孟春雨 曾永昶 林玉惠

摘要[目的]抑制大豆分離蛋白（SPI）中的美拉德反應(yīng)，提高產(chǎn)品穩(wěn)定性。[方法]向SPI-葡萄糖混合體系中添加不同量的L-半胱氨酸、槲皮素，通過(guò)測(cè)定溶解度、紫外和熒光吸收來(lái)判定各添加劑對(duì)蛋白溶解性下降和美拉德反應(yīng)的抑制作用。[結(jié)果]添加1%的L-半胱氨酸能明顯改善SPI溶解度下降和美拉德反應(yīng)的問(wèn)題，而槲皮素未能提高該體系的貯藏穩(wěn)定性。[結(jié)論]該研究為SPI貯藏穩(wěn)定性的有效控制提供了途徑。

關(guān)鍵詞 大豆分離蛋白；L-半胱氨酸；槲皮素；穩(wěn)定性；溶解性

中圖分類(lèi)號(hào) TS201.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）03-0083-03

Abstract[Objective] This research was performed in order to inhibit the Maillard reaction and improve the storage stability of soybean protein isolate （SPI）. [Method]Different amounts of Lcysteine and quercetin were added into SPI to investigate their effects on the solubility and Maillard reaction of protein by determining its solubility， UV and fluorescence absorbance. [Result]1%Lcysteine inhibited the solubility decrease and Maillard reaction of SPI during storage， while quercetin had no inhibitive effect on them. [Conclusion] This result provided one effective control method to the storage stability of SPI.

Key words Soy protein isolate （SPI）；Lcysteine；Quercetin；Stability；Solubility

大豆分離蛋白（SPI）是一種在食品工業(yè)中非常重要的植物蛋白產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)90%以上，且消化利用率較高，可達(dá)93%～97%；含有8種人體必需氨基酸，且某些氨基酸含量超過(guò)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）所推薦標(biāo)準(zhǔn)。SPI的主要組成元素為C、H、O、N、S、P，其氨基酸組成有甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、脯氨酸、賴氨酸和色氨酸等，同時(shí)還含有大量人體必需脂肪酸、磷脂，豐富的鈣、磷等礦物質(zhì)，而且不含膽固醇，有益于人體健康，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1-2]。SPI已被廣泛應(yīng)用于食品及其他行業(yè)中，可用于改善肉制品凝膠性，提高冰淇淋產(chǎn)品的膨脹率，還可用于改善面制品中小麥粉的加工性能，提高小麥粉的蒸煮品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等。

SPI在常溫貯藏中溶解性質(zhì)下降顯著，嚴(yán)重影響了其工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，但目前尚無(wú)很好的解決方法。研究證明，蛋白在固態(tài)下會(huì)發(fā)生物理變化和化學(xué)變化。物理變化有變性、非共價(jià)聚集、沉淀；化學(xué)變化包括共價(jià)聚集、去酰化、氧化、美拉德反應(yīng)等[3]。Davies等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在不同的溫度和水分活度下貯藏，SPI發(fā)生了褐變。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SPI中的染料木素是造成非酶褐變的重要反應(yīng)物之一，暗示SPI的長(zhǎng)期貯藏會(huì)導(dǎo)致染料木素的損失。所以針對(duì)蛋白在固態(tài)下的品質(zhì)損失，人們可使用相應(yīng)的抑制劑來(lái)阻斷其中某種或某幾種途徑的進(jìn)行。

筆者以葡萄糖和SPI的混合物為模擬體系，研究L-半胱氨酸和槲皮素對(duì)固態(tài)SPI結(jié)構(gòu)和功能性的影響，并進(jìn)一步探討造成功能性下降的內(nèi)在原因，以及相應(yīng)的控制方法，以期為提高SPI貯藏穩(wěn)定性和延長(zhǎng)產(chǎn)品貯藏期提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

低溫脫脂豆粕，蛋白質(zhì)含量46.96%，水分6.67%，秦皇島金海糧油集團(tuán)；槲皮素，美國(guó)Sigma公司；其他試劑（AR），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

主要設(shè)備：

機(jī)械攪拌器、磁力攪拌器，廣州儀科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；650-60型熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI公司；UV-2800H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SPI的提取工藝。

脫脂豆粉粉碎過(guò)80目篩，豆粉與水1∶8（W/V），用3 mol/L NaOH調(diào)pH至7.8，50 ℃攪拌45 min，離心10 min（6 527 r/min，4 ℃），取上清液。用3 mol/L HCl將上清液pH調(diào)至4.5，40 ℃下攪拌10 min，離心10 min（6 527 r/min，4 ℃），取沉淀。將沉淀復(fù)溶，配制成10%的SPI溶液，調(diào)pH到7.0，均質(zhì)（40 MPa），噴霧干燥（進(jìn)風(fēng)溫度180 ℃，出風(fēng)溫度80 ℃）即得SPI。

1.2.2 SPI的貯藏。

將提取出的SPI進(jìn)行水分調(diào)節(jié)，使其水分含量保持在4%左右，密封于PE袋中，置于37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中避光保存。

1.2.3 溶解度的測(cè)定。

蛋白質(zhì)的溶解度用氮溶解指數(shù)（NSI）表示[5]。將濃度約10 mg/mL的蛋白溶液，在室溫下磁力攪拌1 h，取5 mL樣液用凱式定氮法測(cè)定蛋白含量，即為總蛋白含量。然后離心15 min（6 527 r/min），取上清液5 mL，采用凱式定氮法測(cè)定可溶性蛋白含量。凱式定氮相關(guān)操作參照GB/T 5009.5—2010食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法。

NSI=可溶性蛋白量/總蛋白量×100%

1.2.4 紫外吸收的測(cè)定。

參考Ajandouz等[6]的方法，用去離子水將已知蛋白濃度的樣液稀釋至1 mg/mL，于室溫下在294 nm處使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其紫外吸光值，空白為去離子水。

1.2.5 熒光測(cè)定。

參考Morales等[7]的試驗(yàn)方法，將樣品稀釋至蛋白濃度為1 mg/mL，使用650-60型熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)347 nm、發(fā)射波長(zhǎng)415 nm處（狹縫5 nm）測(cè)定熒光強(qiáng)度，空白為去離子水。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

該試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均為2次重復(fù)3次平行得到的平均值。使用Statistix軟件，采用LSD方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性統(tǒng)計(jì)分析（P≤0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-半胱氨酸對(duì)SPI貯藏穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，在50 ℃下貯藏10 d內(nèi)，各組蛋白的溶解度均有不同程度的降低。0 G-SPI降低了21%，5.00%G-SPI降低25%，0.01%Cys-SPI降低25%，1.00%Cys-SPI降低20%，且添加L-半胱氨酸的蛋白溶解度始終高于0 G-SPI和5.00%G-SPI的溶解度?？梢?jiàn)，L-半胱氨酸對(duì)高糖含量大豆蛋白溶解度的下降有明顯的抑制作用，且抑制程度隨著L-半胱氨酸添加量的增加而增強(qiáng)。

圖2顯示了各組大豆蛋白在294 nm處的紫外吸收強(qiáng)度隨貯藏時(shí)間的變化情況。4組蛋白的吸收強(qiáng)度大體上都呈現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，在前6 d都顯著下降，可能是由于前期蛋白氧化聚集較明顯，蛋白本身的酪氨酸、色氨酸等在280 nm附近與有強(qiáng)吸收的氨基酸發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致294 nm處的吸光強(qiáng)度降低，而6 d以后各組蛋白的紫外吸收又大幅度增大?？梢?jiàn)，294 nm處的紫外吸收也并不是完全由美拉德反應(yīng)決定的，還受蛋白本身內(nèi)源熒光的影響。但就貯藏末期和初期相較而言，0 G-SPI的紫外吸收減小1.4%，5.00%G-SPI增大6.0%，0.01%Cys-SPI增大2.9%，1.00%Cys-SPI增大2.9%，可見(jiàn)L-半胱氨酸還是抑制了在294 nm處有吸收的物質(zhì)的生成。

由圖3可見(jiàn)，各組SPI在λex=347 nm、λem=415 nm處的熒光吸收隨貯藏時(shí)間的變化顯示，熒光強(qiáng)度均在貯藏期間有不同程度的增大。0 G-SPI增大35%，5.00% G-SPI增大50%，0.01% Cys-SPI增大52%，1.00% Cys-SPI增大33%。可見(jiàn)，1.00%的L-半胱氨酸顯著減緩了蛋白熒光吸收的增強(qiáng)，而0.01%的L-半胱氨酸對(duì)其熒光吸收的變化無(wú)明顯作用。由此可見(jiàn)，1.00%的L-半胱氨酸對(duì)美拉德反應(yīng)有明顯的抑制效應(yīng)。Scaman等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在不同pH和溫度的反應(yīng)條件下，L-半胱氨酸都能抑制糖基化反應(yīng)，因?yàn)樗膸€基不論在體內(nèi)還是體外，都能起到類(lèi)似于還原劑的作用，并具有很強(qiáng)的親核性，能截留親電性的化合物和中間體。

2.2 槲皮素對(duì)SPI貯藏穩(wěn)定性的影響

由圖4可以看出，槲皮素的添加并沒(méi)有顯著緩解溶解度降低的趨勢(shì)，除了前2 d略有增大外，整個(gè)貯藏期間依然有明顯下降。這種變化暗示槲皮素在貯藏前期可能對(duì)氧化反應(yīng)起到了一定的抑制效應(yīng)，但在中后期的貯藏過(guò)程中，可能與大分子的蛋白作用不大，因而對(duì)大豆蛋白溶解度沒(méi)有太大影響。

而在294 nm處紫外吸收的變動(dòng)則比較復(fù)雜，由圖5可知，在貯藏前2 d，1.00% Q-SPI的吸收強(qiáng)度有較大增加，然后又顯著減小，再逐漸增大，這種變化可能是由于槲皮素本身與蛋白分子結(jié)合，導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生了一系列變化而引起的。在整個(gè)貯藏期間，0 G-SPI的紫外吸收強(qiáng)度下降了1.4%，5.00% G-SPI上升6.0%，0.01% Q-SPI上升4.4%，0.10% Q-SPI上升7.5%，1.00% Q-SPI上升5.8%，可見(jiàn)槲皮素的添加量不同，對(duì)紫外吸收的影響也不同。

從圖6中的熒光吸收強(qiáng)度來(lái)看，0.10% Q-SPI在貯藏期間熒光強(qiáng)度反倒增大了55%，略高于5.00% G-SPI，0.01% Q-SPI和1.00% Q-SPI的變化則與5.00% G-SPI無(wú)明顯差別?？梢?jiàn)，槲皮素在該體系中并未對(duì)美拉德反應(yīng)表現(xiàn)出抑制作用。可能是由于槲皮素本身水溶性較差，又在低水分體系中，所以其穩(wěn)定性較好，而且槲皮素的分子大小與蛋白懸殊較大，因而其作用機(jī)制也與之前的研究有較大差別，所以在該體系中槲皮素未能有效抑制美拉德反應(yīng)。

3 結(jié)論

L-半胱氨酸是一種具有生理功能的氨基酸，是組成蛋白質(zhì)的20多種氨基酸中唯一具有還原性基團(tuán)巰基（-SH）的氨基酸，通過(guò)改變蛋白質(zhì)分子之間和蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的二硫鍵，減弱了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展開(kāi)來(lái)。

槲皮素是黃酮類(lèi)化合物的一種，具有抑制非酶褐變的效用。Rawel等[9]研究槲皮素與乳清蛋白的相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，槲皮素能有效阻斷蛋白中的賴氨酸、胱氨酸和色氨酸殘基，并且槲皮素能改變蛋白的疏水性，從而導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響其功能性質(zhì)。

該研究發(fā)現(xiàn)，L-半胱氨酸能顯著抑制大豆蛋白溶解度的下降，并對(duì)美拉德反應(yīng)也有顯著的抑制效應(yīng)，同時(shí)也可能存在強(qiáng)還原作用，而槲皮素的添加并沒(méi)有顯著緩解溶解度降低的趨勢(shì)且未能有效抑制美拉德反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

[1] 李玉珍，肖懷秋，蘭立新.大豆分離蛋白功能特性及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)食品添加劑，2008（1）：121-124.

[2] 田琨，管娟，邵正中，等.大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)與性能[J].化學(xué)進(jìn)展，2008，20（4）：565-573.

[3] CHANG L Q，PIKAL M J.Mechanisms of protein stabilization in the solidstate[J].Journal of pharmaceutical science，2009，98（9）：2886-2908.

[4] DAVIES C G A，NETTO F M，GLASSENAP N，et al.Indication of the Maillard reaction during storage of protein isolates[J].Journal of agricultural and food chemistry，1998，46（7）：2485-2489.

[5] WAGNER J R，SORGENTINI D A，AN M C.Relation between solubility and surface hydrophobicity as an indicator of modifications during preparation processes of commercial and laboratoryprepared soy protein isolates[J].Journal of agricultural and food chemistry，2000，48（8）：3159-3165.

[6] AJANDOUZ E H，TSCHIAPE L S，DALLE ORE F，et al.Effects of pH on caramelization and Maillard reaction kinetics in fructoselysine model systems[J].Journal of food science，2006，66（7）：926-931.

[7] MORALES F J，JIMNEZPREZ S.Free radical scavenging capacity of Maillard reaction products as related to colour and fluorescence[J].Food chemistry，2001，72（1）：119-125.

[8] SCAMAN C，NAKAI S，AMINLARI M.Effect of pH，temperature and sodium bisulfite or cysteine on the level of Maillardbased conjugation of lysozyme with dextran，galactomannan and mannan[J].Food chemistry，2006，99（2）：368-380.

[9] RAWEL H M，ROHN S，KROLL J.Influence of a sugar moiety（rhamnosylglucoside）at 3O position on the reactivity of quercetin with whey proteins[J].International journal of biological macromolecules，2003，32（3/4/5）：109-120.