肖英平 桂國(guó)弘 陳安國(guó) 何祥祥 李開鋒 楊 華*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州310021；2.浙江省植物有害生物防控省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，杭州310021；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)550025；4.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州310058)

谷氨酰胺對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)氧化應(yīng)激人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞損傷和凋亡的影響

肖英平1,2桂國(guó)弘3陳安國(guó)4何祥祥1,2李開鋒1,2楊 華1,2*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州310021；2.浙江省植物有害生物防控省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，杭州310021；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)550025；4.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州310058)

本試驗(yàn)旨在通過研究谷氨酰胺對(duì)過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞損傷和凋亡的影響，闡明谷氨酰胺的抗氧化效果和作用機(jī)理。HT-29細(xì)胞經(jīng)不同濃度[0(對(duì)照組)、0.5、2.0、10.0 mmol/L]谷氨酰胺和0.35 mmol/L H2O2分別處理12、24、32 h后，測(cè)定細(xì)胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量，并采用熒光定量PCR方法分析谷氨酰胺對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，以及采用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶雙染法對(duì)HT-29細(xì)胞染色，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明：1)處理24 h后，0.5、2.0 mmol/L Gln組SOD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；處理32 h后，0.5、2.0 mmol/L Gln組SOD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，MDA含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。2)處理12 h后，各組天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)和B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較，0.5 mmol/L Gln組核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，0.5與2.0 mmol/L Gln組B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。處理24 h后，與對(duì)照組比較，0.5、2.0和10.0 mmol/L Gln組Caspase-3、NF-κB和BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。處理32 h后，與對(duì)照組比較，2.0 mmol/L Gln組細(xì)胞表面誘導(dǎo)凋亡分子(FAS)、Caspase-3、NF-κB、BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；10.0 mmol/L Gln組FAS、Caspase-3、NF-κB、BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)。3)處理24 h后，與對(duì)照組比較，Gln處理使活細(xì)胞數(shù)量提高了5.32%～11.97%，壞死細(xì)胞數(shù)量降低了6.75%～12.66%。處理32 h后，與對(duì)照組比較，Gln處理使活細(xì)胞數(shù)量提高了1.39%～7.63%，壞死細(xì)胞數(shù)量降低了3.40%～4.57%。由此可見，谷氨酰胺可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低H2O2誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞凋亡。

谷氨酰胺；氧化損傷；細(xì)胞凋亡；HT-29細(xì)胞；過氧化氫

谷氨酰胺(glutamine，Gln)是一種條件性必需氨基酸，可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，在腸道上皮中作為生物活性物質(zhì)，扮演信號(hào)分子的角色并調(diào)控信號(hào)通路，在保持腸道結(jié)構(gòu)完整性和阻止腸腔有害微生物進(jìn)行系統(tǒng)循環(huán)中起重要的調(diào)節(jié)作用[1]。Hubert-Buron等[2]研究報(bào)道，Gln可通過限制抑制因子Bα(IκBα)水解降低腸道細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。閆靜等[3]研究表明，Gln對(duì)化學(xué)性肝損傷的治療作用不僅與其抗氧化、抗炎癥反應(yīng)有關(guān)，還可能通過改善腸道功能間接減輕肝損傷。鄭善軍等[4]用掃描電鏡觀察Gln對(duì)輻射損傷的大鼠腸面膜的保護(hù)作用，結(jié)果表明輻射組絨毛雜亂、窄小，排列無(wú)規(guī)律，絨毛頂端有明顯潰爛，發(fā)生潰瘍的絨毛數(shù)目較多；而補(bǔ)充Gln組動(dòng)物腸黏膜絨毛寬大、鈍圓，接近正常對(duì)照組的形態(tài)，排列整齊，絨毛頂端形成細(xì)小潰瘍，但潰瘍發(fā)生不普遍。

氧化應(yīng)激是指由于機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，導(dǎo)致產(chǎn)生對(duì)自身有負(fù)面作用的、具有氧化活性的中間產(chǎn)物，造成細(xì)胞損傷，引起機(jī)體衰老，甚至腫瘤等惡性疾病?；钚匝醮刈鳛榧?xì)胞死亡途徑的信號(hào)分子，通過線粒體釋放促凋亡分子、激活天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并參與凋亡過程的調(diào)節(jié)。目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡途徑主要包括2種：1)胞外信號(hào)激活胞內(nèi)凋亡酶Caspase家族；2)線粒體釋放凋亡酶激活因子，從而激活Caspase家族，活化的Caspase可將胞內(nèi)重要蛋白降解，從而引起細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激能使腸細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或死亡，Gln能抑制小腸黏膜細(xì)胞死亡[5]。Evans等[6]的研究表明，Gln能劑量依賴地抑制大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，并且Gln抑制細(xì)胞凋亡的作用是特異性的，而谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Cly)均無(wú)此功能。過氧化氫(H2O2)能夠氧化哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使其產(chǎn)生具損傷細(xì)胞的氧自由基[7]。自由基會(huì)攻擊DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響細(xì)胞正常功能，最終可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。有研究顯示，0.5、2.0和5.0 mmol/L Gln可顯著降低H2O2引發(fā)的豬小腸上皮細(xì)胞(intestinal porcine epithelial cells,IPEC-1)凋亡，其死亡細(xì)胞數(shù)量分別下降了14.2%、54.4%和95.4%[9]。因此，本試驗(yàn)旨在通過研究Gln對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞抗氧化功能、細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)以及細(xì)胞凋亡狀況，驗(yàn)證Gln是否具有抗氧化功能，并闡明其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

HT-29細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(含4 500 mg/LD-葡萄糖和110 mg/L丙酮酸鈉，不含L-Gln)、0.25%胰酶細(xì)胞消化液、Gln和胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司(美國(guó))；Trizol試劑、瓊脂糖、逆轉(zhuǎn)錄酶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司(TaKaRa，日本)；丙二醛(malondiadehyde，MDA)含量、氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所；細(xì)胞培養(yǎng)六孔板(Corning，美國(guó))、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate)/碘化丙啶(propidium iodide)雙重?zé)晒馊玖系蛲鰴z測(cè)試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HT-29細(xì)胞用含10%熱滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)貼壁培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至培養(yǎng)瓶底面積80%之后傳代，全部試驗(yàn)均用指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 Gln和H2O2處理HT-29細(xì)胞

將HT-29細(xì)胞傳代培養(yǎng)在六孔板上，待HT-29細(xì)胞的覆蓋率達(dá)到80%，吸干原培養(yǎng)基，加入無(wú)Gln的DMEM培養(yǎng)基后培養(yǎng)24 h，分別加入Gln和H2O2處理細(xì)胞，使得Gln的終濃度分別為0(對(duì)照組)、0.5、2.0、10.0 mmol/L；各組H2O2終濃度均為0.35 mmol/L。分別處理12、24、32 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)的試驗(yàn)分析。

1.4 MDA含量和SOD活性測(cè)定

1.4.1 裂解細(xì)胞

HT-29細(xì)胞經(jīng)過Gln和H2O2分別處理12、24、32 h后，棄培養(yǎng)基，用4 ℃預(yù)冷生理鹽水漂洗3遍后，加入0.3 mL預(yù)冷生理鹽水，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下并轉(zhuǎn)移入2.0 mL EP管，加入0.2 mL生理鹽水漂洗。將EP管置于冰水混合液中于超聲粉碎儀上以10 s/次間隔10 s的頻率反復(fù)破碎3次。4 ℃、5 000 r/min離心10 min，吸取上清液備測(cè)。

1.4.2 MDA含量測(cè)定

MDA含量的測(cè)定原理為：過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大峰值。具體操作參照試劑盒說明書。

1.4.3 SOD活性測(cè)定

SOD活性的測(cè)定原理為：通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者與氧化羥胺作用形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽含量減少，比色測(cè)定管的吸光度低于對(duì)照管，通過計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD活性。具體操作參照試劑盒說明書。

1.5 總RNA提取和cDNA的制備

采用Trizol法[10]提取總RNA，使用SuperScriptTMⅡ RTase反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。

1.6 熒光定量PCR

1.6.1 引物設(shè)計(jì)和合成

采用Primer Premier 6.0和Beacon designer軟件設(shè)計(jì)熒光引物，由上海生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成，目標(biāo)基因[細(xì)胞表面誘導(dǎo)凋亡分子(FAS)、Caspase-3、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)和B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)]和18S rRNA的引物參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)基因和18S rRNA的引物參數(shù)

1.6.2 熒光定量PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件

1.7 流式細(xì)胞儀分析

使用Annexin V-FITC和PI對(duì)HT-29細(xì)胞進(jìn)行雙染，然后使用流式細(xì)胞儀，分別通過FITC和PI的放射波長(zhǎng)530和585 nm進(jìn)行檢測(cè)分析。采用雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖進(jìn)行檢測(cè)分析，左下象限代表活細(xì)胞(FITC-/PI-)；左上象限為壞死細(xì)胞(FITC-/PI+)；右下象限為早期凋亡細(xì)胞(FITC+/PI-)；右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞(FITC+/PI+)。所以細(xì)胞的總凋亡率是右上象限(FITC+/PI+)和右下象限(FITC+/PI-)之和[11]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著性水平。

2 結(jié) 果

2.1 Gln對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化狀態(tài)改變的影響

由圖1可知，處理12 h后，各組間SOD活性和MDA含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。處理24 h后，對(duì)照組SOD活性顯著低于0.5、2.0 mmol/L Gln組(P<0.05)，各組間MDA含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。處理32 h后，0.5、2.0和10.0 mmol/L Gln組SOD活性與對(duì)照組比較，分別升高了46.40%(P<0.05)、67.99%(P<0.05)和19.71%(P>0.05)；與之對(duì)應(yīng)的是MDA含量分別減少了17.79%(P<0.05)、37.66%(P<0.05)和13.09%(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖2同。

Value columns with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Fig.2.

圖1 Gln對(duì)H2O2處理的HT-29細(xì)胞SOD活性(A)和MDA含量(B)的影響

Fig.1 Effects of Gln on SOD activity (A) and MDA content in H2O2-treated HT-29 cell (n=3)

2.2 Gln對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖2可知，用0.35 mmol/L H2O2處理HT-29細(xì)胞，在12、24和32 h 3個(gè)時(shí)間段，促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因FAS、Caspase-3、NF-κB、BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量相一致，均為先降低后升高；而抑制細(xì)胞凋亡的基因Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量則相反，為先升高后降低。

處理12 h后，各組的Caspase-3和BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較，0.5 mmol/L Gln組NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，0.5與2.0 mmol/L Gln組Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。

處理24 h后，與對(duì)照組比較，0.5、2.0和10.0 mmol/L Gln組Caspase-3、NF-κB和BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量均能顯著降低(P<0.05)。2 mmol/L Gln組FAS和Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別比對(duì)照組降低了62.27%和71.13%(P<0.05)，0.5 mmol/L Gln組NF-κB和BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量分別比對(duì)照組降低了64.85%和65.05%(P<0.05)，10.0 mmol/L Gln組FASmRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。0.5、2.0和10.0 mmol/L Gln組Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在較對(duì)照組分別升高了1 404.65%、1 559.21%和623.76%(P<0.05)。

處理32 h后，與對(duì)照組比較，2.0 mmol/L Gln組FAS、Caspase-3、NF-κB、BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量分別降低了63.55%、45.11%、41.49%和30.22%(P<0.05)，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高了44.30%(P<0.05)。與對(duì)照組比較，10.0 mmol/L Gln組FAS、Caspase-3、NF-κB、BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量分別增加了31.78%、25.83%、34.77%和20.35%(P<0.05)，Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡情況

采用Annexin V-FITC/PI雙染法對(duì)細(xì)胞染色，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。由圖3可知，處理24 h后，對(duì)照組和0.5、2.0、10.0 mmol/L Gln組活細(xì)胞數(shù)量分別為71.37%、76.69%、83.34%和78.30%，壞死細(xì)胞數(shù)量分別為12.78%、6.03%、0.12%和1.31%。Gln處理使活細(xì)胞數(shù)量提高了5.32%～11.97%，壞死細(xì)胞數(shù)量降低了6.75%～12.66%。

由圖4可知，處理32 h后，對(duì)照組和0.5、2.0、10.0 mmol/L Gln組活細(xì)胞數(shù)量分別為61.73%、66.70%、70.36%和63.12%，壞死細(xì)胞數(shù)量分別為21.61%、17.57%、17.04%和18.21%。Gln處理使活細(xì)胞數(shù)量提高了1.39%～7.63%，壞死細(xì)胞數(shù)量降低了3.40%～4.57%。

圖2 Gln對(duì)H2O2處理的HT-29細(xì)胞FAS(A)、Caspase-3(B)、NF-κB(C)、Bax(D)和Bcl-2(E) mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，可通過MDA含量了解膜脂過氧化的程度，以間接反映膜系統(tǒng)受損程度；而SOD在清除自由基、抗氧化損傷和維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)方面都起著很重要的作用。在本研究中，我們采用H2O2刺激HT-29細(xì)胞，建立氧化損傷模型，發(fā)現(xiàn)Gln可以提高HT-29細(xì)胞SOD活性；H2O2誘導(dǎo)的對(duì)照組脂質(zhì)過氧產(chǎn)物MDA含量較高，0.5和2.0 mmol/L Gln處理細(xì)胞可以顯著地降低MDA含量，表明Gln可提高抗氧化作用而改善氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞膜通透性的增加，從而對(duì)細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用[12]。

細(xì)胞凋亡相關(guān)基因FAS、Caspase-3、NF-κB、Bax和抑制細(xì)胞凋亡基因Bcl-2互為拮抗，在氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[6-7]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，0.5和2.0 mmol/L Gln可以降低H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激HT-29細(xì)胞FAS、Caspase-3、NF-κB和BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量，而提高Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。Haynes等[13]指出，由于Gln的化學(xué)特性不能直接改變H2O2的存在形式，且腸道細(xì)胞的凋亡并不是接觸H2O2開始，而是需要一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間(例如12 h)來影響基因表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)。因?yàn)镠2O2擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞是有限的，其經(jīng)由水通道蛋白同系物穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞[14]。已有研究報(bào)道H2O2是通過激活氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子Caspase-3和NF-κB誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。Caspase-3是其家族中最重要的一員，處于細(xì)胞凋亡的共同路徑上，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者之一。正常情況下，Caspase-3在胞質(zhì)中以無(wú)活性的酶原形式存在，只有當(dāng)細(xì)胞外凋亡信號(hào)使之激活為有活性的Caspase-3時(shí)，才引起細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞構(gòu)架的關(guān)鍵蛋白酶失活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞內(nèi)，H2O2激活FAS基因和提高細(xì)胞色素C從線粒體中的釋放，這導(dǎo)致通過Caspase-8和Caspase-9途徑激活Caspase-3，而Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞DNA片段化[16]。此外，H2O2激活NF-κB，增加“死亡”相關(guān)基因表達(dá)，抑制了“存活”相關(guān)基因表達(dá)[17]。Bcl-2及其同系物可阻止線粒體膜損傷和細(xì)胞色素C等促凋亡因子的釋放，但Bax作用正好相反，促進(jìn)線粒體膜損傷和細(xì)胞色素C的釋放，Bcl-2/Bax比例通常是反映細(xì)胞程序性死亡的標(biāo)準(zhǔn)[18]。我們的研究結(jié)果得出，Gln增加氧化應(yīng)激狀態(tài)下HT-29細(xì)胞Bcl-2/Bax比例，說明Gln可以通過線粒體途徑抑

制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前，Gln促進(jìn)Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)機(jī)制可能與Gln增加線粒體膜的穩(wěn)定性有關(guān)，也可能通過誘導(dǎo)熱休克蛋白70 (HSP70)的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)[19]。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H2O2和Gln與HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)32 h后，高濃度(10 mmol/L)Gln促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)應(yīng)激的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，F(xiàn)AS、Caspase-3、NF-κB、BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量分別比對(duì)照組增加了31.78%、25.83%、34.77%和20.35%，且流式細(xì)胞儀分析也得到相一致的結(jié)果，即凋亡細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組接近，多于0.5和2.0 mmol/L Gln組。說明Gln抑制細(xì)胞凋亡存在一定的濃度依賴性。在一定的濃度范圍內(nèi)，Gln可有效地抑制由氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡，而超過一定濃度范圍，細(xì)胞凋亡率與Gln濃度變化無(wú)直接線性關(guān)系，這與前人的研究結(jié)果[20-21]相一致。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是Gln通過谷氨酰胺酶反應(yīng)生成谷氨酸和氨(NH3)[13]，而在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，Gln濃度高的情況下，培養(yǎng)基中NH3濃度較高，高濃度NH3對(duì)細(xì)胞具有損傷作用。

UL：壞死細(xì)胞；UR：晚期凋亡細(xì)胞；LL：活細(xì)胞；LR：早期凋亡細(xì)胞。下圖同。

UL: necrotic cells; UR: late apoptotic cells; LL: living cells; LR: early apoptotic cells. The same as below.

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)24 h Gln對(duì)H2O2處理的HT-29細(xì)胞凋亡的影響

Fig.3 Effects of Gln on apoptosis with Annexin V-FITC/PI staining method in H2O2-treated HT-29 cell at 24 h

圖4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)32 h Gln對(duì)H2O2處理的HT-29細(xì)胞凋亡的影響

4 結(jié) 論

Gln可以有效提高H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激HT-29細(xì)胞SOD活性，降低MDA含量，降低氧化應(yīng)激狀態(tài)HT-29細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞凋亡基因FAS、Caspase-3、NF-κB和Bax表達(dá)，而提高抑制細(xì)胞凋亡基因Bcl-2表達(dá)，減少細(xì)胞氧化損傷和凋亡。

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*Corresponding author, senior livestock engineer, E-mail: yanghua806@hotmail.com

(責(zé)任編輯 武海龍)

Effects of Glutamine on Oxidative Damage and Apoptosis of Human Enterocyte-Like HT-29 Cells Induced by Hydrogen Peroxide

XIAO Yingping1,2GUI Guohong3CHEN Anguo4HE Xiangxiang1,2LI Kaifeng1,2YANG Hua1,2*

(1.InstituteofQualityandStandardforAgro-Products,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021,China; 2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021,China; 3.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China; 4.CollegeofAnimalSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

This experiment was conducted to study effects of glutamine (Gln) on oxidative damage and apoptosis of human enterocyte-like HT-29 cells induced by hydrogen peroxide (H2O2), and to explore the antioxidant function of Gln and its mechanisms. HT-29 cells I were induced by different concentrations [0 (control group), 0.5, 2.0 and 10.0 mmol/L] Gln and 0.35 mmol/L H2O2for 12, 24 and 32 h, the superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content in cells were measured, and the mRNA relative expression of related to cell apoptosis gene were also assessed by RT-qPCR. Furthermore, the HT-29 cells were dyed with the Annexin V-FITC/PI double staining method, and the apoptosis of cells was determined by the flow cytometer. The results showed as follows: 1) after treated 24 h, the SOD activity in 0.5 and 2.0 mmol/L Gln groups was significantly higher than that in control group (P<0.05); after treated 32 h, the SOD activity in 0.5 and 2.0 mmol/L Gln groups was significantly higher than that in control group (P<0.05), and the MDA content was significantly lower than that in control group (P<0.05). 2) After treated 12 h, there were no significant differences on the mRNA relative expressions of cysteinyl aspartate specific proteinase-3 (Caspase-3) and B cell lymphoma/leukemia-2 associated X protein (Bax) among all groups (P>0.05). Compared with the control group, the mRNA relative expression of nuclear factor kappa B (NF-κB) in 0.5 mmol/L Gln group was significantly decreased (P<0.05), the mRNA relative expression of B cell lymphoma/leukemia-2 (Bcl-2) in 0.5 and 2.0 mmol/L Gln groups was significantly increased (P<0.05). After treated 24 h, compared with the control group, the mRNA relative expressions ofCaspase-3,NF-κBandBaxin 0.5, 2.0 and 10.0 mmol/L Gln groups were significantly decreased (P<0.05), while the mRNA relative expression ofBcl-2 was significantly increased (P<0.05). After treated 32 h, compared with the control group, the mRNA relative expressions ofFAS,Caspase-3,NF-κBandBaxin 2.0 mmol/L Gln group were significantly decreased (P<0.05), while the mRNA relative expression ofBcl-2 was significantly increased (P<0.05); the mRNA relative expressions ofFAS,Caspase-3,NF-κBandBaxin 10.0 mmol/L Gln group were significantly decreased (P<0.05). 3) After treated 24 h, compared with the control group, the living cells number in Gln groups increased by 5.32% to 11.97%, and the necrotic cells number decreased by 6.75% to 12.66%. After treated 32 h, compared with the control group, the living cells number in Gln groups increased by 1.39% to 7.63%, and the necrotic cells number decreased by 3.40% to 4.57%. It is concluded that glutamine can restrain the oxidant damage of HT-29 induced by H2O2and decrease the cells apoptosis.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(8)：2734-2742]

glutamine; oxidative damage; cell apoptosis; HT-29 cell; hydrogen peroxide

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.08.016

2017-02-01

國(guó)家自然科學(xué)基金(31402083)；浙江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(LZ15C170001)

肖英平(1984—)，男，江西興國(guó)人，助理研究員，博士，研究方向?yàn)閱挝竸?dòng)物營(yíng)養(yǎng)。E-mail: ypxiaozju@126.com

*通信作者:楊 華，高級(jí)畜牧師，碩士生導(dǎo)師，E-mail: yanghua806@hotmail.com

S811.3

A

1006-267X(2017)08-2734-09