李美佳，張維娜，渠開攀，王 冰

1.青島大學附屬醫(yī)院燒傷整形外科，山東 青島 266000；2.青島大學醫(yī)學院免疫教研室，山東 青島 266000

跨膜接頭蛋白CBP對皮膚鱗癌細胞A431生長增殖的負調(diào)控作用研究

李美佳1，張維娜1，渠開攀1，王 冰2

1.青島大學附屬醫(yī)院燒傷整形外科，山東 青島 266000；2.青島大學醫(yī)學院免疫教研室，山東 青島 266000

背景與目的：跨膜接頭蛋白(Csk-binding protein，CBP)是新發(fā)現(xiàn)的Src家族成員，與多種腫瘤的發(fā)生有關。該研究旨在觀察CBP基因過表達對皮膚鱗癌細胞系A431增殖及細胞凋亡的影響，探討其相關的分子機制。方法：構(gòu)建CBP-增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)融合蛋白的慢病毒過表達載體，采用反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的方法建立CBP過表達的A431細胞株。實驗分為親本細胞組(未進行基因轉(zhuǎn)染的A431細胞)、對照組(A431細胞轉(zhuǎn)染僅含EGFP陰性對照病毒)和實驗組(A431細胞轉(zhuǎn)染CBP-EGFP病毒)。在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染率，驗證轉(zhuǎn)染成功與否；CCK-8法檢測CBP過表達對A431細胞增殖能力的影響，并采用流式細胞術(shù)( flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測對細胞凋亡的影響；實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測Lck、Csk和Fyn三種上游信號轉(zhuǎn)導分子分別在mRNA和蛋白中的表達水平變化。結(jié)果：建立了穩(wěn)定過表達CBP的A431細胞株；CCK-8法結(jié)果提示，CBP過表達明顯抑制細胞生長，第2～6天的組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；FCM檢測顯示，實驗組細胞凋亡率顯著增加，與親本細胞組及對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)；RTFQ-PCR結(jié)果顯示，實驗組A431細胞Lck mRNA的相對表達水平顯著下調(diào)(P＜0.001)，實驗組細胞Csk和Fyn mRNA的表達分別約為親本細胞組的1.6倍和3.8倍，表達顯著上調(diào)(P＜0.001)；Western blot結(jié)果表明，實驗組Lck蛋白的相對表達水平明顯下降(P＜0.001)，實驗組細胞Csk和Fyn蛋白與親本細胞組和對照組相比表達明顯增加(P＜0.001)。結(jié)論：CBP過表達可抑制皮膚鱗癌細胞增殖，誘導細胞凋亡及壞死。CBP通過調(diào)節(jié)上游信號轉(zhuǎn)導通路中的蛋白酪氨酸激酶Lck、Csk和Fyn來調(diào)控細胞的增殖活性。

皮膚鱗癌；跨膜接頭蛋白；細胞增殖；細胞凋亡

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC)起源于表皮角質(zhì)形成細胞，是世界第2常見的非黑色素瘤皮膚癌［1］。皮膚鱗癌的發(fā)病涉及多個基因的改變［2］，其具體的機制當前尚未完全闡明，因此，進一步尋找與該病發(fā)生相關的基因是一項非常有意義的工作?？缒そ宇^蛋白(Csk-binding protein，CBP)是近年來新發(fā)現(xiàn)的Src家族中的一個成員，其主要參與細胞的生長、增殖和分化等過程，并與多種腫瘤的發(fā)生相關［3］。但CBP對皮膚鱗癌生物學特性的影響及與皮膚鱗癌發(fā)生的關系，相關研究較少。本實驗初步探討CBP過表達對皮膚鱗癌的細胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人皮膚鱗癌細胞株A431購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫，CBP-增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)融合蛋白及慢病毒載體由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司構(gòu)建。CCK-8購自北京泛博生物化學有限公司。Annexin V apoptosis detection kit APC購自美國eBioscience公司。Csk、Fyn和Lck引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量試劑盒均購自美國Roch公司。兔抗人Csk、Fyn和Lck多克隆抗體購自美國Abgent公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自生工生物工程(上海)股份有限公司。ECL發(fā)光試劑購自美國Thermo公司。激光共聚焦顯微鏡為Leica SP8。流式細胞儀為美國BD公司C6。PCR儀為美國Bio-Rad公司CFX96。

1.2 方法

1.2.1 CBP過表達細胞株制備

根據(jù)慢病毒載體操作說明，收集處于對數(shù)生長期的正常A431細胞，以5 000個/孔接種于96孔板內(nèi)，按MOI值為100加入反轉(zhuǎn)錄病毒。轉(zhuǎn)染96 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白熒光表達，檢測轉(zhuǎn)染率，擴大培養(yǎng)建立穩(wěn)定的CBP過表達細胞株。實驗分為親本細胞組(未進行基因轉(zhuǎn)染的A431細胞)、對照組(A431細胞轉(zhuǎn)染僅含EGFP陰性對照病毒)和實驗組(A431細胞轉(zhuǎn)染CBP-EGFP病毒)。

1.2.2 CCK-8檢測各組細胞增殖率

收集處于對數(shù)生長期的上述3組細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，分別接種于96孔板，100 μL/孔。以上各組均設立1個調(diào)零孔和4個平行復孔。在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下預培養(yǎng)24 h后開始檢測0、24、48、72、96和120 h(即第1、2、3、4、5和6天)6個時間點細胞增殖情況，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)溫育2 h，多功能酶標儀檢測450 nm處吸光度(D)值。以D值為縱坐標，時間為橫坐標繪制生長曲線。

1.2.3 流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測細胞凋亡

收集處于對數(shù)生長期的上述3組細胞，以5×104個/孔接種于12孔板內(nèi)，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下預培養(yǎng)24 h完全貼壁后，撤血清饑餓12 h，再換成10%的G-DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h。分別用0.25%胰蛋白酶消化各組細胞制備單細胞懸液，冷PBS、1×Binding Buffer各洗滌細胞1次，再用100 μL 1×Binding Buffer重懸，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL。取1 mL加入2.5 μL Annexin V-APC避光室溫下反應15 min，2 300×g離心30 s后用500 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，再加2.5 μL PI，用4 0 0目的篩網(wǎng)過濾后，上流式細胞儀檢測。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)

收集以上各組A431細胞，用TRIzol法提取細胞總RNA，SYBR Green標記產(chǎn)物，按照RTFQ-PCR檢測試劑盒操作說明建立反應體系。反應條件： 95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s、 60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。各樣品目的基因和管家基因進行RTFQ-PCR反應，分別獲得Ct值，通過2-△△Ct方法分析各樣品相對CBP表達差異，每組實驗重復3次。各組實驗以親本細胞組的表達量設定為1，計算出其他組的相對表達量，以相對倍數(shù)進行作圖。所檢測的基因及相關PCR引物序列見表1。

1.2.5 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測

收集對數(shù)生長期的3組細胞，每組約107個細胞，加入200 μL預冷的蛋白裂解液4 ℃裂解2 h，4 ℃下20 800×g離心20 min，收集上清。BCA法測定蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5 min。10%SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫低速搖床封閉2 h，加入一抗4 ℃搖床過夜溫育。TBST漂洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫搖床溫育2 h。加入ECL顯色液，室溫避光溫育3～5 min，曝光、顯影。

表 1 RTFQ-PCR引物Fig. 1 RTFQ-PCR Primer

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 CBP在A431細胞中的表達

反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染A431細胞(MOI值為100)，轉(zhuǎn)染72 h后出現(xiàn)綠色熒光，熒光表達于細胞膜，轉(zhuǎn)染后96 h熒光表達達到高峰，轉(zhuǎn)染細胞在激光共聚焦顯微鏡下觀察，實驗組和對照組均可見綠色熒光幾乎遍布整個視野(圖1A、C)，同時采集同視野兩組細胞在普通光鏡下分布情況(圖1B、D)，兩種病毒的轉(zhuǎn)染率均接近100%，說明建立了穩(wěn)定表達的細胞株。

2.2 CBP過表達對A431細胞增殖的影響

CCK-8法對3組細胞的生長情況進行檢測，第1～5天，親本細胞組和對照組細胞增殖率均在逐漸增加，第6天開始趨于穩(wěn)定，兩組之間各時間點增殖效率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。實驗組細胞在檢測的第2～6天內(nèi)的增殖效應明顯低于親本細胞組和對照組，統(tǒng)計分析顯示，第2～6天組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示CBP過表達明顯抑制細胞的生長效率(圖2)。

圖 1 激光共聚焦顯微鏡觀察反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染效率Fig. 1 The transfection e fficiency was examined by laser confocal scanning microscope

圖 2 CCK-8檢測CBP過表達對細胞增殖能力的影響Fig. 2 The e ff ect of overexpression CBP on prolieration ability of human cSCC cell line A431 were detected by CCK-8 assay

2.3 CBP過表達對A431細胞凋亡的影響

采用Annexin V Apoptosis Detection Kit APC染色，F(xiàn)CM檢測的散點圖分析結(jié)果顯示，實驗組細胞發(fā)生中晚期凋亡壞死的細胞為(27.2±0.70)%，親本細胞組和對照組分別為(9.9±1.50)%和(15.33±2.00)%。由此可見，實驗組細胞出現(xiàn)凋亡及壞死的數(shù)量顯著增多，與親本細胞組及對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001，圖3)，說明CBP過表達可以誘導A431細胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。

2.4 CBP過表達對Lck、Csk和Fyn在mRNA中表達水平的影響

RTFQ-PCR檢測結(jié)果表明，實驗組A431細胞Lck mRNA的表達約為親本細胞組的0.4倍，相對表達水平顯著下調(diào)(P＜0.001)，親本細胞組與對照組之間表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；實驗組細胞Csk和Fyn mRNA的表達分別約為親本細胞組的1.6倍和3.8倍，表達顯著上調(diào)(P＜0.001)，親本細胞組與對照組之間表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖4)。

2.5 Western blot檢測Lck、Csk和Fyn蛋白表達水平

We s t e r n b l o t結(jié)果顯示，與對照組(0.857±0.007)和親本細胞組(0.910±0.006)相比，實驗組Lck蛋白的相對表達水平(0.809±0.016)明顯下降(P＜0.001)，親本細胞組與對照組的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；實驗組細胞Csk和Fyn蛋白相對表達(0.786±0.006，1.313±0.039)與親本細胞組(0.542±0.007，0.000±0.000)和對照組(0.527±0.007，0.416±0.008)相比明顯增加(P＜0.001，圖5)。這與3種基因在mRNA水平的表達結(jié)果相一致。

圖 3 FCM法檢測CBP過表達對A431細胞凋亡的影響Fig. 3 The e ff ect of overexpression CBP on apoptosis and mortality rate of human cSCC cell line A431 were detected by FCM

圖 4 RTFQ-PCR分析CBP過表達對Lck，Csk和Fyn在mRNA表達水平的影響Fig. 4 The in fluence of overexpression CBP on the relative mRNA expression of Lck, Csk and Fyn assayed by RTFQ-PCR

圖 5 Western blot檢測CBP在A431細胞中過表達對Lck，Csk和Fyn活性的影響Fig. 5 The in fluence of overexpression CBP on the activation of Lck, Csk and Fyn measured by Western blot

3 討 論

皮膚鱗癌的發(fā)生大多位于暴露輻射紫外線較多的皮膚部位，如面部和上肢，致使外形受損，嚴重影響患者的身心健康。有研究顯示，其發(fā)病率一直呈持續(xù)上升趨勢，給衛(wèi)生保健系統(tǒng)造成巨大的負擔，因此其防治越來越受到重視［4］。近年來，隨著分子生物學技術(shù)及遺傳學的發(fā)展，靶分子治療在皮膚鱗癌中的應用越來越受關注。CBP是2000年發(fā)現(xiàn)報道的新基因，是跨膜接頭蛋白家族成員之一，腫瘤相關性是其研究的熱點［3］。關于CBP在腫瘤中的表達和其在腫瘤中的生物學影響的報道不少，但在不同類型的腫瘤中，其表達結(jié)果各異。在神經(jīng)母細胞細胞系中，敲除CBP基因可促進其增殖，使CBP過表達則出現(xiàn)明顯的抑制作用，提示CBP可能在某些類型的腫瘤中起抑制作用［5］。然而，在腎癌組織中，CBP過表達有致癌作用，并與腫瘤轉(zhuǎn)移相關［6］。在非小細胞肺癌中，CBP明顯抑制伴有c-Src上調(diào)類型的腫瘤細胞生長，而對不伴有c-Src上調(diào)類型的腫瘤細胞沒有抑制作用［7］。因此，CBP的作用機制根據(jù)腫瘤類型不同而不同［3］。

為了探討CBP對皮膚鱗癌的作用，本實驗將構(gòu)建有CBP基因的載體轉(zhuǎn)染進入A431細胞中，觀察CBP過表達對A431細胞增殖及凋亡的影響。細胞增殖實驗結(jié)果顯示，CBP表達上調(diào)可使細胞增殖活性明顯下降。細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，上調(diào)表達CBP有助于誘導細胞凋亡，甚至導致細胞發(fā)生壞死。CBP主要由SFK家族的Fyn磷酸化激活后招募胞質(zhì)蛋白Csk到脂筏上，進而通過調(diào)節(jié)SFKs參與細胞轉(zhuǎn)化和惡性疾病發(fā)?。?］。也有研究證明，CBP-Fyn-Sam68-RasGAP復合體參與SFK負性調(diào)控Ras蛋白［9］。本研究通過RTFQ-PCR和Western blot檢測Csk和Fyn蛋白的表達，結(jié)果顯示，實驗組伴隨外源性CBP表達的提高，Csk及Fyn的表達都顯著提高。Lck是細胞活化信號轉(zhuǎn)導通路中重要的上游激活蛋白。提示CBP表達增強后，會相應的抑制Lck表達，阻斷Lck的激酶活性。因此，我們認為CBP招募CSK進入脂筏發(fā)揮抑制作用，可能主要是通過阻斷LCK等活化類蛋白酪氨酸激酶的磷酸化，進而阻斷了下游信號的傳導。

本研究表明，CBP的表達可以抑制皮膚癌細胞增殖，并促進細胞凋亡，具有明顯的抑癌效應。它是一種新的腫瘤抑制基因，可通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導通路中相關蛋白酪氨酸激酶的表達來實現(xiàn)其功能。后續(xù)需要圍繞CBP對皮膚癌細胞的侵襲、遷移及體內(nèi)效應展開進一步的研究。

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CBP mediates negative regulation of growth and proliferation of cutaneous squamous cell carcinoma A431 in vitro

LI Meijia1, ZHANG Weina1, QU Kaipan1, WANG Bing2

(1. Department of Burn and Plastic Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China; 2. Department of Immunology, Medical College of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China)

WANG Bing E-mail: wangbing@qdu.edu.cn

Background and purpose: The transmembrane adaptor Csk-binding protein (CBP), a recently identi fied tyrosine kinase of the Src family, is implicated in various aspects of cancer cell biology. This study aimed to investigate the e ff ect of the transmembrane protein CBP on the proliferation and apoptosis ability of A431 cells of human cutaneous squamous cell carcinoma and the implicated molecular mechanism. Methods: The CBP-EGFP lentiviral vector was constructed. A431 cells were transfected with CBP-EGFP lentiviral vector or negative-EGFP lentiviral vector, or remained untransfected. The transfection efficiency was detected by laser confocal microscope. After additional culture, the proliferation potential of A431 cells was assayed with CCK-8, and the apoptotic rate was assessed by flow cytometry (FCM). Lck, Csk and Fyn mRNA levels were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) and their protein levels by Western blot. Results: The A431 cell line with overexpression ofPAG was constructed successfully. CCK-8 results suggested that overexpression of CBP markedly inhibited cell growth, with statistically signi ficant di ff erences at 2-6 days between the groups (P＜0.05). FCM showed that both the apoptotic rate and the death rate of the cells transfected with CBP-EGFP lentiviral vector were increased signi ficantly compared to those of the cells transfected with negative-EGFP lentiviral vector or untransfected cells (P＜0.001). RTFQ-PCR results showed that the Lck mRNA relative expression level of the cells transfected with CBP-EGFP lentiviral vector was signi ficantly reduced (P＜0.001), but Csk and Fyn mRNA expression levels were 1.6 times and 3.8 times as high as the untransfected cells, respectively (P＜0.001). Western blot results showed that the Lck protein level was signi ficantly decreased after transfection with CBP-EGFP lentiviral vector (P＜0.001), whereas the Csk and Fyn protein levels were signi ficantly increased (P＜0.001). Conclusion: The ectopic expression of CBP might inhibit the proliferation or growth of A431 cells, induce cell apoptosis and accelerate cell death, which may be related to down-regulation of Lck and up-regulation of Csk and Fyn expression.

cutaneous squamous cell carcinoma; Csk-binding protein; proliferation; apoptosis

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.07.002

R739.5

A

1007-3639(2017)07-0527-06

2017-02-01

2017-03-30）

王 冰 E-mail: wangbing@qdu.edu.cn