劉蕾+宋佳+王輝

摘要：以擬南芥中控制硫苷生物合成相關(guān)基因家族FMOGS-OX位點(diǎn)基因全長(zhǎng)編碼區(qū)及蛋白為參考序列，在甘藍(lán)（Brassica oleraceae L.）基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastn和Blastp檢索，得到具備Score≥100、E值≤10-10、coverage ≥70%條件的甘藍(lán)注釋基因作為候選擬南芥FMOGS-OX的同源基因，并進(jìn)一步進(jìn)行同源性比較、基因結(jié)構(gòu)比較及序列聚類(lèi)分析。結(jié)果顯示，在甘藍(lán)中發(fā)現(xiàn)3個(gè)旁系同源基因Bol010993、Bol029100、Bol031350。甘藍(lán)和擬南芥FMOGS-OX同源基因之間在核酸水平上的相似性為69.4%～83.0%；甘藍(lán)3個(gè)FMOGS-OX旁系同源基因間的相似性保持在70.0%～840%。甘藍(lán)Bol010993與擬南芥FMOGS-OX1～FMOGS-OX4的結(jié)構(gòu)較為相似，而B(niǎo)ol029100、Bol031350與擬南芥FMOGS-OX5的結(jié)構(gòu)較相似。系統(tǒng)進(jìn)化分析及共線性分析初步確定，甘藍(lán)中分別存在1個(gè)FMOGS-OX2（Bol010993）和2個(gè)FMOGS-OX5（Bol029100、Bol031350）基因。

關(guān)鍵詞：十字花科；甘藍(lán)；硫代葡萄糖苷；FMOGS-OX基因

中圖分類(lèi)號(hào)： S635.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）11-0022-04

人們對(duì)甘藍(lán)的重視主要源于甘藍(lán)中含有一種重要的植物次生代謝產(chǎn)物——硫代葡萄糖苷，它影響著十字花科植物的風(fēng)味，同時(shí)在醫(yī)學(xué)上具有一定的保健功能，還有生物防御功能。硫代葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱(chēng)硫苷），又叫芥子油苷，甘藍(lán)等十字花科植物中含有硫代葡萄糖苷，硫代葡萄糖苷的基本結(jié)構(gòu)為1個(gè)β-D-葡萄糖，連接1個(gè)磺酸鹽醛肟基團(tuán)和1個(gè)來(lái)源于氨基酸的側(cè)鏈[4]。目前已經(jīng)有很多科學(xué)家研究植物中的硫代葡萄糖苷，而且對(duì)硫代葡萄糖苷作了進(jìn)一步分析。已有120多種不同的硫代葡萄糖苷被發(fā)現(xiàn)[5-6]，它們主要分布在白菜、甘藍(lán)、油菜、芥菜、花椰菜、蕪菁、蘿卜等十字花科植物中，并且?guī)缀跛械氖只浦参锒寄芎铣闪蜍誟6-7]。硫代葡萄糖苷存在于這些植物的根、莖、葉、種子中，在種子中含量最多。人們從芥菜中分離出的第一種硫苷是丙烯基硫苷（singapore）[8]。這些結(jié)果引起了人們的廣泛關(guān)注。

擬南芥中FMOGS-OX基因在十字花科中存在一個(gè)獨(dú)特的亞家族FMOGS-OX1 ～ FMOGS-OX5，并且FMOGS-OX1 ～ FMOGS-OX5各突變體均使磺酰硫苷占總硫苷的比例大大降低[9-11]。另外，酶學(xué)試驗(yàn)證實(shí)，不同的FMOGS-OX對(duì)側(cè)鏈長(zhǎng)度存在特異性[9-10]。十字花科蔬菜中具有的抗癌物質(zhì)磺酰脂肪族硫苷是FMOGS-OX基因的直接催化產(chǎn)物，因此，研究FMOGS-OX基因具有深遠(yuǎn)的生物技術(shù)前景[12]。本研究在甘藍(lán)基因組測(cè)序大背景下，利用生物信息分析為主要技術(shù)手段，充分挖掘甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)甘藍(lán)FMOGS-OXS候選基因進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析。本研究將為甘藍(lán)FMOGS-OXS基因的克隆、甘藍(lán)硫苷積累的分子機(jī)理的探索及富含有益硫苷甘藍(lán)新品種的選育提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

擬南芥FMOGS-OX家族所包含的5個(gè)基因（At1g65860、At1g62540、At1g62560、At1g62570、At1g12140）均來(lái)源于TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（www.arabidopsis.org）；甘藍(lán)基因組及基因注釋數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源于NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）；白菜BrFMOGS-OX基因來(lái)源于BRAD（http：//Brassicadb.org），并參考Wang等的研究結(jié)果[13]；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建所涉及蛋白序列均來(lái)源于UniProt（www.uniprot.org）、TAIR（www.arabidopsis.org）和BRAD（http：//Brassicadb.org）。

1.2試驗(yàn)方法

利用擬南芥FMOGS-OX1 ～ FMOGS-OX5基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列在甘藍(lán)基因組及注釋基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastn、Blastp檢索，得到具備Score ≥100、E值 ≤10-10、coverage ≥70%的甘藍(lán)基因組注釋基因作為候選擬南芥FMOGS-OX基因的同源基因。采用MEGA軟件進(jìn)行多序列比對(duì)及聚類(lèi)分析[14]。序列相似性分析和點(diǎn)陣圖制作分別采用EMBOSS軟件包的Needle程序和polydot程序（emboss.sourceforge.net）。

2結(jié)果與分析

2.1甘藍(lán)FMOGS-OX位點(diǎn)基因的預(yù)測(cè)

在甘藍(lán)基因組和44 940個(gè)注釋基因 （來(lái)源于http：//brassicadb.org/brad） 的基礎(chǔ)上，針對(duì)擬南芥FMOGS-OX家族中5個(gè)硫苷生物合成基因（FMOGS-OX1、FMOGS-OX2、FMOGS-OX3、FMOGS-OX4、FMOGS-OX5）采用Blastn、Blastp程序?qū)Ω仕{(lán)中FMOGS-OX家族相關(guān)基因進(jìn)行檢索分析。對(duì)應(yīng)5個(gè)擬南芥FMOGS-OX基因，在甘藍(lán)中共找到了3個(gè)同源基因（Bol010993、Bol029100、Bol031350）。

擬南芥中FMOGS-OX基因在脂肪族硫苷側(cè)鏈修飾途徑中起著重要作用，其所編碼的黃素單加氧酶具有使側(cè)鏈上的硫發(fā)生氧化的作用[7]。擬南芥中該家族存在5個(gè)旁系同源基因FMOGS-OX1、FMOGS-OX2、FMOGS-OX3、FMOGS-OX4、FMOGS-OX5，均位于擬南芥第1號(hào)染色體上，其中FMOGS-OX2（At1g62540）、FMOGS-OX3（At1g62560）、FMOGS-OX4（At1g62570）為tandem基因。甘藍(lán)中預(yù)測(cè)的3個(gè)FMOGS-OX基因中的Bol029100、Bol031350均分布在第8號(hào)染色體上，而B(niǎo)ol010993存在于Scaffold000215，目前該scaffold尚未定位到相應(yīng)的染色體上。

2.2甘藍(lán)FMOGS-OX基因與擬南芥FMOGS-OX基因的同源比較

由表2可知，擬南芥和甘藍(lán)FMOGS-OX基因在外顯子數(shù)目、外顯子大小及編碼區(qū)長(zhǎng)度等方面較為類(lèi)似。擬南芥

FMOGS-OX1～FMOGS-OX4均含有7個(gè)外顯子，并且不同旁系同源基因間各相應(yīng)外顯子的長(zhǎng)度非常接近，僅有FMOGS-OX3在外顯子1中多3 bp，另外，F(xiàn)MOGS-OX1～FMOGS-OX4的外顯子7稍有差別（分別為216、210、222、222 bp）。盡管擬南芥FMOGS-OX5與FMOGS-OX1～FMOGS-OX4相比缺少2個(gè)外顯子，但有趣的是 FMOGS-OX5外顯子4的長(zhǎng)度為219 bp，等于FMOGS-OX1～FMOGS-OX4各基因的外顯子4與外顯子5的長(zhǎng)度之和（83 bp+136 bp=219 bp）；同樣地，F(xiàn)MOGS-OX5的外顯子5長(zhǎng)度為 390 bp，等于FMOGS-OX1的外顯子6與外顯子7的長(zhǎng)度之和（174 bp+216 bp=390 bp），并且與另外3個(gè)旁系同源基因FMOGS-OX2～FMOGS-OX4的外顯子6與外顯子7的長(zhǎng)度之和（384 bp、396 bp、396 bp）非常接近。擬南芥中5個(gè)旁系同源基因在全基因長(zhǎng)度、編碼區(qū)長(zhǎng)度、編碼區(qū)所占全基因的比例均較為相似。甘藍(lán)FMOGS-OX的3個(gè)旁系同源基因中Bol010993存在7個(gè)外顯子，而B(niǎo)ol029100、Bol031350均含5個(gè)外顯子。另外，甘藍(lán)FMOGS-OX基因在全基因長(zhǎng)度方面差異較大，Bol010993最長(zhǎng)，為5 853 bp，Bol031350最短，僅為1 795 bp。甘藍(lán)FMOGS-OX的3個(gè)旁系同源基因的編碼區(qū)長(zhǎng)度差別不大，其長(zhǎng)度分別為1 386、1 347、1 380 bp。對(duì)甘藍(lán)和擬南芥FMOGS-OX基因各外顯子區(qū)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，各同源基因外顯子1～外顯子3長(zhǎng)度較為相似；甘藍(lán)Bol010993與擬南芥FMOGS-OX1～FMOGS-OX4非常類(lèi)似，尤其與FMOGS-OX4在外顯子數(shù)目及大小方面完全相同；而甘藍(lán)Bol029100、Bol031350則與擬南芥FMOGS-OX5較為類(lèi)似，均含有5個(gè)外顯子，特別是外顯子4與FMOGS-OX5的外顯子4長(zhǎng)度相同，均為219 bp。擬南芥和甘藍(lán)FMOGS-OX基因編碼區(qū)所占全基因的比例顯示5個(gè)擬南芥FMOGS-OX基因的編碼區(qū)所占全基因的比例均在40%左右，其中FMOGS-OX2最小，為35.02%，F(xiàn)MOGS-OX3最大，為4913%；而甘藍(lán)中3個(gè)旁系同源基因的編碼區(qū)所占全基因的比例差異明顯，分別為23.68%、70.30%、76.88%。表2擬南芥和甘藍(lán)FMOGS-OX位點(diǎn)基因外顯子數(shù)目、大小及所占基因比例等2.4主要十字花科植物FMOGS-OX位點(diǎn)基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)擬南芥（AT）、白菜（CC）、甘藍(lán)3個(gè)已有參考基因組物種的FMOGS-OX位點(diǎn)蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析。由圖2可知，擬南芥FMOGS-OX1～FMOGS-OX4基因之間親緣關(guān)系較近，而它們與FMOGS-OX5基因的距離相對(duì)較遠(yuǎn)。參考甘藍(lán)基因組與擬南芥基因組、甘藍(lán)基因組與白菜基因組間的共線性，初步確定甘藍(lán)中分別存在1個(gè)FMOGS-OX2（Bol010993）和2個(gè)FMOGS-OX5（Bol029100、Bol031350）基因。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Bol010993與白菜FMOGS-OX2（Bra027035）聚在同一分支，Bol029100、Bol031350分別與白菜FMOGS-OX5（Bra016787、Bra026988、C5H9Q6）距離較近，這與甘藍(lán)、白菜（均為蕓薹屬）的親緣關(guān)系較近。

3小結(jié)與討論

本研究借助生物信息分析手段和技術(shù)，在甘藍(lán)中預(yù)測(cè)到3個(gè)FMOGS-OX旁系同源候選基因（Bol010993、Bol029100、Bol031350）。甘藍(lán)和擬南芥FMOGS-OX同源基因間在核酸水平上的相似性為69.4%～83.3%；甘藍(lán)3個(gè)FMOGS-OX旁系同源基因間的相似性保持在70.0%～84.0%。甘藍(lán)Bol010993與擬南芥FMOGS-OX1～FMOGS-OX4基因結(jié)構(gòu)較為相似，而B(niǎo)ol029100、Bol031350與擬南芥FMOGS-OX5基因的結(jié)構(gòu)更為類(lèi)似。系統(tǒng)進(jìn)化分析及共線性分析初步確定，甘藍(lán)中存在1個(gè)FMOGS-OX2（Bol010993）和2個(gè)FMOGS-OX5基因（Bol029100、Bol031350）。

擬南芥、甘藍(lán)、白菜基因組大小分別為157、520、485 Mb[4，15-16]，而且有研究表明，白菜和甘藍(lán)基因組存在多倍化事件[13]。與多倍化事件理論上伴隨的同源基因多拷貝現(xiàn)象相悖，在擬南芥中存在5個(gè)FMOGS-OX旁系同源基因，與Wang等在白菜中的研究結(jié)果[16]類(lèi)似，甘藍(lán)中也發(fā)現(xiàn)3個(gè)旁系同源基因，這也暗示在擬南芥進(jìn)化途徑中，出現(xiàn)過(guò)FMOGS-OX基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)座、重組等現(xiàn)象，其中FMOGS-OX2～FMOGS-OX4為tandem基因，F(xiàn)MOGS-OX5中存在外顯子融合等現(xiàn)象也從側(cè)面印證了這一推測(cè)[12]。

擬南芥FMOGS-OX基因家族包含F(xiàn)MOGS-OX1～FMOGS-OX5 5個(gè)基因，F(xiàn)MOGS-OX1～FMOGS-OX5各突變體均大大降低磺酰脂肪族硫苷的數(shù)量，并且FMOGS-OX各基因還對(duì)脂肪族硫苷側(cè)鏈存在特異性[9-10，13]。有研究認(rèn)為，甘藍(lán)中4-甲基亞磺酰-3-丁烯硫苷（gucoraphanin，GRA）的含量較高，也是公認(rèn)的抗癌蔬菜紫甘藍(lán)和青花菜（均為甘藍(lán)類(lèi)蔬菜）的主要抗癌活性成分[11]，因此，F(xiàn)MOGS-OX基因具有廣泛的生物技術(shù)應(yīng)用前景[17]。由于擬南芥中存在5個(gè)FMOGS-OX旁系同源基因，這樣使得擬南芥中硫苷的遺傳變異更為復(fù)雜；而在甘藍(lán)中僅發(fā)現(xiàn)了3個(gè)FMOGS-OX旁系同源基因（Bol010993為FMOGS-OX2，Bol029100、Bol031350均為FMOGS-OX5），這有利于進(jìn)一步人為操縱甘藍(lán)中磺酰硫苷的結(jié)構(gòu)和數(shù)量。

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