孔有琴 丁志麗 張易祥 羅 娜,2 葉金云*

(1.浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術研究重點實驗室，中國水產科學研究院水生動物繁育與營養(yǎng)重點實驗室，湖州師范學院生命科學學院，湖州313000；2.大連海洋大學水產與生命科學學院，大連116000)

維生素E對日本沼蝦生長性能、抗氧化性能及抗氨氮脅迫能力的影響

孔有琴1丁志麗1張易祥1羅 娜1,2葉金云1*

(1.浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術研究重點實驗室，中國水產科學研究院水生動物繁育與營養(yǎng)重點實驗室，湖州師范學院生命科學學院，湖州313000；2.大連海洋大學水產與生命科學學院，大連116000)

本試驗旨在研究飼料中維生素E水平對日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)幼蝦生長性能、抗氧化性能和抗氨氮脅迫能力的影響。選擇健壯、平均初始體重為(0.119±0.004) g的900只日本沼蝦幼蝦，隨機分為6個組，每組3個重復，每個重復50只。以維生素E乙酯為添加形式，配制6組維生素E實際含量分別為18.31、37.94、66.07、120.25、212.68和388.96 mg/kg的半純化飼料(分別記為VE1、VE2、VE3、VE4、VE5和VE6組)，飼喂8周，隨后進行24 h氨氮脅迫試驗。結果顯示：1)各組日本沼蝦成活率(SR)無顯著差異(P>0.05)；隨飼料維生素E水平的增加，日本沼蝦增重率(WGR)呈先增加后下降的變化趨勢，VE4組最高，且顯著高于VE1組(P<0.05)；飼料系數(FCR)變化趨勢則與WGR相反，VE4組最低，且顯著低于VE1組(P<0.05)。2)氨氮脅迫前，各組日本沼蝦肝胰腺中丙二醛(MDA)含量隨飼料維生素E水平的增加呈先下降后上升的變化趨勢，在VE3組達到最低，且顯著低于VE1、VE5和VE6組(P<0.05)；各組日本沼蝦肝胰腺總超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力和總抗氧化力(T-AOC)隨飼料維生素E水平的增加呈先上升后下降的變化趨勢。VE1和VE6組日本沼蝦硫氧還蛋白(Trx)mRNA表達量較高，硫氧還蛋白還原酶(TrxR)mRNA表達量則較低。VE3組熱休克蛋白60(HSP60)mRNA表達量顯著低于其他各組(P<0.05)，VE1組熱休克同源蛋白70(HSC70) mRNA表達量顯著低于其他各組(P<0.05)，VE1和VE2組熱休克蛋白90(HSP90)mRNA表達顯著高于其他各組(P<0.05)。3)氨氮脅迫后，各組日本沼蝦肝胰腺SOD、CAT、GSH-Px活力，MDA含量，Trx、TrxR和HSC70 mRNA表達量的變化趨勢與脅迫前相似，HSP60和HSP90 mRNA表達量變化與脅迫前相反。氨氮脅迫可降低日本沼蝦肝胰腺GSH-Px活力、T-AOC及Trx、TrxRmRNA表達量，提高MDA含量及VE4、VE5和VE6組SOD活力。由此可見，飼料中添加120.25 mg/kg維生素E對日本沼蝦的生長具有積極的促進作用，飼料中添加66.07、120.25和212.68 mg/kg的維生素E可提高日本沼蝦抗氧化性能和抗氨氮脅迫能力。

日本沼蝦；維生素E；生長；抗氧化力；氨氮

維生素E(vitamin E)是維持動物體正常生長和生理功能所必需的一種微量營養(yǎng)素[1]。生理上，維生素E參與機體的抗氧化、細胞信號傳導、生殖發(fā)育、免疫調節(jié)、抗應激等過程[2-3]。在水產動物的營養(yǎng)生理研究中，維生素E的抗氧化和抗應激作用一直備受研究者的關注。如飼料中添加適量的維生素E可顯著提高斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)肝胰腺的超氧化物歧化酶(SOD)活力，降低丙二醛(MDA)含量[4]；顯著提高凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)SOD、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力[5]。與此同時，維生素E對農藥[6-7]、重金屬污染[8]、擁擠應激[9]及高脂飼料[10]等產生的脅迫具有有效的保護作用。

隨著水質污染加劇和集約化養(yǎng)殖的快速發(fā)展，氨氮成為水產動物養(yǎng)殖環(huán)境中最常見的脅迫因子之一。氨氮脅迫可嚴重影響機體的生長、呼吸、抗氧化和免疫等生理功能[11-13]，過量的氨氮被認為是環(huán)境因素導致蝦蟹疾病的重要原因之一[14]。研究發(fā)現，營養(yǎng)調控是緩解脅迫的一種簡單、有效的技術手段之一[15]。如維生素E可有效緩解氨氮脅迫對青魚(Mylopharyngodonpiceus)[16]、云紋石斑魚(Epinehelusmoara)[17]的不利作用。

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)俗稱河蝦、青蝦，屬節(jié)肢動物門、甲殼綱、十足目、長臂蝦科、沼蝦屬[18]。日本沼蝦因為其口味鮮美、營養(yǎng)價值高，成為中國、日本和其他東南亞國家主要淡水養(yǎng)殖品種之一，在我國的養(yǎng)殖區(qū)主要集中于長江中下游一帶，比如浙江、江蘇、安徽等省份[19]。據最新統(tǒng)計，2015年全國日本沼蝦的年產量達到26.5萬t，比2014年增長了2.88%[20]。日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展推動了對其生物學特性、營養(yǎng)生理學研究的需求，但目前對日本沼蝦的營養(yǎng)生理的研究還較滯后，現有的研究多集中于蛋白質[19-21]、脂類[22]、部分微量元素[23-24]等，關于維生素E的營養(yǎng)生理學研究還鮮有報道。本文擬用含不同維生素E含量的飼料投喂日本沼蝦幼蝦，探討維生素E對日本沼蝦生長性能、抗氧化性能和抗氨氮脅迫能力的影響，以期為該蝦配合飼料的開發(fā)和綠色健康養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗用日本沼蝦購自于浙江湖州南潯一養(yǎng)殖場，正式試驗前先暫養(yǎng)1周，使日本沼蝦適應養(yǎng)殖環(huán)境。而后選擇健壯活潑、平均初始體重為(0.119±0.004) g的900只日本沼蝦幼蝦，隨機分為6個組，每組3個重復，每個重復50只。日本沼蝦幼蝦隨機放入到18只體積為300 L的水槽中進行養(yǎng)殖試驗，每個水槽放50只日本沼蝦。正式養(yǎng)殖試驗共持續(xù)8周。

1.2 試驗飼料

以酪蛋白和魚粉作為蛋白質源，魚油和大豆油作為脂肪源，玉米淀粉作為糖源，配制基礎飼料，基礎飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。按照試驗設計，添加相應含量維生素E乙酯(Sigma，美國)到基礎飼料中，配制6組維生素E水平分別為0、25、50、100、200和400 mg/kg的試驗飼料(分別記為VE1、VE2、VE3、VE4、VE5和VE6組)。試驗飼料按以下方法進行制備：首先用粉碎機將原料粉碎并過80目篩，然后按需要準確稱取各種原料，逐級均勻混合，加入魚油和豆油再次混勻，同時添加一定的水攪拌混勻，最后用小型飼料造粒機制成粒徑為1.5 mm的顆粒飼料，置于40 ℃烘箱烘干至水分含量為10%左右，用自封袋封裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用中華人民共和國國家標準GB/T 17812—2008的高效液相色譜法測得各組試驗飼料中維生素E實際含量分別為18.31、37.94、66.07、120.25、212.68和388.96 mg/kg。按照AOAC(1995)[25]標準，測定飼料常規(guī)成分，每個樣品設置3個平行。粗蛋白質含量測定采用凱氏定氮法測定；粗脂肪含量采用索氏抽提法測定；粗灰分含量測定是先于200 ℃碳化樣品至不冒煙，再于550 ℃馬弗爐中灼燒至恒重；水分含量是采用在105 ℃烘干到恒重的方法進行測定。

1.3 養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗于2015年7—9月于浙江湖州壯大水產養(yǎng)殖場進行。試驗期間連續(xù)充氧保持溶氧濃度>6.5 mg/L。養(yǎng)殖的水質條件為：水溫25～30 ℃，總氨氮濃度<0.1 mg/L。養(yǎng)殖期間，每天投喂飼料2次，分別在08:00和16:00投喂。光照為自然光照，養(yǎng)殖水為自然河水。為了保持養(yǎng)殖水質，每天吸出日本沼蝦排泄物并換1/3的養(yǎng)殖水量。每只水槽內放置一定量的網片作為日本沼蝦的躲避物，以減少沼蝦為爭搶飼料而進行互相殘殺。

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)無維生素E的維生素混合物為每千克飼料提供 Vitamin E-free vitamin mix provided the following per kg of the diet：VA 1.0 g，VD30.63 g，VC 14 g，VK31.8 g，VB10.75 g，VB61 g，VB120.15 g，煙酸 nicotinic acid 5 g，核黃素 riboflavin 2.63 g，對氨基苯甲酸 aminobenzoic acid 5 g，泛酸鈣 calcium pantothenate 5 g，生物素 biotin 0.75 g，葉酸 folic acid 0.19 g，肌醇 inositol 60 g，α-纖維素 α-cellulose 902.1 g。

2)礦物質混合物為每千克飼料提供 The mineral mix provided the following per kg of the diet：KCl 0.84 g，MgSO4·7H2O 3 g，NaH2PO46.45 g，KH2PO43 g，Ca(H2PO4)2·H2O 7.95 g，CaCO33.15 g，C6H10CaO6·5H2O 4.95 g，FeC6H5O7·5H2O 0.36 g，ZnSO4·7H2O 0.142 8 g，MnSO4·H2O 0.032 1 g，CuCl2·2H2O 0.070 4 g，Na2SeO30.001 3 g，AlCl3·6H2O 0.004 5 g，CoCl2·6H2O 0.042 g，KI 0.006 9 g。

3)誘食劑組成 Attractant composition：丙氨酸 alanine 0.6%，甘氨酸 glycine 0.6%，谷氨酸 glutamic acid 0.6%，甜菜堿 betaine 1.2%。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結束后，養(yǎng)殖蝦饑餓24 h，計數、稱重用于生長指標的分析。采集各組日本沼蝦肝胰腺，-80 ℃保存，用于后續(xù)抗氧化相關酶指標測定及基因表達分析。

1.5 氨氮脅迫試驗

養(yǎng)殖試驗結束后，每組留取60只日本沼蝦(每個水槽留20只)用于氨氮脅迫試驗，脅迫試驗每組設3個平行，每個平行20只蝦。根據Wang等[26]試驗結果，設定氨氮脅迫試驗的總氨氮濃度為37 mg/L。脅迫用試劑為氯化銨，先配制10 g/L的氯化銨母液，而后根據水槽體積將適量母液加入，以調成所設定的脅迫濃度(37 mg/L)。水體中氨氮濃度采用納氏試劑法[27]測定，每隔6 h測定養(yǎng)殖水體氨氮濃度并用氯化銨母液進行調節(jié)。脅迫24 h后，采集日本沼蝦肝胰腺并于-80 ℃用于后續(xù)的抗氧化相關指標測定和基因表達分析。

1.6 指標測定

1.6.1 生長性能指標的測定

生長性能相關指標按照以下公式進行計算:

成活率(survival rate，SR，%)=100×試驗結束時存活的蝦個數/試驗開始時放入的蝦個數；
增重率(weight gain rate，WGR，%)=100×(試驗結束時蝦均重-試驗開始時蝦均重)/試驗開始時蝦均重；
飼料系數(feed conversion rate，FCR)=飼料攝入量/(試驗結束時蝦均重-試驗開始時蝦均重)；
攝食率(feeding rate，FR，%)=100×攝入飼料總量/[試驗天數×(末總重+初總重)/2]。

1.6.2 肝胰腺抗氧化酶活力及MDA含量測定

準確稱取肝胰腺0.50～0.70 g于2 mL無菌離心管中，加入9倍體積的預冷生理鹽水，電動勻漿10～20 s，制成10%勻漿液。4 ℃、4000 r/min離心10 min，收集上清液(即為待測液)用于后續(xù)的抗氧化酶活力和MDA含量測定。測定時，每組設3個重復。待測液中蛋白質濃度采用考馬斯亮藍法進行測定?？寡趸富盍蚆DA含量測定采用相應的各商用試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

SOD活力測定：采用Elstner等[28]的黃嘌呤氧化酶法。通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)生成超氧根離子(O2-·)，而后O2-·會氧化羥胺生成在顯色劑的作用下呈現紫紅色的亞硝酸鹽。當被測樣品中含SOD時，SOD會專一性的抑制O2-的生成，從而減少亞硝酸鹽的產生量。1 mg組織蛋白質在1 mL反應液中SOD抑制效率達到1/2時所對應的SOD量定義為1個SOD活力單位(U)。

CAT活力測定：采用Aebi[29]的方法,以過氧化氫(H2O2)含量的減少來進行測定。每分鐘還原1 μmol H2O2所需CAT的量定義為1個CAT活力單位。

GSH-Px活力測定：通過分析GSH-Px催化的谷胱甘肽(GSH)與H2O2的反應中GSH的減少量來測定酶活力[30]。1 mg組織蛋白質，去除非酶反應的作用，每分鐘使反應體系中GSH濃度下降1 μmol/L時定義為1個GSH-Px活力單位。

T-AOC測定：機體內鐵離子在抗氧化物質催化下還原生成的亞鐵離子與啡啉類物質形成穩(wěn)定絡合物，通過520 nm光吸收值變化測定抗氧化能力的高低[31]。37 ℃下，每分鐘時間內，1 mg組織蛋白質使反應體系的吸光度值每增加0.01時定義為1個T-AOC單位。

采用硫代巴比妥酸(TBA)法[32]測定日本沼蝦肝胰腺組織中MDA含量變化，以此來評估機體脂質過氧化的程度。硫代巴比妥酸與脂質過氧化中的產物MDA縮合形成紅色產物，根據顏色變化于532 nm進行比色。

1.6.3 抗氧化相關基因mRNA表達量分析

采用組織/細胞RNA快速提取試劑盒(Aidlab，北京)提取各組總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性，與此同時，RNA純度和濃度用Thermo NanoDrop 2000核酸蛋白測定儀檢測。用TaKaRa(大連)反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit將總RNA反轉錄合成cDNA，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)對脅迫前后各組日本沼蝦肝胰腺中熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)60和90、熱休克同源蛋白70(heat shock cognate protein 70，HSC70)、硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)和硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)的mRNA表達量進行定量分析，β肌動蛋白(β-actin)作為qRT-PCR反應中的內參基因。測定時，每組設3個重復。qRT-PCR所用引物見表2。采用康為CWBIO(北京)的實時熒光定量試劑盒UltraSYBR Mixture進行PCR反應。PCR反應體積為20 μL，包括10 μL 2 × UltraSYBRMixture、正向和反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL、1 μL cDNA、8 μL ddH2O。qRT-PCR反應條件為：95 ℃預變性10 min，94 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)；PCR反應后繪制熔解曲線以判斷擴增產物的正確性，溫度以0.5 ℃/5 s的速度從60 ℃上升到95 ℃。使用2-ΔΔCt方法對目的基因mRNA表達量進行分析[33]。

表2 qRT-PCR引物序列

S:正向引物 sense primer；A:反向引物 anti-sense primer。

1.7 統(tǒng)計分析

試驗數據用平均值±標準誤表示。對脅迫前或脅迫后，不同維生素E水平組間數據采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，當不同組間有顯著差異時，用Turkey法檢驗進行多重比較；同一組脅迫前后采用t檢驗方法進行分析，顯著水平為0.05，所有數據均使用SPSS 19.0軟件進行處理分析。成活率數據在分析前先進行反正弦轉換。

2 結 果

2.1 維生素E對日本沼蝦生長性能的影響

由表3可見，日本沼蝦的成活率不受飼料中維生素E水平的影響，雖然VE4組的成活率達到最高(86%)，但各組間沒有顯著性差異(P>0.05)。隨著飼料中維生素E水平的增加，日本沼蝦的增重率呈現先升高后下降的變化趨勢，VE4組達到最高，且顯著高于VE1組(P<0.05)，但與其余4組的差異不顯著(P>0.05)。各組日本沼蝦的飼料系數呈與增重率相反的變化趨勢，VE4組最低，且顯著低于VE1組(P<0.05)。飼料維生素E水平對日本沼蝦攝食率的影響不顯著(P>0.05)。

2.2 維生素E對日本沼蝦肝胰腺抗氧化酶活力及MDA含量的影響

如圖1所示，飼料維生素E水平對日本沼蝦肝胰腺的抗氧化酶活力和MDA含量均產生影響。脅迫前，隨著飼料維生素E水平的增加，日本沼蝦肝胰腺的SOD活力也隨之增加，并于VE4組(120.25 mg/kg)達到最高，而后呈下降趨勢，且VE4組肝胰腺的SOD活力顯著高于VE1和VE2組(P<0.05)，但與VE3、VE5和VE6組相比差異不顯著(P>0.05)。脅迫后，肝胰腺的SOD活力變化趨勢與脅迫前類似，在VE5組(212.68 mg/kg)達到最高，顯著高于其他各組(P<0.05)，VE1和VE2組肝胰腺的SOD活力顯著低于其他各組(P<0.05)。VE3、VE4、VE5和VE6組脅迫后日本沼蝦肝胰腺的SOD活力均顯著高于脅迫前(P<0.05)，VE1和VE2組脅迫前后日本沼蝦肝胰腺的SOD活力差異不顯著(P>0.05)。

表3 維生素E對日本沼蝦生長性能的影響

同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

隨飼料維生素E水平的變化，脅迫前后日本沼蝦肝胰腺的GSH-Px、CAT活力和T-AOC均呈與脅迫前肝胰腺的SOD活力類似的變化趨勢。脅迫前后，VE4和VE5組日本沼蝦肝胰腺的GSH-Px活力均較高，且顯著高于VE1、VE2和VE6組(P<0.05)。除VE2組脅迫前后日本沼蝦肝胰腺的GSH-Px活力無顯著差異(P>0.05)外，其余組脅迫后肝胰腺的GSH-Px活力均顯著低于脅迫前(P<0.05)。

無論脅迫前還是脅迫后，VE3、VE4和VE5組日本沼蝦肝胰腺的CAT活力均較高，VE1組則最低；與脅迫前相比，VE3組脅迫后日本沼蝦肝胰腺的CAT活力顯著降低(P<0.05)，其余各組脅迫前后肝胰腺的CAT活力差異不顯著(P>0.05)。無論脅迫前后，VE5組肝胰腺的T-AOC均為最高，其次是VE3和VE4組；VE1、VE2和VE6組肝胰腺的T-AOC較低，顯著低于VE5組(P<0.05)。與脅迫前相比，脅迫后各組肝胰腺的T-AOC均顯著下降(P<0.05)。

隨著飼料維生素E水平的升高，脅迫前或脅迫后日本沼蝦肝胰腺的MDA含量均呈先下降后上升的變化趨勢，在VE2、VE3和VE4組(37.94～120.25 mg/kg)含量較低，且顯著低于VE6組(P<0.05)。與脅迫前相比，脅迫后各組肝胰腺的MDA含量均升高，且VE1、VE3、VE4和VE6組脅迫后的肝胰腺的MDA含量顯著高于脅迫前(P<0.05)。

數據柱上標不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)，*表示脅迫前后差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Value columns with different letters mean significant difference among different groups (P<0.05), and * mean significant difference between before and after stress (P<0.05). The same as below.

圖1 維生素E對脅迫前后日本沼蝦肝胰腺SOD(A)、CAT(B)、GSH-Px活力(C)和T-AOC(D)及MDA含量(E)的影響

Fig.1 Effects of vitamin E on SOD (A),CAT (B), GSH-Px activities (C) and T-AOC (D) and MDA content (E) in hepatopancreas ofMacrobrachiumnipponensebefore and after stress

2.3 維生素E對日本沼蝦肝胰腺抗氧化相關基因mRNA表達量表達的影響

如圖2所示，脅迫前，隨飼料維生素E水平的增加，日本沼蝦肝胰腺HSP60 mRNA表達量呈先下降后上升的變化趨勢，VE3組肝胰腺HSP60 mRNA表達量最低，顯著低于其他各組(P<0.05)；VE6組肝胰腺HSP60 mRNA表達量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。脅迫后，各組肝胰腺HSP60 mRNA表達量變化趨勢與脅迫前相反，VE3組最高，且顯著高于VE1和VE2組(P<0.05)。脅迫后VE3組肝胰腺HSP60 mRNA表達量顯著高于脅迫前(P<0.05)；其余各組肝胰腺HSP60 mRNA表達量均低于脅迫前，且VE1、VE4和VE6組顯著低于脅迫前(P<0.05)。

無論脅迫前后，VE3、VE4、VE5和VE6組日本沼蝦肝胰腺HSC70 mRNA表達量均較高，顯著高于VE1組(P<0.05)。脅迫后各組肝胰腺HSC70 mRNA表達量均低于脅迫前，且在VE1組差異顯著(P<0.05)。

脅迫前，日本沼蝦肝胰腺HSP90 mRNA表達量隨飼料維生素E水平增加呈下降趨勢，VE1和VE2組的肝胰腺HSP90 mRNA表達量顯著高于其他各組(P<0.05)；脅迫后，隨飼料維生素E水平增加，肝胰腺HSP90 mRNA表達量呈先升高后下降變化趨勢，且VE3組顯著高于其他各組(P<0.05)，VE1組顯著低于其他各組(P<0.05)。氨氮脅迫顯著降低各組肝胰腺HSP90 mRNA表達量(P<0.05)。

圖2 維生素E對脅迫前后日本沼蝦肝胰腺HSP60(A)、HSC70(B)和HSP90 mRNA(C)表達量的影響

如圖3所示，隨飼料維生素E水平的增加，脅迫前后各組日本沼蝦肝胰腺TrxmRNA表達量呈先下降后上升的變化趨勢，VE2、VE3、VE4和VE5組肝胰腺TrxmRNA表達量較低，且脅迫前顯著低于VE6組(P<0.05)。脅迫后肝胰腺TrxmRNA表達量低于脅迫前，除VE3、VE4和VE5組脅迫前后差異不顯著(P>0.05)外，其余3組脅迫后顯著低于脅迫前(P<0.05)。

脅迫前后日本沼蝦肝胰腺TrxRmRNA表達量先是隨著飼料維生素E水平的增加而增加，VE2和VE3組顯著高于其余各組(P<0.05)，而后呈下降趨勢。脅迫后VE2、VE3、VE4、VE5和VE6組肝胰腺TrxRmRNA表達量顯著低于脅迫前(P<0.05)。

3 討 論

3.1 維生素E對日本沼蝦生長性能的影響

已有研究顯示：飼料中添加維生素E可顯著提高斑節(jié)對蝦[4]、南美白對蝦(Penaeusvannamei)[34]和大比目魚(Scophthalmusmaximus)[35]等的增重率或特定生長率，降低飼料系數[35]。本研究也發(fā)現飼料中添加維生素E可提高日本沼蝦幼蝦的生長性能，且維生素E含量為120.25 mg/kg(VE4組)時日本沼蝦的生長性能達到最佳，飼料系數最低；低水平維生素E(18.31 mg/kg)對日本沼蝦的生長性能產生抑制效應；高水平維生素E(388.87 mg/kg)雖與VE4組差異不顯著，但呈下降的變化趨勢，我們推測更高的飼料維生素E水平可能會對日本沼蝦生長產生顯著抑制效應。據報道，高水平的維生素E具有降低大比目魚[35]、斑節(jié)對蝦[4]生長性能的趨勢，但對南美白對蝦[34]、青魚[16]的增重率或特定生長率無影響?？梢姡^量維生素E對不同物種的影響存在差異性，這可能是因為物種特異性、動物發(fā)育不同階段和維生素E的不同添加形式等因素造成的。本研究中日本沼蝦的增重率(278%～426%)低于商用飼料的試驗結果[36]，飼料系數偏高。這可能是因為日本沼蝦屬于雜食性偏食動物性餌料[37]，對飼料中魚粉含量變化比較敏感，半純化飼料中魚粉含量較低，降低飼料適口性，導致生長性能不佳[38-39]。

圖3 維生素E對脅迫前后日本沼蝦肝胰腺Trx(A)和TrxR mRNA(B)表達量的影響

3.2 維生素E對日本沼蝦肝胰腺抗氧化性能的影響

MDA是脂質過氧化的產物，常被用來衡量機體內源性氧化損傷的狀態(tài)。本研究發(fā)現維生素E缺乏和過量可提高日本沼蝦肝胰腺MDA含量，添加適量維生素E(66.07～120.25 mg/kg)顯著降低日本沼蝦肝胰腺MDA含量。類似地，飼料中添加適量維生素E可顯著降低草魚(Ctenopharyngodonidella)[40]和軍曹魚(Rachycentroncanadum)[41]組織中MDA的積累?？梢婏暳暇S生素E缺乏或過量可在日本沼蝦體內誘導氧化脅迫。為了減少氧化脅迫，維持體內自由基的動態(tài)平衡，生物體進化出了多種抗氧化防御反應，比如?；目寡趸溉鏢OD、CAT和GSH-Px等[42]。本研究中，飼料維生素E水平對日本沼蝦幼蝦肝胰腺的抗氧化酶活力產生顯著影響，維生素E含量為66.07～212.68 mg/kg(VE3、VE4和VE5組)時可顯著提高日本沼蝦肝胰腺SOD、CAT和GSH-Px活力。此外，隨著飼料維生素E水平的變化，T-AOC變化趨勢與抗氧化酶活力類似。已有研究者在南美白對蝦[5]、草魚[40]、大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)[43]和羅非魚[44]等物種中發(fā)現了相似的研究結果。

與此同時，動物體內的一些氧化還原系統(tǒng)如Trx系統(tǒng)在抗氧化方面也發(fā)揮著至關重要的作用。Trx系統(tǒng)由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、TrxR和Trx組成，可為體內多種酶提供電子，從而參與體內自由基清除、氧化還原狀態(tài)的維持、細胞凋亡、DNA和蛋白質修復等生理過程[45]。目前研究多集中于各種脅迫下Trx和TrxRmRNA表達量變化[46-47]。此外，機體營養(yǎng)水平與Trx和TrxRmRNA表達量間的關系也有零星報道[48-50]，這為通過營養(yǎng)學方法緩解脅迫提供依據。本研究結果顯示，飼料維生素E水平顯著影響日本沼蝦肝胰腺Trx和TrxRmRNA表達量。過低或過高維生素E水平可誘導日本沼蝦TrxmRNA的表達，但安清聰等[50]發(fā)現維生素E缺乏抑制豬胎兒皮膚成纖維細胞中Trx的表達。這可能是因為維生素E對Trx基因表達的影響具有物種特異性，但具體機制有待進一步研究。外界因素如高溫、感染、H2O2等易誘導Trx的表達[51]。維生素E作為一種抗氧化劑，其缺乏可在體內產生氧化脅迫，添加過量可能在體內產生促氧化作用[52]。本研究結果表明，維生素E缺乏或過量可使日本沼蝦體內氧自由基增多，引起氧化脅迫，誘導了Trx的表達。然而，隨著飼料中維生素E水平的變化，日本沼蝦肝胰腺TrxRmRNA表達量變化與TrxmRNA表達量的變化趨勢相反，添加適量的維生素E對TrxRmRNA表達量具有積極的促進作用。據報道，適量的硒可誘導機體TrxR的表達[49,53]?？梢姡S生素E水平影響日本沼蝦TrxR表達，過低或過高維生素E引起氧化脅迫，抑制基因的表達。

鑒于以上結果，我們可知維生素E缺乏，日本沼蝦肝胰腺抗氧化能力降低，肝胰腺MDA含量升高，脂質過氧化，降低抗氧化相關酶活性或基因的表達；維生素E過高則帶來促氧化作用，破壞日本沼蝦體內的氧化-抗氧化動態(tài)平衡，自由基增多，產生氧化損傷，抑制了抗氧化酶的表達；但氧化應激誘導了Trx的表達以應對脅迫。

3.3 維生素E對日本沼蝦肝胰腺HSP60、HSC70和HSP90 mRNA表達量的影響

HSP是生物細胞在受到應激原(生物應激、理化因素等)刺激后誘導產生的一類高度保守的蛋白質，在維持蛋白質構象、抗凋亡、細胞保護等方面具有積極作用[54]。研究發(fā)現，飼料中維生素E的缺乏或過量可顯著誘導HSP60轉錄水平的表達。同時，維生素E缺乏組的HSP90 mRNA表達量也顯著高于維生素E添加組，以上結果與適量維生素E可降低山羊HSP表達的規(guī)律相似[55]。這進一步說明維生素E不足或過量引起氧化脅迫，誘導日本沼蝦高表達HSP60和HSP90以提供保護作用。HSC70為HSP70中的一種，屬于熱休克同源蛋白，在正常細胞中有較高的表達量，參與機體細胞的分裂、增殖及免疫等生理過程[56]。據報道，HSC70表達可受機體營養(yǎng)水平的影響，如團頭魴(MegalobramaamblycephalaYih)HSC70 mRNA表達可受飼料維生素C的誘導[57]。在本研究中，維生素E缺乏顯著降低了日本沼蝦肝胰腺蝦HSC70 mRNA表達量，表明補充維生素E能提高HSC70表達mRNA表達量，增強對機體的保護作用。

3.4 維生素E對氨氮脅迫日本沼蝦的緩釋作用

本研究發(fā)現，氨氮脅迫后，飼料的維生素E水平≥66.07 mg/kg組(VE3、VE4、VE5和VE6組)日本沼蝦肝胰腺的SOD活力顯著高于脅迫前，說明對于維生素E補充組，短期氨氮脅迫誘導了SOD的表達。類似地，有研究者發(fā)現短期氨氮脅迫也可顯著提高克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[58]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[59]的SOD活力。這可能因為是短期的脅迫會對SOD表達具有一種暫時的刺激興奮效應[60]，提高SOD表達，以提高機體應對脅迫的能力，但維生素E缺乏，則不能產生這種刺激效應。同時，氨氮脅迫顯著降低了日本沼蝦肝胰腺的T-AOC和GSH-Px活力，提高MDA含量，相似的研究結果發(fā)現于中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)[61]。

據報道，脅迫可影響機體TrxR和Trx的表達，如甲基汞暴露可降低魚肝臟中Trx和TrxR活性[47]；高濃度石英粉塵使人胚肺成纖維細胞的Trx和TrxR基因和蛋白質水平表達顯著下調[46]。與此類似，我們發(fā)現氨氮脅迫可降低日本沼蝦肝胰腺TrxR和TrxmRNA表達量，但VE3、VE4和VE5組TrxmRNA表達量在脅迫前后差異不顯著。以上結果表明：氨氮脅迫可通過下調抗氧化酶活性和Trx系統(tǒng)中Trx和TrxRmRNA表達量，導致體內氧化產物MDA積累，從而加重日本沼蝦體內的氧化損傷。但脅迫后，適量維生素E組的T-AOC和GSH-Px、CAT活力及Trx、TrxRmRNA表達量高于維生素E缺乏或過量組，說明添加適量水平的維生素E對氨氮脅迫具有一定的保護作用。

氨氮脅迫對日本沼蝦肝胰腺HSP60、HSC70和HSP90 mRNA表達量產生不同影響。HSP90在正常細胞中具有較高表達量，參與信號傳導、細胞降解、免疫等多個生理過程[62]。本研究發(fā)現氨氮脅迫顯著抑制HSP90的表達，但脅迫后，添加適量維生素E組的HSP90 mRNA表達量顯著高于維生素E缺乏和過量組。與此類似，氨氮脅迫48 h后可降低中國對蝦HSP90的表達[61]。脅迫后VE1組HSC70 mRNA表達量顯著低于脅迫前；脅迫后維生素E缺乏和過量組HSP60 mRNA表達量顯著低于脅迫前，但VE3組HSP60 mRNA表達量顯著高于脅迫前?？梢?，氨氮脅迫后HSP表達水平下降可能是氨氮脅迫誘導組織損傷有關，但添加適量的維生素E可以提高HSP表達，提高日本沼蝦應對脅迫的能力。

4 結 論

① 飼料維生素E水平對日本沼蝦幼蝦生長性能和抗氧化性能產生顯著影響，適宜水平的維生素E(66.07～212.68 mg/kg)對其生長性能和抗氧化性能具有積極的促進作用。

② 維生素E缺乏或過量可誘導日本沼蝦HSP60和HSP90 mRNA的表達，但對HSC70 mRNA表達產生抑制效應。

③ 氨氮脅迫降低了日本沼蝦抗氧化性能，但添加適量的維生素E(66.07～212.68 mg/kg)可提高日本沼蝦應對脅迫的能力。

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*Corresponding author, professor, E-mail: yjy@zjhu.edu.cn

(責任編輯 武海龍)

Effects of Dietary Vitamin E on Growth Performance, Antioxidant Ability and Resistance to Ammonia Nitrogen Stress ofMacrobrachiumnipponense

KONG Youqin1DING Zhili1ZHANG Yixiang1LUO Na1,2YE Jinyun1*

(1.ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofAquaticResourcesConservationandDevelopment,KeyLaboratoryofAquaticAnimalGeneticBreedingandNutrition,ChineseAcademyofFisherySciences,CollegeofLifeSciences,HuzhouUniversity,Huzhou313000,China; 2.CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,Dalian116000,China)

The present experiment was conducted to evaluate the effects of dietary vitamin E level on growth performance, antioxidant ability and resistance to ammonia nitrogen stress of juvenileMacrobrachiumnipponense. A total of 900 healthy juvenileMacrobrachiumnipponensewith the body weight of (0.119±0.004) g were selected and randomly divided into 6 groups with 3 replicates per group and 50 shrimps per replicate. Vitamin E acetate was added to basal semi-purified diet at six levels to make diets with the actual content of 18.31, 37.94, 66.07, 120.25, 212.68 and 388.96 mg /kg vitamin E (denoted by VE1, VE2, VE3, VE4, VE5 and VE6 groups, respectively), and feeding for 8 weeks. After the feeding experiment, the prawns were subjected to ammonia nitrogen stress for 24 h. The results showed as follows: 1) the survival rate ofMacrobrachiumnipponensein each group had no significant difference (P>0.05). The weight gain rate showed a trend of firstly increased and then decreased with the dietary vitamin E increasing, and prawns in VE4 group gained the highest value and significantly higher than that in VE1 group (P<0.05). The feed conversion rate had the opposite pattern from the weight gain rate, the lowest value were found in VE4 group and significantly lower than that in VE1 group (P<0.05). 2) Before ammonia nitrogen stress, the maleic dialdehyde (MDA) content in hepatopancreas exhibited a trend of firstly decreased and then increased with dietary vitamin E increasing, the lowest value was found in VE3 group and significantly lower than that in VE1, VE5 and VE6 groups (P<0.05), whereas the activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) and total antioxidant competence (T-AOC) in hepatopancreas exhibited a trend of firstly increased and then decreased with dietary vitamin E increasing. VE1 and VE6 groups gained the higher thioredoxin (Trx) mRNA expression and the lower thioredoxin reductase (TrxR) mRNA expression. The heat shock protein 60 (HSP60) mRNA expression in VE3 group was significantly lower than that in other groups (P<0.05), the heat shock cognate 70 (HSC70) mRNA expression in VE1 group was significantly lower than that in other groups (P<0.05), the heat shock protein 90 (HSP90) mRNA expression in VE1 and VE2 group was significantly higher than that in other groups (P<0.05). 3) After ammonia nitrogen stress, the SOD, CAT and GSH-Px activities, MDA content and the mRNA expressions ofTrx,TrxRandHSC70 ofMacrobrachiumnipponensein each group had the similar pattern with the before stress, but the mRNA expressions ofHSP90 andHSP60 exhibited an opposite trend with the before stress. Ammonia nitrogen stress decreased the GSH-Px activities and T-AOC and the mRNA expressions ofTrxandTrxR, increased MDA content and SOD activity of VE4, VE5 and VE6 groups. In conclusion, the results demonstrate that 120.25 mg/kg of dietary vitamin E increase the growth ofMacrobrachiumnipponense, 66.06, 120.25 and 212.68 mg/kg of dietary vitamin E enhance antioxidant activity and alleviated the toxicity of ammonia nitrogen stress ofMacrobrachiumnipponense.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(8)：2893-2905]

Macrobrachiumnipponense; vitamin E; growth; antioxidant ability; ammonia nitrogen

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.08.034

2017-02-07

浙江省重大科技專項計劃項目(2014C02011)；浙江省自然科學基金項目(LY16C190006)；國家自然科學基金項目(31402308)；湖州市自然科學資金項目(2015YZ06)；浙江省重點研發(fā)計劃項目(2015C03018)

孔有琴(1977—)，女，浙江長興人，講師，博士，主要從事水產動物營養(yǎng)與飼料研究。E-mail： susankuq@zjhu.edu.cn

*通信作者:葉金云，研究員，博士生導師，E-mail: yjy@zjhu.edu.cn

S966.12

A

1006-267X(2017)08-2893-13