劉永莉，李明武，賴明紅，萬榮

結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中細(xì)胞因子水平的診斷價(jià)值

劉永莉，李明武，賴明紅，萬榮

目的：探討分泌性靶抗原-6（ESAT-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）和干擾素-γ（IFN-γ）對(duì)于早期診斷結(jié)核性腦膜炎（TBM）的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：選取48例TBM患者為研究組，29例非結(jié)核性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者為對(duì)照組，35例普通頭痛患者為正常組。采用ELISA法分別檢測(cè)所有患者腦脊液中的ESAT-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平。結(jié)果：研究組的ESAT-6、TNF-α、IFN-γ水平與對(duì)照組相比增高，研究組與對(duì)照組的ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平均高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。研究組的ESAT-6與IFN-γ水平呈正相關(guān)（r=0.96，P＜0.05）。4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度明顯高于使用ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ單一指標(biāo)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.936，18.104，12.647，13.978；P＜0.05）。結(jié)論：ESAT-6、TNF-α、IFN-γ和IL-10在TBM患者腦脊液中的表達(dá)水平顯著升高，對(duì)早期診斷TBM具有重要的臨床價(jià)值，而且4項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)較單一檢測(cè)的診斷效果更佳。

結(jié)核性腦膜炎；分泌性靶抗原-6；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-10；干擾素-γ

結(jié)核性腦膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是由于結(jié)核桿菌侵入淋巴系統(tǒng)或隨血液散播入腦引發(fā)的腦膜非化膿性炎癥性疾病[1]，其早期的臨床癥狀不明顯，病情發(fā)展迅速。診斷常用的腦脊液結(jié)核桿菌培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，陽性檢出率較低，導(dǎo)致早期診斷較困難。因此，找到一種簡(jiǎn)便、特異、敏感的診斷方法對(duì)于TBM具有重要的臨床意義。本研究探討早期分泌性靶抗原-6（early secreting antigenic target-6，ESAT-6）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）水平對(duì)早期診斷TBM的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3月至2015年6月于昆明市第三人民醫(yī)院就診的疑似TBM患者112例，就診后均進(jìn)行腦脊液結(jié)核桿菌培養(yǎng)及染色檢查，確診為TBM患者48例為研究組，均符合TBM確診標(biāo)準(zhǔn)[2]：腦脊液結(jié)核桿菌培養(yǎng)或染色陽性；臨床表現(xiàn)為頭痛、發(fā)熱、嘔吐、腦膜刺激征、顱內(nèi)壓增高等。另符合下列標(biāo)準(zhǔn)一條以上：頭顱CT檢查發(fā)現(xiàn)腦積水、腦梗死、腦膜強(qiáng)化等表現(xiàn)；存在肺結(jié)核；抗結(jié)核治療有效。確診為非結(jié)核性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者29例為對(duì)照組，其中隱球菌性腦膜炎8例、化膿性腦膜炎6例，病毒性腦膜炎15例。另以頭痛癥狀為主，但神經(jīng)系統(tǒng)體征、腦脊液及相關(guān)輔助檢查均正常的患者35例為正常組，男19例，女16例；年齡（38.5±8.7）歲；對(duì)照組，男16例，女13例；年齡（39.6±9.8）歲；研究組，男21例，女21例；年齡（42.7± 10.3）歲。3組的一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

所有患者均在就診后24 h內(nèi)接受腰椎穿刺術(shù)，取腦脊液2 mL，3 000 r/min、4℃離心10 min，分離上清液，－20℃冰箱保存。采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)腦脊液標(biāo)本中的ESAT-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。微孔被所用抗原包被后置37℃封閉4 h；棄掉孔中液體，在微孔中加入待測(cè)樣本，每孔100 μL，37℃孵育60 min；棄上清后PBS清洗3次，加入酶標(biāo)抗體，每孔100 μL，37℃孵育40-60 min；PBS清洗3次，加入TMB顯色，37℃避光放置30 min；最后加入終止液終止反應(yīng)后，使用美國Thermo公司生產(chǎn)的全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸收值（OD），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)的濃度水平。用測(cè)定標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本吸收值的比值（P/N）表示，P/N≥2.1為陽性。ESAT-6試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；IL-10、TNF-α、IFN-γ試劑盒購自北京晶美生物工程有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；靈敏度與特異度差異比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。指標(biāo)之間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，顯著性水平＜0.05表示具有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 3組ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ比較

研究組與對(duì)照組的ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平均高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；研究組的ESAT-6、TNF-α、IFN-γ水平與對(duì)照組相比明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；見表1。

表1 3組ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ比較（±s）

表1 3組ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ比較（±s）

注：與正常組比較，①P＜0.05；與對(duì)照組比較，②P＜0.05

組別 例數(shù)ESAT-6/(pg/mL)IL-10/(pg/mL)正常組對(duì)照組研究組35 29 48 5.9±1.2 7.2±1.8①243.7±103.4①②3.1±0.8 13.8±6.9①16.2±7.6①組別正常組對(duì)照組研究組TNF-α/(pg/mL) 5.4±2.9 10.6±4.1①88.3±34.6①②IFN-γ/(pg/mL) 7.3±2.7 29.2±17.6①98.3±41.2①②

2.2 各組ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ之間的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與正常組的ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ檢測(cè)結(jié)果兩兩之間均無相關(guān)性；研究組的ESAT-6與IFN-γ水平呈正相關(guān)（r=0.96，P＜0.05）。

2.3 單一與聯(lián)合檢測(cè)的敏感度與特異性分析

4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度明顯高于使用ESAT-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ單一指標(biāo)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.936，18.104，12.647，13.978；P＜0.05）。此外，聯(lián)合檢測(cè)的約登指數(shù)、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值均高于單一指標(biāo)，見表2。

3 討論

表2 單一及聯(lián)合指標(biāo)的敏感度、特異性與約登指數(shù)比較

TBM是一種嚴(yán)重的肺外結(jié)核疾病，早期診斷及采取有效治療措施對(duì)提高TBM的治療效果和預(yù)后有重要意義[2]。目前TBM的診斷主要依靠觀察臨床表現(xiàn)、腦脊液結(jié)核桿菌培養(yǎng)或染色、頭顱CT檢查等手段，但由于很多患者存在癥狀不明顯，結(jié)核桿菌培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)和陽性檢出率低等問題，導(dǎo)致診斷率較低[3]。

近年來，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)一些蛋白和細(xì)胞因子在TBM發(fā)生發(fā)展過程中會(huì)產(chǎn)生顯著變化。ESAT-6是由結(jié)核桿菌分泌產(chǎn)生的一種蛋白，在結(jié)核分支桿菌中能特異性表達(dá)，在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分支桿菌中并不表達(dá)[4]。馬江濤等[5]采用ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TBM患者腦脊液中ESAT-6濃度明顯高于非結(jié)核感染者。何俊瑛等[6]采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TBM患者腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞內(nèi)的EAST-6檢測(cè)靈敏度為70%，特異度達(dá)到95%。

INF-γ是由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞生成的一種重要的免疫調(diào)節(jié)和促炎性細(xì)胞因子，具有雙重的免疫作用，高濃度的INF-γ能加強(qiáng)免疫反應(yīng)，但會(huì)加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷；同時(shí)能夠促進(jìn)機(jī)體清除體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌[7]。劉霞等[8]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腦患者急性期INF-γ表達(dá)水平明顯升高，顯著高于非中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染者。TNF-α是由活化的單核細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，具有促炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫的功能；還可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞再生。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α具有廣泛的生物活性，可有效抑制病毒、細(xì)菌，提高T細(xì)胞活性，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TBM患者的ESAT-6、TNF-α、IFN-γ水平與非結(jié)核性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者相比明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與上述研究結(jié)果基本一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)TBM患者的ESAT-6與IFN-γ水平呈正相關(guān)，主要原因是INF-γ是由ESAT-6刺激淋巴細(xì)胞后分泌產(chǎn)生的重要抗原分子，INF-γ水平升高是ESAT-6水平升高的必然結(jié)果。

IL-10是一種由TH2細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌的一種免疫抑制因子，在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[10]。張韶斌等[11]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核患者的血漿、胸積水中的IL-10水平較正常人明顯升高，IL-10通過抑制TH1細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的免疫功能，導(dǎo)致有害細(xì)菌長(zhǎng)期潛伏，患者病情不斷加重。本研究結(jié)果顯示，TBM患者與非結(jié)核性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的IL-10水平均明顯高于普通頭痛患者，與上述結(jié)果基本一致。

本研究采用的ESAT-6、TNF-α、IFN-γ和IL-10這4項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的最高靈敏度、特異度和約登指數(shù)分別為62.5%、82.9%和0.420，4項(xiàng)聯(lián)合的靈敏度、特異度和約登指數(shù)分別為87.5%、74.3%和0.618，靈敏度和約登指數(shù)獲得明顯提高，提示4項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)能夠提高陽性檢出率，較單一檢測(cè)效果更好，真實(shí)性更高。

綜上所述，ESAT-6、TNF-α、IFN-γ和IL-10在TBM患者腦脊液中的表達(dá)水平顯著升高，對(duì)早期診斷TBM具有重要的臨床價(jià)值，而且4項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)較單一檢測(cè)的診斷效果更佳。

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（本文編輯：王晶）

Clinical Diagnostic Significance of ESAT-6,IL-10,TNF-α and IFN-γ in Tuberculous Meningi-tis

LIU Yong-li,LI Ming-wu,LAI Ming-hong,WANG Rong.
Department of Tuberculosis,Third People's Hospital of Kunming,Kunming 650041,China

Objective:To investigate the early secreting antigenic target-6(ESAT-6),tumor necrosis factor-α (TNF-α),interferon-γ(IFN-γ)and interleukin-10(IL-10)for early diagnosis of tuberculous meningitis(TBM).Methods:Forty-eight patients with TBM were enrolled as study group,29 non-tuberculous central nervous system infection patients were enrolled as control group,35 cases of normal headache patients were enrolled as normal group.The levels of ESAT-6,TNF-α,IFN-γand IL-10 levels in CSF of all patients were detected by ELISA method.Results:The levels of ESAT-6,TNF-α,IFN-γ and IL-10 of patients in the study group were significantly higher than those in the control group.The levels of ESAT-6,IL-10,TNF-αand IFN-γin the groups study and control group were significantly higher than those in the normal group(P＜0.05).It had significantly positive correlation between ESAT-6 and IFN-γ of patients in the study group(r=0.96,P＜0.05).The sensitivity of the combined detection of 4 indexes was significantly higher than that of one index(χ2=10.936,18.104,12.647, 13.978;P＜0.05).Conclusion:The levels of ESAT-6,TNF-α,IFN-γ and IL-10 in cerebrospinal fluid of TBM patients were significantly increased,which has important clinical value for early diagnosis of TBM.Four joint detection is better than the single detection of the diagnosis.

tubercular meningitis;early secreting antigenic target-6;interleukin-10;tumor necrosis factor-α;interferon-γ

R741；R651.1

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.04.014

昆明市第三人民醫(yī)院結(jié)核二科昆明 650041

2016-04-19

劉永莉tiyanv@163.com