武強，吳樂，濮捷，崔敏，徐志鵬，劉琴，陳芳

·論著·

脂氧素A4對Aβ25-35所致N2a細胞損傷的保護作用初探

武強a，吳樂a，濮捷a，崔敏a，徐志鵬a，劉琴b，陳芳b

目的：初步探討脂氧素A4（LXA4）對β-淀粉樣蛋白25-35（Aβ25-35）損傷N2a細胞的保護作用及其機制。方法：用不同濃度Aβ25-35處理N2a細胞，建立阿爾茨海默?。ˋD）細胞損傷模型，通過細胞形態(tài)學觀察、CCK-8法和Hoechst 33258染色來評價細胞模型是否構建成功。細胞分為對照組、模型組（20 μmol/L Aβ25-35）和LXA4保護組（50、100、200 nmol/L）。采用CCK-8法檢測N2a細胞的活性；熒光酶標儀檢測N2a細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平；ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中白介素-10（IL-10）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。結果：20 μmol/LAβ25-35處理N2a細胞24 h可建立細胞損傷模型。LXA4保護組的細胞存活率均較模型組顯著升高。與模型組相比，200 nmol/L LXA4保護組細胞內(nèi)ROS水平顯著降低（P＜0.01）；200 nmol/L LXA4保護組IL-10水平顯著高于模型組（P＜0.01）；200 nmol/L LXA4保護組的TNF-α水平顯著低于模型組（P＜0.01）。結論：LXA4對Aβ25-35損傷N2a細胞具有保護作用，其機制可能是抑制ROS水平以及調(diào)節(jié)炎癥因子的表達。

脂氧素A4；N2a細胞；β-淀粉樣蛋白25-35；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種漸進性大腦退行性病變，其發(fā)病率隨著年齡的增長而逐漸增高，臨床上主要表現(xiàn)為進行性認知功能障礙。其主要的神經(jīng)病理學特征為β-淀粉樣蛋白（amyloid beta-protein，Aβ）的生成、積聚及毒性作用。Aβ積聚激活小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，引起機體氧化應激反應，產(chǎn)生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），ROS大量積聚會造成神經(jīng)元氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，誘導炎癥介質(zhì)釋放增加，進一步損傷神經(jīng)細胞[1,2]。脂氧素（lipoxins，LXs）是花生四烯酸在機體內(nèi)代謝產(chǎn)生的不飽和脂肪酸產(chǎn)物，被認為是抑制炎癥的“剎車信號”分子，具有抑制炎癥、抗氧化應激、抑制細胞外基質(zhì)合成等作用，脂氧素A4（lipoxin A4，LXA4）為LXs主要成員之一[3]。本文以Aβ25-35誘導N2a細胞損傷建立AD細胞模型，初步探討LXA4對該模型細胞損傷的保護作用，為臨床應用LXA4防治AD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 小鼠腦神經(jīng)瘤細胞（Neuro-2a，N2a）購自武漢華聯(lián)生物科技有限公司。

1.1.2 試劑及主要儀器 Aβ25-35（購于上海Aladdin公司），LXA4（購于美國Cayman chemical公司），Hoechst 33258染色液（購于美國Sigma公司），CCK-8（購于日本同仁公司），胰酶、ROS檢測試劑盒（購于上海碧云天生物技術研究所），青鏈霉素雙抗、小鼠IL-10 ELISA試劑盒和小鼠TNF-αELISA試劑盒（購于武漢博士德生物工程有限公司），DMEM-H、PBS（購于美國Hyclone公司），胎牛血清（購于浙江天杭生物科技有限公司）。倒置顯微鏡（購于日本奧林巴斯公司）、CO2細胞培養(yǎng)箱（購于日本SANYO公司）和生物安全柜（購于青島海爾公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模 取對數(shù)生長期N2a細胞，接種到96孔板，5×103個/孔，每組5個復孔，待細胞達到80%融合時，加入含不同濃度（0.1、1、10、20、50、100 μmol/L）Aβ25-35的DMEM-H培養(yǎng)液100 μL，24 h后每孔加入10 μL CCK-8檢測，并計算IC50。另取對數(shù)生長期N2a細胞，加入含無菌爬片的6孔板中，3×105個/孔，加入含 20 μmol/L Aβ25-35的DMEM-H培養(yǎng)液，24 h后在顯微鏡下進行造模后細胞形態(tài)學觀察、拍照，并按說明書進行Hoechst 33258染色、拍照。

1.2.2 實驗分組 取對數(shù)生長期的N2a細胞，待細胞達到80%融合時，分為以下3組：①正常組，在培養(yǎng)瓶中加入正常培養(yǎng)液，隔天換液；②模型組，加入20 μmol/L Aβ25-35處理24 h后，加入正常培養(yǎng)液；③保護組，加入20 μmol/LAβ25-35處理24 h后，加入含不同濃度的LXA4（50、100、200 nmol/L）培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.2.3 檢測細胞存活率 CCK-8法：取對數(shù)生長期的N2a細胞，0.25%胰酶消化后離心，用DMEM-H培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，接種到96孔板，每孔體積100 μL。37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，細胞貼壁。加入10 μL CCK8，培養(yǎng)1～4 h。測定450 nm吸光度，采用雙波長進行測定，檢測波長450～490 nm，參比波長600～650 nm，用酶標儀來測試各孔的光吸收值A值，細胞存活率(%)=[(A各藥物組-A空白組)/(A陰性對照組-A空白組)]×100%。

1.2.4 檢測ROS水平 使用ROS檢測試劑盒，采用DCF法測定細胞內(nèi)ROS：96孔板養(yǎng)細胞24 h后，吸取培養(yǎng)液，加50 μL濃度10 μmol/L的DCFH-DA，37℃孵育15 min，之后取出，D-Hank's液體洗3遍，加1 mg/L的ROSup，15 min后在熒光顯微鏡下檢測熒光強度。

1.2.5 ELISA法檢測細胞上清中分泌的IL-10和TNF-α吸取細胞培養(yǎng)上清液，移入EP管，將EP管放入4℃離心機，3 000 rpm離心20 min，取上清液，置于－80℃冰箱待測。采用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清IL-10和TNF-α含量。按照ELISA試劑盒說明書操作，通過酶標儀檢測，讀取450 nm處的OD值，IL-10和TNF-α濃度與OD450值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中IL-10和TNF-α濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標準差）表示，單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度Aβ25-35對N2a細胞存活率的影響

N2a細胞分別加入0.1、1、10、20、50、100 μmol/L Aβ25-35溶液作用24 h后，CCK-8法得到細胞存活率分別為（0.9142±0.0486）、（0.7680±0.0715）、（0.5617± 0.0437）、（0.4959±0.0111）、（0.4132±0.0067）、（0.3643± 0.0524）。與正常組（1.0000±0.0438）相比，有顯著性差異（P＜0.01），見圖1。同時，0.1、1、10、20、50、100 μmol/ LAβ25-35各組的細胞存活率逐漸降低，各組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），并存在劑量依賴性。SPSS 18.0軟件計算出Aβ25-35誘導N2a細胞的IC50是20.7510 μmol/ L，后續(xù)實驗均采用20 μmol/L Aβ25-35進行N2a造模實驗。

圖1 不同濃度Aβ25-35對N2a細胞存活的影響

2.2 Aβ25-35對N2a細胞形態(tài)學的影響

取20 μmol/L Aβ25-35溶液作用N2a細胞24 h，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組的N2a細胞呈圓形，細胞體飽滿，透明度大，折光性強，輪廓不清；模型組細胞數(shù)量變少，細胞形態(tài)不規(guī)則，分化出大量突觸，見圖2。

2.3 Aβ25-35對N2a細胞凋亡的影響

取20 μmol/L Aβ25-35溶液作用N2a細胞24 h，進行Hoechst 333258染色后顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常N2a細胞核染色均勻呈橢圓形，發(fā)出朦朧藍色熒光；模型組部分細胞核呈致密濃染，顏色發(fā)白，表明Aβ25-35可引起N2a細胞凋亡，見圖3。

2.4 LXA4對Aβ25-35損傷的N2a細胞活性的影響

CCK-8檢測結果顯示，正常組和模型組的OD450值分別為（1.4117±0.0202）和（0.7059±0.0101）；保護組的OD450值均高于模型組（P＜0.01），且50、100、200 μmol/L LXA4保護組的OD450值分別為（0.7644±0.0177）、（0.8533±0.0101）、（0.8948±0.0113），3亞組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中200 μmol/L LXA4的保護作用最明顯（P＜0.01），見圖4。

2.5 LXA4對Aβ25-35損傷的N2a細胞胞內(nèi)ROS水平和炎癥因子的影響

模型組細胞內(nèi)ROS水平顯著高于正常組（P＜0.01）；200 nmol/L LXA4保護組ROS水平低于模型組，有顯著性差異（P＜0.01）。與正常組相比，模型組培養(yǎng)體系中IL-10和TNF-α的濃度顯著增加（P＜0.01）；200 nmol/L LXA4保護組與模型組相比，IL-10顯著升高（P＜0.01），TNF-α顯著降低（P＜0.01），見表1。

3 討論

AD發(fā)病機制有幾個假說，其中包含氧化應激假說和炎癥反應假說[4]。Aβ聚集激活小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，產(chǎn)生大量ROS和自由基等神經(jīng)毒素，啟動神經(jīng)炎癥級聯(lián)反應。過度激活的小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生神經(jīng)炎癥因子和神經(jīng)毒素，降低AD小膠質(zhì)細胞的吞噬清除功能和免疫監(jiān)視功能，加重免疫炎癥反應[5,6]。LXA4具有抗氧化應激的功能，又在多種炎癥消退和自限性發(fā)展的進程中起著關鍵性的作用，其表達缺陷是炎癥失控發(fā)展的重要因素[7]。因此，本研究在體外用Aβ225-35損傷N2a細胞建立AD細胞模型，從抗氧化應激和炎癥假說兩個方面初步探討LXA4對該模型的保護作用。該實驗細胞選擇由IU.Klebe和RH.Ruddle通過提取A品系小白鼠的自生腫瘤而建立的N2a細胞，其具有較大的細胞質(zhì)，能很好地貼壁生長，通過它可更好地分析細胞受損時形態(tài)的變化[8]。

圖2 Aβ25-35對正常組（A）和模型組（B）N2a細胞形態(tài)學的影響（×200）

圖3 Hoechst 333258染色檢測Aβ25-35對正常組（A）和模型組（B）N2a細胞凋亡的影響（×400）

圖4 LXA4對Aβ25-35損傷的N2a細胞活性的影響

表1 LXA4對Aβ25-35處理N2a細胞中ROS水平和炎癥因子的影響（±s）

表1 LXA4對Aβ25-35處理N2a細胞中ROS水平和炎癥因子的影響（±s）

注：與正常組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01

組別 例數(shù)ROS/%正常組模型組200 nmol/L LXA4組666 3.1154±0.2239 99.1388±1.9838①67.9544±2.1611②組別正常組模型組200 nmol/L LXA4組IL-10/(ng/L) 98.7448±1.8547 200.5041±1.6048①527.1810±20.7438②TNF-α/(ng/L) 130.1508±1.3780 238.1891±4.4952①186.0965±6.7068②

通過CCK-8法對Aβ25-35損傷濃度進行篩選，采用20 μmol/L Aβ25-35進行N2a細胞造模實驗。取20 μmol/ LAβ25-35溶液作用N2a細胞24 h，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組細胞數(shù)量變少，細胞形態(tài)不規(guī)則化，分化出大量突觸。Hoechst 333258染色檢測發(fā)現(xiàn)模型組部分細胞核呈致密濃染，顏色發(fā)白，出現(xiàn)明顯的凋亡。Aβ25-35處理N2a細胞后細胞活性、形態(tài)變化、凋亡狀況與程大龍等[7]的研究結果一致，說明成功建立Aβ25-35誘導N2a細胞損傷的AD細胞模型。

為研究LXA4對Aβ25-35誘導的N2a細胞損傷是否具有保護作用，采取CCK-8法檢測結果發(fā)現(xiàn)50、100、200 μmol/L LXA4保護組的OD值高于模型組（P＜0.01），其中200 μmol/L LXA4的保護作用最明顯，說明LXA4可降低Aβ25-35對N2a細胞的損傷。

為探討LXA4是否通過抗氧化應激和炎癥反應假說來降低Aβ25-35對N2a細胞的損傷，本實驗采用熒光酶標儀法檢測各組細胞中ROS水平，ELISA法檢測各組細胞中IL-10和TNF-α的含量。IL-10能發(fā)揮下調(diào)炎癥反應，拮抗炎性介質(zhì)的作用。本研究觀察到：200 nmol/ L LXA4保護組能顯著降低模型組ROS水平（P＜0.01）；顯著上調(diào)抗炎因子IL-10（P＜0.01）；顯著降低炎癥因子TNF-α（P＜0.01）。這初步說明LXA4可能通過抗氧化應激和調(diào)控炎癥反應來提高Aβ25-35損傷的N2a細胞活性。

綜上所述，LXA4對Aβ25-35誘導的N2a細胞損傷具有保護作用，其作用機制可能是通過降低ROS的產(chǎn)生和促炎癥因子的生成，同時促進抗炎因子的產(chǎn)生從而發(fā)揮對Aβ25-35誘導的N2a細胞損傷的保護作用。本研究表明，LXA4對AD具有潛在的治療價值。

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（本文編輯：王晶）

Pilot Study of Protection of 5(S),6(R)-Lipoxin A4 Methyl Ester to N2a Cell Injury Caused by

Aβ25-35WU Qianga,WU Lea,PU Jiea,CUI Mina,XU Zhi-penga,LIU Qinb,CHEN Fangb.
Department of Neurology,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Region,Wuhan 430070,China

Objective:To explore the protective effect and mechanism of LXA4 on Aβ25-35-induced injury in N2a cells.Methods:N2a cells were treated with different concentrations of Aβ25-35,and the Alzheimer’s disease (AD)cell model was established by the observation of cell morphology,CCK-8 method and Hoechst 33258 staining.The experiment was divided into control group,model group(20 μmol/LAβ25-35)and LXA4 protective group (50,100,200 nmol/L).The activities of N2a cells were detected by CCK-8.The reactive oxygen species(ROS) level of N2a cells was examined by 2',7'-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)assay.The productions of interleukin-10(IL-10)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)were measured using enzyme-linked immunosorbant assay(ELISA)kits．Results:The N2a cells treated with 20 μmol/L Aβ25-35for 24 h could establish the AD cell model.Compared with the model group,the cell survival rate of LXA4 protective group was increased;the ROS level of LXA4 protective group(200 nmol/L)was decreased(P＜0.01);IL-10 of LXA4 protective group(200 nmol/L)was increased(P＜0.01);TNF-α of LXA4 protective group(200 nmol/L)was decreased(P＜0.01).Conclusion:LXA4 plays a protective effect on the injury of N2a cells induced by Aβ25-35,and inhibiting ROS level and regulating the expression of inflammatory factors may be the underlying mechanism.

LipoxinA4;N2a cells;amyloid beta-protein 25-35;Alzheimer’s disease

R741;R741.05

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.04.001

中國人民解放軍武漢總醫(yī)院 a.神經(jīng)內(nèi)科，b.醫(yī)學實驗科武漢 430070

湖北省自然科學基金（No.2015CFB579）

2016-10-20

武強wuqianglbt@163.com