倪雅楠+劉博

摘要：以龍爪槐（Sophora japonica f. pendula Hort.）葉片為材料，采用L16（45）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA用量5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，并確立適用于龍爪槐SRAP-PCR反應(yīng)的最佳體系。結(jié)果表明，龍爪槐SRAP-PCR反應(yīng)的最佳體系為反應(yīng)總體積12.5 μL，Taq酶0.10 U、Mg2+ 3.0 nmol/L、dNTPs 2.5 nmol/L、正反向引物均為1.2 nmol/L、DNA 100 ng，其余體積用ddH2O補(bǔ)足。各因素水平變化對(duì)反應(yīng)體系的影響影響大小依次為引物、模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶。用35個(gè)龍爪槐樣品對(duì)優(yōu)化體系進(jìn)行驗(yàn)證，均得到條帶清晰、多態(tài)性豐富的圖譜，證實(shí)了該體系的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：龍爪槐；SRAP-PCR；正交試驗(yàn)；反應(yīng)體系優(yōu)化

中圖分類號(hào)： S687.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）11-0019-03

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence related aplified polymorphism，SRAP），是美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li等在蕓薹屬（Brassica）中開發(fā)出的，利用1對(duì)獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)方式實(shí)現(xiàn)對(duì)開放閱讀框架ORFs進(jìn)行擴(kuò)增的標(biāo)記[3]，適合于植物的遺傳多樣性研究、比較基因組學(xué)、遺傳圖譜的構(gòu)建等領(lǐng)域研究。筆者首次采用SRAP技術(shù)對(duì)龍爪槐的遺傳多樣性進(jìn)行分析，因此，須要確定其SRAP-PCR的最佳反應(yīng)體系。

正交試驗(yàn)?zāi)芫C合各因素及其相互作用，快速找到影響因素的最佳水平組合，不僅效率高，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。正交試驗(yàn)已被廣泛應(yīng)用到菊花、荷花和番茄的優(yōu)化體系中，并已確定最佳的反應(yīng)體系[4-6]。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為采自北京市35株龍爪槐的嫩葉（表1），硅膠

1.3.4龍爪槐SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系驗(yàn)證以35份龍爪槐的基因組DNA為模板，隨機(jī)選取2個(gè)SRAP引物組合ME1-EM7、ME8-EM8，按照上述擴(kuò)增及檢驗(yàn)方法，對(duì)優(yōu)化的龍爪槐SRAP-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)。

1.4數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2結(jié)果與分析

2.1龍爪槐SRAP-PCR反應(yīng)體系的確立

2.1.1試驗(yàn)材料基因組DNA檢測(cè)部分試驗(yàn)材料的DNA瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1，DNA條帶清晰、完整，符合SRAP對(duì)DNA的要求。

2.1.2正交試驗(yàn)結(jié)果分析根據(jù)正交試驗(yàn)表，每個(gè)處理重復(fù)3次，得到的電泳結(jié)果見圖2，采用不同的反應(yīng)體系擴(kuò)增結(jié)果存在明顯差異。第1、6、9、10、12、14、15、16組擴(kuò)增效果較差，條帶不清晰穩(wěn)定性差；2、11組重復(fù)性差，反應(yīng)體系彌散嚴(yán)重，條帶不清晰；4、5、7、8組擴(kuò)增效果較好，但2、3、5、7、8組條帶豐富性差。綜合以上分析，根據(jù)條帶豐富度、清晰度以及重復(fù)性等因素初步確定第4組為最佳反應(yīng)體系。

2.2龍爪槐最佳SRAP-PCR反應(yīng)體系驗(yàn)證

應(yīng)用上述篩選出的龍爪槐最佳反應(yīng)體系，選取2個(gè)引物組合ME1-EM7和ME8-EM8對(duì)35個(gè)龍爪槐樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果（圖3）顯示，隨機(jī)選取的這2個(gè)引物組合能應(yīng)用篩選得到的最佳體系擴(kuò)增出豐富的條帶，且圖譜條帶清晰、穩(wěn)定性好，證明該最佳體系可以應(yīng)用到龍爪槐基因組DNA的SRAP-PCR反應(yīng)中。

3討論

龍爪槐在我國(guó)具有悠久的栽培歷史，是園林造景中不可缺少的樹種，目前關(guān)于龍爪槐的研究?jī)H局限于嫁接技術(shù)、蟲害防治方面[8-13]，對(duì)于龍爪槐分子生物學(xué)方面的研究還未見報(bào)道，因此本研究旨在探究龍爪槐分子水平上的特征，評(píng)價(jià)龍爪槐的遺傳結(jié)構(gòu)和變異，為龍爪槐種質(zhì)資源的搜集、保存和利用提供理論依據(jù)，并為龍爪槐的分子水平研究奠定一定的基礎(chǔ)。

對(duì)PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化有單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)2種方法，單因素試驗(yàn)不能兼顧到各因素之間的相互作用，無(wú)法分析各組分不同水平對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響的差異顯著性，且單因素試驗(yàn)次數(shù)多，耗時(shí)耗力成本較高；正交試驗(yàn)與單因素試驗(yàn)相比節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間，用較少的試驗(yàn)次數(shù)便可獲得可靠的試驗(yàn)結(jié)果，并能通過(guò)數(shù)據(jù)反映出各因素間的交互作用。本研究通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)影響SRAP-PCR的5個(gè)因素和4個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化和篩選，最終確定龍爪槐SRAP-PCR的最佳反應(yīng)體系為反應(yīng)總體積12.5 μL，Taq酶0.10 U、Mg2+ 3.0 nmol/L、dNTPs 2.5 nmol/L、正反向引物均為1.2 nmol/L，DNA 100 ng，其余體積用ddH2O補(bǔ)足。

反應(yīng)體系中的各個(gè)因素之間會(huì)產(chǎn)生相互作用，每種因素發(fā)生變化都可能影響擴(kuò)增的結(jié)果。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，各個(gè)因素對(duì)龍爪槐SRAP-PCR的影響大小依次為引物、模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，SRAP-PCR反應(yīng)體系針對(duì)不同物種的分析中，每個(gè)反應(yīng)因素對(duì)物種的影響程度均有所不同，因此SRAP-PCR反應(yīng)體系必須針對(duì)不同物種和試劑的差異對(duì)主要的影響因素進(jìn)行優(yōu)化，保證試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛用于植物的遺傳多樣性研究中[14]。陳興彬利用篩選出的多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定的7對(duì)引物對(duì)11個(gè)黑松群體進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出73個(gè)條帶，其中59個(gè)多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率為80.82%，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出10.4、8.4個(gè)多態(tài)性條帶[15]；Pinar等用過(guò)SRAP標(biāo)記對(duì)地中海地區(qū)57株野生杏的遺傳多樣性進(jìn)行分析，其中19對(duì)引物中有16對(duì)可以擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，擴(kuò)增出的87段條帶中，有56段具有多態(tài)性，多態(tài)性條帶比率為64.37%[16]。在本試驗(yàn)中應(yīng)用SRAP技術(shù)，使用隨機(jī)選取的2個(gè)引物對(duì)，對(duì)35份龍爪槐樣品進(jìn)行分析，獲得32個(gè)條帶，多態(tài)性條帶有26條，多態(tài)性比率為81.25%。以上研究可以看出，SRAP技術(shù)擴(kuò)增條帶豐富度、多態(tài)性均較高，且試驗(yàn)過(guò)程中具有較高的穩(wěn)定性和重復(fù)性；SRAP技術(shù)可以在未知基因組序列信息的條件下使用，所用引物也具有通用性，因此，SRAP技術(shù)適用于龍爪槐遺傳多樣性的研究，同時(shí)

也為對(duì)龍爪槐進(jìn)行資源鑒定、基因定位等方面的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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