陰云伙 陳云鳳 徐曉明

摘要[目的]研究R318的抗褐飛虱特性與育種利用。[方法]以TN1、RHT、B5為對照，對R318及其衍生品系進行褐飛虱田間抗蟲鑒定，用抗性基因Bph15引物MS5對R318及其衍生品系進行分子檢測。[結(jié)果]田間鑒定R318對褐飛虱表現(xiàn)為抗，其衍生品系表現(xiàn)為中抗-感蟲；分子檢測R318及其衍生品系與B5具有一致的帶型。[結(jié)論]R318含有的抗性基因可能是Bph15。

關(guān)鍵詞 R318；褐飛虱；抗性基因；分子標記輔助選擇；Bph15

中圖分類號 S503 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）03-0157-02

Abstract[Objective]Characteristics of resistance to brown planthopper and breeding utilization of R318 were studied.[Method]With TN1，RHT and B5 as control， resistances to brown planthopper in field of the R318 and its derived strains were identified. Molecular detection of R318 and its derived strains was done by primer MS5 of resistance gene Bph15. [Result] R318 was manifested as resistance to brown planthopper by field identification， its derived strains were manifested as medium resistancesusceptibility to brown planthopper. R318 and its derived strains have indistinguishable fingerprinting patterns with B5 by molecular identification.[Conclusion]It is considered R318 and its derived strains may contain resistance genes Bph15.

Key words R318；Brown planthopper；Resistance gene；Markerassisted selection；Bph15

稻飛虱是嚴重為害水稻的害蟲之一，抗飛虱品種培育是控制稻飛虱危害最經(jīng)濟和環(huán)境友好的途徑，而篩選與鑒定稻飛虱抗源是抗性育種的基礎(chǔ)與關(guān)鍵[1]。目前鑒定的抗源大多數(shù)為野生稻或印度次大陸及東南亞的農(nóng)家種，綜合農(nóng)藝性狀較差，較難一步到位進行利用[2]。從推廣品種中尋找綜合性狀、抗性均較好的材料并結(jié)合分子標記輔助選擇進行抗性改良，具有較好的實踐價值。

R318是1990年前后從湖南雜交水稻工程技術(shù)中心郭名奇老師處引進的恢復系，系譜不詳（羅利軍等認為可能來自輪回422/選10-19[3-4]）。利用該材料與安湘S配組的兩系雜交水稻安兩優(yōu)318分別通過國家（國審稻2003058）及江西省（贛審稻2001020）審定，國家區(qū)試鑒定中抗褐飛虱（3級）、中抗白背飛虱（3～5級）、對灰飛虱表現(xiàn)中抗至抗（3級）；相關(guān)專家現(xiàn)場鑒定意見為安兩優(yōu)318中抗稻飛虱[4-5]。該品種大面積推廣應用20余年來，其抗性至今仍沒有喪失，但R318中所含抗性基因少見報道。筆者在利用分子標記輔助選擇技術(shù)檢測B5抗性基因Bph15時發(fā)現(xiàn)，SSR引物MS5對R318同樣具有多態(tài)性。該試驗用R318及其衍生品種（品系）進行PCR檢測，對通過常規(guī)育種選育并經(jīng)生產(chǎn)檢驗的R318抗褐飛虱衍生品種（品系）進行驗證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

R318、R233、R236（R233、R236均為R318/抗占雜交后代，結(jié)合MAS方法選育而成），感蟲對照TN1、高抗對照RHT（華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室提供），B5（武漢大學選育，含抗性基因Bph14、Bph15）。

1.2 抗蟲鑒定方法

1.2.1 水稻苗期抗蟲鑒定。

苗期鑒定采用苗期集團篩選法，各水稻品種（系）種子播于溫室特制水泥池中的鑒定圃內(nèi)，每個鑒定圃放置18個小型塑料缽，形成1個小區(qū)，共設3個小區(qū)，每個小區(qū)內(nèi)播待測品種（系），每個塑料缽內(nèi)保留約30根秧苗。在秧苗2葉1心期時每苗接入1～2齡褐飛虱若蟲8～10頭，小區(qū)用特制尼龍網(wǎng)罩罩住。水稻品系抗褐飛虱評價標準參照劉光杰等[6]的方法，當感蟲品種TN1死苗率達70%時，逐日記載各品系死苗數(shù)，至TN1全部枯死時評定各品系抗性級別?？剐栽u級分5個等級：1級，高抗；3級，抗；5級，中抗；7級，感；9級，高感。3個品系（R318、R233、R236）同時送中國水稻研究所稻作研究中心進行抗蟲鑒定。

1.2.2 水稻成株期抗蟲鑒定。

將待測品種（系）催芽播種后，分別移栽在試驗大田和特制水泥池中，每品種（系）1行10株（行長50 cm、行距10 cm、株距5 cm），重復3次，隨機排列，每隔10行種1行感蟲品種TN1、1行抗蟲品種RHT。50 d左右苗齡時每叢接田間采集繁殖的2～3齡褐飛虱若蟲3～4頭，讓其取食繁殖。待感蟲品種TN1成株初期基部有大量褐飛虱時開始調(diào)查、記錄各品種（系）基部感蟲情況，每隔7 d調(diào)查1次，同時拍下照片；80 d左右成株中期時，觀察記載水稻基部褐飛虱產(chǎn)卵量，同時拍下照片。根據(jù)稻株感蟲量、褐飛虱產(chǎn)卵量情況記載，綜合圖片來比較感蟲量，評定級別分為大量、較多、一般、少量、無。

1.2.3

水稻成熟期抗蟲鑒定。

成熟期抗蟲鑒定是在成株期鑒定的基礎(chǔ)上進行后續(xù)測定的，待測品種（系）成熟后，觀察各品種（系）葉片、稻穗成熟度、基部受害情況等，綜合評定其受害級別。

1.3 分子標記輔助選擇

Bph15引物MS5可以用來對R318的主效抗性基因進行檢測和分子標記輔助選擇，引物序列為F：5′-TTGTGGGTCCTCATCTCCTC-3′；R：5′-TGACAACTTTGTGCAAGATCAAA-3′。以R318為母本，抗占為父本雜交，利用抗性基因Bph15引物標記MS5，檢測雜交后代抗性基因Bph15，選育抗褐飛虱新恢復系。

1.4 DNA提取和PCR擴增

抽提水稻 DNA 的方法是由CTAB 法改良而來。PCR總反應體系為10.0 μL，包括DNA模板1.0 μL，dNTP（2.0 mmol/L）1.0 μL，Primer F（10.0 μmol/L）0.2 μL，Primer R （10.0 μmol/L）0.2 μL，Taq聚合酶0.5 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，ddH2O 5.1 μL。PCR反應程序為94 ℃4 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，30個循環(huán)；72 ℃5 min。擴增結(jié)束后采用4%聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳進行分離，銀染顯色，讀取結(jié)果后拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性基因檢測結(jié)果

用抗性基因Bph15引物MS5對B5和R318進行分子檢測發(fā)現(xiàn)，R318與B5有一致的帶型，據(jù)此推測R318可能含有抗褐飛虱主效基因Bph15。

2.2 抗褐飛虱恢復系選育

利用Bph15引物MS5對R318和抗占進行多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)，2個材料之間存在多態(tài)性（圖1），引物MS5可以用于對R318和抗占雜交后代中抗性基因Bph15的檢測。

2013年正季用R318與抗占雜交，當年冬在海南種植F1，并混收種子；2014年正季種植F2群體，根據(jù)田間綜合性狀選擇50個優(yōu)良株系，提取所選單株DNA，利用標記MS5進行檢測篩選，淘汰不含Bph15的單株。保留單株加代，結(jié)合田間自然誘發(fā)表現(xiàn)，最后選擇含有標記MS5、田間代號為N233、N236的2個株系，分別命名為R233、R236。

2.3 接蟲鑒定結(jié)果

由表1可知，在苗期，R318、R233抗性與對照RHT均為1級，屬于高抗級，感蟲品種TN1為9級，高感。水泥池及大田中，B5與RHT表現(xiàn)高抗，沒有染蟲和受害，而R318有少量染蟲但沒有受害，R233和R236有少量染蟲并有輕微受害。

表2為委托中國水稻研究所稻作研究中心鑒定結(jié)果。R318表現(xiàn)為抗蟲，抗性等級為3級，低于RHT；R233受害級別5.0～9.0級，平均7.3級；R236受害級別7.0～9.0級，平均7.6級，R233與R236表現(xiàn)中抗-感蟲水平。

3 討論

（1）用目前開發(fā)出來的抗褐飛虱基因連鎖標記引物對R318進行分析，只有抗性基因Bph15引物MS5具有多態(tài)性，表明R318可能含有該抗性基因，目前正在通過轉(zhuǎn)基因等試驗手段進一步驗證該推論。

（2）一般來說，單個抗性基因的品種抗性容易喪失，被新的生物型所危害，如IR26僅推廣2年就喪失了抗性，而IR36的抗性也僅維持了8年[7]。R318所配的兩系雜交組合安兩優(yōu)318對褐飛虱一直保持抗性，尤其在江西寧都地區(qū)，當?shù)剞r(nóng)民持續(xù)種植近20年，一直沒有產(chǎn)生過危害。國家區(qū)試鑒定安兩優(yōu)318中抗白背飛虱、灰飛虱，說明R318除含有主效抗性基因以外，還有其他微效基因共同作用。

（3）田間實際調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當抗性品種與非抗品種種植在一起（或相連田塊）時，褐飛虱先為害非抗品種，但當非抗品種“穿頂”、稻稈失水干枯后，褐飛虱就向四周擴散，蔓延到抗性品種田塊，如果不加防治抗性品種也會受危害。因此通過田間自然誘發(fā)選擇甚至室內(nèi)接蟲鑒定，鑒定時期與經(jīng)驗都非常重要，不同地點、不同人員所得出的結(jié)果可能會不一致，而分子標記輔助選擇可以避免人為誤差。

（4）目前育種引用抗源多為野生稻或野生稻初步改良品系，對一般育種者而言直接應用較困難，R318則是推廣品種通過雜交選育而成，本身就是一個優(yōu)良恢復系，農(nóng)藝性狀好、配合力高，結(jié)合分子標記輔助選育手段，可以較快將其抗性基因?qū)氘斍爸髟云贩N中，提高抗性基因的利用效率，加快抗性改良步伐。

參考文獻

[1] 程攀，陳龍，曲姍姍，等.抗褐飛虱水稻品種選育研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2015，43（24）：92-94，103.

[2] 曾生元，龔紅兵，李闖，等.鎮(zhèn)秈232的抗飛虱特性與育種利用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，29（3）：676-678.

[3] 羅利軍，應存山，閔紹楷，等.水稻中413的廣親恢性及其系列組合[J].中國水稻科學，1994，8（4）：193-199.

[4] 陳隆添，曾俊，李惠英.抗稻飛虱兩系雜交稻安兩優(yōu)318的選育及其應用前景[J].種子科技，2009（9）：27-28.

[5] 陳隆添，楊立生，郭柏生，等.高產(chǎn)兩系雜交稻新組合安兩優(yōu)318[J].雜交水稻，2004，19（4）：72-73.

[6] 劉光杰，付志紅，沈君輝，等.水稻品種對稻飛虱抗性鑒定方法的比較研究[J].中國水稻科學，2002，16（1）：52-56.

[7] 王慧，嚴志，陳金節(jié)，等.水稻抗褐飛虱基因研究進展與展望[J].雜交水稻，2016，31（4）：1-5.