張羽 李小剛 王保軍 王業(yè)文 王俊義

摘要：稻米品質(zhì)與稻米中直鏈淀粉含量（AC）有關(guān)，而直鏈淀粉含量與蠟質(zhì)基因（Wx）的基因型有關(guān)，研究表明Wx基因第一內(nèi)含子的剪接效率決定直鏈淀粉含量。明確陜西省主要水稻種質(zhì)資源中Wx基因的基因型，可為水稻品質(zhì)育種提供依據(jù)。應(yīng)用CAPS法對(duì)112份陜西省水稻主要種質(zhì)資源Wx基因第一內(nèi)含子供體+1位堿基G/T進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)G/T堿基將112份供試材料的Wx基因分為GG、GT、TT等3種基因型。同時(shí)，按國標(biāo)檢測(cè)3種不同G/T型37份稻米的直鏈淀粉含量及其他相關(guān)性狀。結(jié)果顯示，112份供試材料中有1份材料為GG型，約占1%；25份為GT型，占22%；86份材料為TT型，約占77%。說明Wx基因第一內(nèi)含子供體+1位堿基G/T的多態(tài)性與AC含量有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，與堊白粒率和堊白度有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：陜西??；水稻；蠟質(zhì)基因（Wx）；基因型；剪接效率；支鏈淀粉含量；稻米品質(zhì)；育種

中圖分類號(hào)： S511.033文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）11-0059-04[HS）][HT9.SS]

稻米品質(zhì)主要是指稻米的外觀品質(zhì)和蒸煮食用品質(zhì)，其中直鏈淀粉含量、糊化溫度、膠稠度、堊白度等是衡量稻米蒸煮食用品質(zhì)的主要指標(biāo)，而直鏈淀粉含量則是稻米品質(zhì)優(yōu)劣的決定因素[1]。直鏈淀粉含量高的稻米較直鏈淀粉含量低的稻米硬，飯粒松散，脹性好。隨著人們生活水平的提高以及用途和地域的不同，人們對(duì)直鏈淀粉含量的要求也不盡相同，直鏈淀粉含量已經(jīng)成為水稻品質(zhì)育種的一個(gè)重要方面[2-8]。研究發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)基因（Wx）編碼的結(jié)合在淀粉粒上的淀粉合成酶，是水稻中控制直鏈淀粉合成的主要基因，非糯性基因（Wx）對(duì)糯性基因（wx）表現(xiàn)為不完全顯性，存在較為明顯的劑量效應(yīng)，Wx基因序列由于SNP變異產(chǎn)生了一些復(fù)等位基因，如Wxa、Wxb、Wxop 和Wx-mq，其直鏈淀粉含量也因?yàn)镾NP變異導(dǎo)致各不相同，Wxa的直鏈淀粉含量較高，Wxb、Wxop和Wx-mq的直鏈淀粉含量較低。在Wx的分子標(biāo)記研究中，Bligh等報(bào)道利用和Wx基因緊密連鎖的微衛(wèi)星（CT）n標(biāo)記進(jìn)行Wx基因多態(tài)性檢測(cè)[9]。隨著對(duì)水稻蠟質(zhì)基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律的深入研究，表明稻米中直鏈淀粉含量是由該品種蠟質(zhì)基因第一內(nèi)含子的剪接效率決定的，若蠟質(zhì)基因第一內(nèi)含子供體+1位是正常的堿基G，蠟質(zhì)基因第一內(nèi)含子能被正常剪接，水稻胚乳中就能產(chǎn)生較多的蠟質(zhì)基因成熟mRNA，淀粉合成酶的量就較多，胚乳中直鏈淀粉含量就高；反之，蠟質(zhì)基因第一內(nèi)含子供體+1位突變成T后，蠟質(zhì)基因第一內(nèi)含子利用別的剪接位點(diǎn)進(jìn)行剪接，剪接效率低，胚乳中產(chǎn)生的蠟質(zhì)基因成熟mRNA的量較少，淀粉合成酶的量也較少，相應(yīng)的胚乳中直鏈淀粉含量也較低。Ayres等最早根據(jù)Wx基因第一內(nèi)含子供體+1位的這種G/T多態(tài)性，設(shè)計(jì)了PCR-ACCI酶切法，即蠟質(zhì)基因第一內(nèi)含子供體+1位是G時(shí)，它能與旁鄰的堿基構(gòu)成ACCI的酶切識(shí)別序列AGGTATA，使含AGGTATA序列的擴(kuò)增片段能被ACCI酶切，而含AGTTATA序列的不能被ACCI酶切[10]。隨后，很多研究人員對(duì)此結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證和深入研究，充分證明Wx基因第一內(nèi)含子供體+1位G/T多態(tài)性影響稻米直鏈淀粉含量[11-17]。本試驗(yàn)通過CAPS方法對(duì)112份水稻樣品Wx的G/T多態(tài)性進(jìn)行研究，同時(shí)利用國標(biāo)法[18]對(duì)37份不同Wx基因型的米樣測(cè)定其直鏈淀粉含量及相關(guān)性狀，為陜西省稻米品質(zhì)育種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為陜西省水稻研究所提供。

1.2方法

1.2.1基因組提取及PCR

水稻基因組DNA采用SDS法提取，并采用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量。PCR反應(yīng)體系為：2×Taq Master Mix 15 μL，10 μmol/L正反引物各 1 μL，DNA模板1 μL，反應(yīng)總體積30 μL，用ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序?yàn)椋?4.0 ℃預(yù)變性5 min；94.0 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72.0 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72.0 ℃延伸10 min，4 ℃保存；8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，銀染法顯色拍照。

1.2.2引物設(shè)計(jì)

Wx基因G/T多態(tài)性利用Ayres等設(shè)計(jì)的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列標(biāo)記Wx484/W2R-ACCI酶切分析，上游引物為Wx484，序列為5′-CTTTGTCTATCTCAAGACAC-3′；下游引物為W2R，序列為5′-TTTCCAGCCCAACACCTTAC-3′。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，ACCI酶購自Thrmo Scientific。

1.2.3直鏈淀粉含量（AC）及其他性狀的測(cè)定

從供試的113份材料中隨機(jī)選取有3種基因型的材料37份，按照NY/T 593—2013《食用稻米品質(zhì)》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行糙米率、精米率、長寬比等性狀的計(jì)算。然后用旋風(fēng)式粉碎磨（JFS-13A型）磨粉，再經(jīng)100目篩后放置烘箱內(nèi)經(jīng)60 ℃干燥過夜。準(zhǔn)確稱取025 g淀粉小心放入50 mL 容量瓶，加入0.5 mL 95%乙醇，輕搖，使樣品濕潤分散。再加入 4.5 mL 1 mol/L NaOH 溶液，用堿液將瓶壁上黏附的樣品沖洗下去，然后沸水浴 10 min，冷卻至室溫，用超純水定容至50 mL，混勻后取其樣液 2.5 mL，加入已盛有半瓶蒸餾水的50 mL容量瓶中，再向容量瓶中加入0.5 mL 1 mol/L乙酸溶液，使樣品酸化，加0.75 mL碘試劑溶液（0.12 mol/L KI，0.008 mol/L I2），充分搖勻，用蒸餾水定容，靜置20 min，以0.09 mol/L NaOH溶液為空白對(duì)照，利用紫外分光光度計(jì)（752型）于620 nm 波長處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.738 2x-0.036 7（r2=0.998 6，標(biāo)準(zhǔn)曲線由不同含量的直鏈淀粉按國標(biāo)規(guī)定方法配置標(biāo)樣測(cè)定產(chǎn)生）計(jì)算表觀直鏈淀粉含量，每個(gè)樣品3次重復(fù)，其平均值作為該樣品的AC含量。

2結(jié)果與分析

2.1供試材料Wx基因的G/T多態(tài)性

CAPS標(biāo)記Wx484/Wx2R-ACCI檢測(cè)結(jié)果表明，112份材料中有86份材料基因?yàn)門T，約占總試材料的77%，酶切后只有1條257 bp的條帶；25份材料基因?yàn)镚T，約占總試材料的22%，酶切后既有257 bp的片段，也有129、128 bp的片段；只有1份材料基因?yàn)镚G，約占總試材料的1%，酶切后只有 128 bp 左右的片段。

2.2Wx基因G/T多態(tài)性與水稻恢保種類的關(guān)系

[JP2]112份供試材料中有76份恢復(fù)系材料，其中70份Wx基因型為TT，占92.11%，6份基因型為GT，占7.89%。有20份保持系材料，[JP3]其中4份基因型為TT，占20%，15份基因型為GT，占75%，1份基因型為GG，占5%。供試的恢復(fù)系材料中Wx基因型主要為TT，而保持系材料的Wx基因型主要為GT（表1）。[JP]

2.3Wx基因G/T多態(tài)性與其他性狀的關(guān)系

從3種基因型材料中隨機(jī)抽取37份材料進(jìn)行相關(guān)性狀和直鏈淀粉含量測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

37份材料的直鏈淀粉含量在9.3%～21.9%之間，其中基因型為GG和GT的材料直鏈淀粉含量在12.29%～2188%之間，基因型為TT的材料直鏈淀粉含量在9.26%～19.65%之間。從研究結(jié)果看，基因型為GT的直鏈淀粉含量較高，平均為18.64%，糙米率平均為76.69%，精米率平均為67.64%，整精米率平均為56.36%，米粒長寬比平均為2.79，堊白粒率平均為69.83%，堊白度平均為16.35%。而基因型為TT的材料直鏈淀粉含量較低，平均為13.81%，糙米率平均為77.22%，精米率平均為66.43%，整精米率平均為4665%，米粒長寬比平均為2.63，堊白粒率平均為22.57%，堊白度平均為799%。

3討論與結(jié)論

隨著人們生活水平的提高，對(duì)品質(zhì)要求越來越高，同時(shí)地處不同區(qū)域的人們由于生活習(xí)慣口味不同，對(duì)米質(zhì)要求也各不相同，另外不同的稻米加工對(duì)直鏈淀粉含量的要求也不一致。TT基因型的材料直鏈淀粉含量較低，GT基因型的材料直鏈淀粉含量較高，TT基因型的材料其堊白粒率和堊白度比GT基因型的材料低。供試的陜西省主要水稻種質(zhì)資源中保持系材料和恢復(fù)系材料占85.71%，其中恢復(fù)系材料的Wx基因型大部分為TT，而保持系材料的Wx基因型大部分為GT，因此雜交種Wx基因型可能為TT或GT，TT基因型的品種直鏈淀粉含量較低，黏性強(qiáng)，適口性好，GT基因型的品種直鏈淀粉含量較高，黏性弱，膨脹性好。由于Wx基因型與AC含量有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此無需等種子成熟后測(cè)定AC含量，而在作物生長的任何時(shí)期可以根據(jù)育種需要，利用檢測(cè)Wx基因型來培育滿足要求的不同品種。由于供試材料中只有1份材料的Wx基因型是GG，其直鏈淀粉含量及其他所測(cè)性狀接近GG基因型材料。在長江上游秈稻種植區(qū)，科研人員在育種實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)稻米品質(zhì)由碾米品質(zhì)、外觀品質(zhì)、食味品質(zhì)決定，其中直連淀粉含量是食味品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。目前使用[CM參考文獻(xiàn)：

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