響療效，進(jìn)而復(fù)發(fā)、侵襲外轉(zhuǎn)移，甚至死亡。

因此，本研究力圖建立人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞Y79 對(duì)依托泊苷的耐藥株（Y79 etoposide drug resistant，Y79/EDR），從而探討其可能產(chǎn)生耐藥的內(nèi)在機(jī)制，為后續(xù)治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，克服對(duì)依托泊苷及其他化療藥物所產(chǎn)生耐藥的機(jī)制研究提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而促進(jìn)針對(duì)晚期高風(fēng)險(xiǎn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的耐藥復(fù)發(fā)進(jìn)行新型靶向藥物的研發(fā)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及藥物 人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 Y79 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院；藥物依托泊苷購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich 公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 細(xì)胞培養(yǎng)用 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、10 000 U/ml 青霉素及 10 000 μg/ml 鏈霉素均購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司；Cell counting kit-8（CCK-8）購(gòu)自日本 Dojindo 公司；Caspase-glo 3/7 assay 試劑盒購(gòu)自美國(guó) Promega 公司；蘇木素-伊紅（HE）染色套液、細(xì)胞總蛋白的提取及定量所用 RIPA 裂解液和 BCA 試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；無(wú)水乙醇、95% 乙醇、甲醛購(gòu)自北京化工廠(chǎng)；Western blot 所用一抗購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 甩片機(jī)為美國(guó) Thermo Scientific公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡為日本 Olympus公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國(guó) BioTek 公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀為美國(guó) SpectraMax 產(chǎn)品；凝膠成像分析儀為美國(guó) FluorChem HD2 產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制 人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79 細(xì)胞培養(yǎng)在含 20%（V/V）胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml 鏈霉素的 1640 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為：37 ℃、5% CO2。藥物依托泊苷用 DMSO配制成 100 mmol/L 母液，之后處理細(xì)胞所用濃度均以無(wú)菌 PBS 緩沖液或含血清培養(yǎng)基做相應(yīng)稀釋。

1.2.2 耐藥細(xì)胞株 Y79/EDR 的建立及其形態(tài)特征 選用人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 Y79 細(xì)胞進(jìn)行依托泊苷耐藥株 Y79/EDR 的構(gòu)建，以三倍濃度梯度增長(zhǎng)的依托泊苷處理親本 Y79 細(xì)胞，從最低濃度1 nmol/L 直到最大耐受濃度 500 nmol/L 持續(xù)作用達(dá) 6 個(gè)月，得到能在 500 nmol/L 的依托泊苷中穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞株。取細(xì)胞密度為 1 × 105個(gè)/ml 的親本 Y79 細(xì)胞和 Y79/EDR 耐藥細(xì)胞各 200 μl，于甩片機(jī)中以 1000 r/min 離心 4 min，PBS 緩沖液洗 3 次，4% 多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定30 min，常規(guī) HE 染色，顯微鏡下觀(guān)察并比較親本及耐藥細(xì)胞株的形態(tài)學(xué)特征。

1.2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定及倍增時(shí)間的計(jì)算 利用 CCK-8 觀(guān)察細(xì)胞的增殖，其原理即通過(guò)與活細(xì)胞中的去氧脫氫酶反應(yīng)，生成水溶性的橘黃色甲瓚，根據(jù)其 450 nm 處的吸光度（A450）來(lái)測(cè)定生長(zhǎng)速率。將親本及耐藥細(xì)胞按照每孔 5 ×103個(gè)/200 μl 的密度接種于 96 孔板中，孔板邊緣用無(wú)菌 PBS 緩沖液填充，以單加培養(yǎng)基的孔為空白對(duì)照，將 11 塊培養(yǎng)板置于 37 ℃、5% CO2的孵箱中，每隔 24 h 取出一塊板，于每孔中加入 20 μl CCK-8試劑，在孵箱中繼續(xù)孵育 2 h 后用酶標(biāo)儀測(cè)其A450?？瞻讓?duì)照孔校準(zhǔn)后，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

細(xì)胞倍增時(shí)間的計(jì)算公式為：

tD= t × lg 2/（lgNt– lgN0），其中，tD為倍增時(shí)間，t 為培養(yǎng)時(shí)間，N0、Nt分別代表接種后及接種t 小時(shí)后的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 藥物敏感性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本Y79 細(xì)胞和 Y79/EDR 耐藥細(xì)胞，按照每孔 2.0 ×104個(gè)/180 μl 密度接種于 96 孔板中，培養(yǎng) 24 h后加入不同濃度的依托泊苷 20 μl，使其終濃度分別為 0.1、1、10、100、1000、10 000、100 000、1 000 000 nmol/L，對(duì)照孔加入相同體積的無(wú)菌 PBS緩沖液，以單加培養(yǎng)基的空白孔為調(diào)零孔，不同處理組分別對(duì)應(yīng) 3 個(gè)副孔。藥物作用 48 h 后加入20 μl 的 CCK-8 試劑于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng) 2 h，測(cè)其A450。計(jì)算依托泊苷對(duì) Y79 和 Y79/EDR 的半數(shù)抑制率（IC50）。

細(xì)胞抑制率（%）=[（對(duì)照組A450– 調(diào)零孔A450）–（實(shí)驗(yàn)組A450– 調(diào)零孔A450）]/（實(shí)驗(yàn)組A450– 調(diào)零孔A450）× 100%

耐藥指數(shù)（RI）= IC50（Y79/EDR）/IC50（Y79）

1.2.5 Caspase 3/7 酶活性測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本 Y79 細(xì)胞和 Y79/EDR 耐藥細(xì)胞，按照每孔 1.0 × 104個(gè)/90 μl 細(xì)胞密度接種于 96 孔酶標(biāo)板中，培養(yǎng) 24 h 后加入 10 μl 不同濃度的依托泊苷，使其終濃度分別為 1 μmol/L 和 10 μmol/L，對(duì)照孔加入相同體積的無(wú)菌 PBS 緩沖液，單加培養(yǎng)基的孔作為調(diào)零孔。藥物作用 48 h 后，取caspase-glo 3/7 assay 試劑盒，放置到室溫后，將caspase 3/7 底物及緩沖液混合均勻，吸取 100 μl加入上述酶標(biāo)板孔中，室溫下混合孵育 1 h 后，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，確定 caspase 3/7酶的活化程度。

1.2.6 Western blot 檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Y79 和 Y79/EDR 細(xì)胞，用含 1% 苯甲基磺酰氟（PMSF）的 RIPA 裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，冰上裂解 30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心 20 min后取上清，并用 BCA 試劑進(jìn)行蛋白定量。各取25 μg 總蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，電泳完成后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉；一抗（1∶1000）4 ℃ 過(guò)夜孵育，PBST（含 0.1%吐溫 的 PBS 緩沖液）洗滌 3 次，每次 5 min；加入 1∶5000 稀釋的 HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，PBST 洗滌 3 次，每次 5 min；化學(xué)發(fā)光液顯色，凝膠成像儀掃描拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥細(xì)胞株 Y79/EDR 的建立及其形態(tài)學(xué)特征

利用人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞 Y79 進(jìn)行依托泊苷耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建，藥物濃度從 1 nmol/L 開(kāi)始三倍濃度遞增，經(jīng)過(guò) 6 個(gè)月的誘導(dǎo)，得到能在 500 nmol/L 依托泊苷中穩(wěn)定生長(zhǎng)的耐藥株Y79/EDR。如圖 1 所示，與親本 Y79 細(xì)胞（1A）比較，Y79/EDR 耐藥細(xì)胞（1B）的形態(tài)學(xué)特征發(fā)生明顯變化，細(xì)胞體積增大，且分裂相細(xì)胞數(shù)明顯增多，說(shuō)明細(xì)胞增殖加快。

2.2 耐藥細(xì)胞株 Y79/EDR 的生長(zhǎng)增殖速率明顯加快

經(jīng)過(guò) CCK-8 試驗(yàn)得到的兩種細(xì)胞體外生長(zhǎng)速率顯示（圖 2），親本 Y79 細(xì)胞在培養(yǎng) 9 d 后達(dá)到生長(zhǎng)增殖的高峰，而 Y79/EDR 耐藥細(xì)胞在第7 天就達(dá)到生長(zhǎng)增殖高峰。Y79 的體外倍增時(shí)間為（31.80 ± 2.54）h，而 Y79/EDR 的倍增時(shí)間為（17.24 ± 0.81）h。與 Y79 相比，Y79/EDR 的倍增時(shí)間縮短 14.5 h（P＜ 0.001），表現(xiàn)出較強(qiáng)的生長(zhǎng)增殖能力。

2.3 耐藥細(xì)胞株 Y79/EDR 對(duì)依托泊苷的敏感性明顯減弱

圖1 Y79（A）和 Y79/EDR（B）的形態(tài)學(xué)特征（40 ×）Figure 1 Morphological characteristics of Y79 (A) and Y79/EDR (B) (40 ×)

圖2 Y79 和 Y79/EDR 細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（***P＜ 0.001）Figure 2 Growth curve of Y79 and Y79/EDR cells (***P＜0.001)

圖3 Y79 和 Y79/EDR 細(xì)胞對(duì)依托泊苷的劑量-存活率曲線(xiàn)Figure 3 The dose-survival curves of Y79 and Y79/EDR exposed to etoposide

圖3 為親本 Y79 細(xì)胞和 Y79/EDR 耐藥細(xì)胞對(duì)依托泊苷的劑量-存活率曲線(xiàn)。其中，Y79 的IC50為（1.20 ± 0.02）μmol/L，而 Y79/EDR 表現(xiàn)出對(duì)依托泊苷較強(qiáng)的耐受性，IC50為（35.36 ±3.41）μmol/L，耐藥指數(shù)為 29.47。

2.4 耐藥細(xì)胞株 Y79/EDR 經(jīng)依托泊苷誘導(dǎo)所致的 caspase 3/7 酶活性明顯降低

圖4 Y79 和 Y79/EDR 細(xì)胞依托泊苷處理后的 caspase 3/7 活性（**P＜ 0.01，***P＜ 0.001）Figure 4 Activities of caspase 3/7 in Y79 and Y79/EDR cells after exposure to etoposide (**P＜ 0.01,***P＜ 0.001)

與對(duì)照組相比，在給予不同濃度的依托泊苷后，親本 Y79 細(xì)胞和 Y79/EDR 耐藥細(xì)胞中的caspase 3/7 酶活性均升高，但兩者存在顯著性差異（1 μmol/L：P＜ 0.001；10 μmol/L：P＜ 0.01）；相較 Y79，在相同濃度的依托泊苷作用下，Y79/EDR的 caspase 3/7 酶活性明顯降低，提示其細(xì)胞的凋亡程度減少，且呈濃度依賴(lài)性（圖 4）。

2.5 耐藥細(xì)胞株 Y79/EDR 的相關(guān)功能蛋白的表達(dá)變化

Western blot 結(jié)果（圖 5）表明，相較親本 Y79細(xì)胞，Y79/EDR 耐藥細(xì)胞中 p-AKT 的表達(dá)顯著升高，促進(jìn) MDM2 蛋白的磷酸化，進(jìn)而抑制 p53 的磷酸化，且細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2 增加，Bax 降低，Bax/Bcl-2 比例明顯降低，揭示 Y79/EDR 的耐藥可能是通過(guò) p-p53 的表達(dá)水平降低，進(jìn)而增加抗凋亡蛋白 Bcl-2 和降低促凋亡蛋白 Bax 的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。此外，與親本 Y79 細(xì)胞相比，Y79/EDR 耐藥細(xì)胞中 Rb1 蛋白的表達(dá)無(wú)變化，P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表達(dá)無(wú)增反降，提示該耐藥機(jī)制并非通過(guò) Rb1 和 P-gp介導(dǎo)的細(xì)胞耐藥來(lái)完成，而有可能通過(guò)對(duì) AKT 磷酸化的增強(qiáng)，AKT 活性增加，從而促進(jìn)下游靶蛋白 MDM2 的磷酸化，降低抑癌蛋白 p53 的磷酸化，使凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2 增加和 Bax 降低而導(dǎo)致耐藥。

3 討論

圖5 Y79 和 Y79/EDR 細(xì)胞中增殖、凋亡及多藥耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Figure 5 Expressions of proteins associated with proliferation,apoptosis and multi-drug resistance in Y79 and Y79/EDR cells

依托泊苷是從鬼臼脂中分離出來(lái)的木脂體類(lèi)有效成分，是一種細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥物，作用于細(xì)胞分裂 S 晚期或 G2 期，它通過(guò)與 DNA拓?fù)涿?II 相結(jié)合從而抑制其活性，導(dǎo)致受損的DNA 不能得到修復(fù)[7]。依托泊苷廣泛用于多種腫瘤的治療，如霍奇金病、肺癌、卵巢癌、骨髓瘤、胃癌、乳腺癌等[8-11]。已有研究表明，化療藥物耐藥可能產(chǎn)生的主要原因是藥物的細(xì)胞滲透性比較差，與多藥耐藥相關(guān)蛋白相互作用而導(dǎo)致耐藥[12-14]。由MDR1 基因表達(dá)的 P-gp 相當(dāng)于一個(gè)藥物泵，能將藥物排出到細(xì)胞外，從而導(dǎo)致耐藥；此外，MDR 相關(guān)蛋白的表達(dá)也在化療耐藥中起著重要作用[15-18]。而本研究成功構(gòu)建的依托泊苷耐藥株 Y79/EDR，Western blot 結(jié)果顯示，P-gp 的表達(dá)并沒(méi)有升高，說(shuō)明此耐藥株不是通過(guò)高表達(dá) P-gp 而耐藥。

已有研究證實(shí)，PI3K-AKT 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活中起著至關(guān)重要的作用[19]。本研究結(jié)果表明，相較親本 Y79 細(xì)胞，Y79/EDR 耐藥細(xì)胞的倍增時(shí)間明顯縮短，而且進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，耐藥株中 p-AKT 表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞增殖及存活。p53 作為一個(gè)抑癌基因，能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)達(dá)到抑制腫瘤的作用[20]，本研究發(fā)現(xiàn)，與親本 Y79 細(xì)胞相比，Y79/EDR 耐藥細(xì)胞中促凋亡基因 p53 的磷酸化水平下調(diào)。線(xiàn)粒體凋亡途徑在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，而作為 Bcl-2家族主要成員的 Bcl-2 和 Bax 在調(diào)節(jié)細(xì)胞線(xiàn)粒體凋亡途徑中作用巨大。Bcl-2 通過(guò)抑制 Cyt C 從線(xiàn)粒體釋放阻止凋亡，與之相反的是，Bax 能夠促進(jìn)凋亡，因此，Bax/Bcl-2 的比值是公認(rèn)的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的指標(biāo)[21]。本研究結(jié)果顯示，相較親本 Y79細(xì)胞，Y79/EDR 耐藥細(xì)胞中 Bcl-2 表達(dá)上調(diào)而B(niǎo)ax 表達(dá)下調(diào)，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)其下游 caspase 3/7 活性降低，說(shuō)明耐藥細(xì)胞株通過(guò)調(diào)節(jié) Bcl-2、Bax 的表達(dá)，從而抑制 caspase 3/7 的活性，起到抗凋亡的作用。綜上，初步研究結(jié)果表明，耐藥細(xì)胞 Y79/EDR 是通過(guò)促進(jìn)自身增殖及存活同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡達(dá)到耐藥目的。

本研究初步探索了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株Y79 對(duì)依托泊苷耐藥的分子機(jī)制，但對(duì)耐藥株停止給藥后，耐藥性是否發(fā)生變化及其耐藥的深層機(jī)制有待進(jìn)一步探索。本研究將為未來(lái)深入研究人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤對(duì)依托泊苷耐藥的機(jī)制和尋找有效的耐藥逆轉(zhuǎn)方案奠定基礎(chǔ)。

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Generation of etoposide-resistant subline of human retinoblastoma Y79 cells and preliminary study on the mechanism of drug resistance

SONG Wen-ping, ZHANG Cheng-yue, ZHANG Yan, LI Yi, CAO Rui, YE Cheng, ZHANG Lin, SHAO Rong-guang, LI Liang,ZHAO Jun-yang

ObjectiveTo generate etoposide-resistant cell line of human retinoblastoma Y79 cells (Y79 etoposide-drug-resistant, Y79/EDR)and explore the underlying mechanism of etoposide resistance.

MethodsThe etoposide-resistant subline of human retinoblastoma Y79 cells were selectedin vitroby prolonged exposure to 3-fold stepwisely increasing concentrations of etoposide.Y79/EDR cells were finally maintained in culture with 500 nmol/L of etoposide,followed by cell counting kit (CCK-8) and caspase-glo 3/7 assays for testing the growth rate, cytotoxicity and apoptosis induced by etoposide in both Y79 and Y79/EDR cells, respectively.Western blot assay was performed to determine if any cell signaling pathways might be involved in etoposide resistance in Y79/EDR cells.

ResultsY79/EDR cells were obtained after 6 months constitutive treatment at the concentration of 500 nmol/L.The growth rate of Y79/EDR significantly increased and its doubling time was shortened by 14.5 h as compared to Y79 parental cells (P＜ 0.001) with the resistance index of 29.47.The activity of caspase 3/7 in Y79/EDR cells was significantly decreased as compared to Y79 cells in a manner of etoposide concentration dependent (P＜ 0.01).The results from Western blot assay indicated that AKT and p53 mediated cellular proliferation signaling pathways might be involved in etoposide resistance of Y79/EDR cells, whereas the expression levels of Rb1 and P-glycoprotein (P-gp) genes had no alteration.

ConclusionOur preliminary results suggested that the mechanisms of acquired resistance to etoposide in human retinoblastoma Y79 cells might be involved in the promotion of cellular proliferation and inhibition of cell apoptosis mediated by AKT signaling pathway.

Retinoblastoma; Etoposide; Chemoresistance resistant cell line; Y79 cell line

s:LI Liang, Email: liliang@imb.pumc.edu.cn; ZHAO Jun-yang; Email: zhaojunyang@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（81472787）

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所腫瘤室（宋文憑、李毅、曹睿、葉程、邵榮光、李亮）；100045北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院眼科（張誠(chéng)玥、張燕、趙軍陽(yáng)）；100075 北京聯(lián)合大學(xué)特殊教育學(xué)院（張琳）

李亮，Email：liliang@imb.pumc.edu.cn；趙軍陽(yáng)，Email：zhaojunyang@163.com

2017-06-06

Author Affiliations:Department of Oncology, Institute of Medicinal Biotechnology of Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (SONG Wen-ping, LI Yi, CAO Rui, YE Cheng, SHAO Rong-guang, LI Liang); Ophthalmology Department, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045, China (ZHANG Cheng-yue, ZHANG Yan, ZHAO Jun-yang); Beijing United University Special Education College, Beijing 100075, China (ZHANG Lin)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(4):297-302