胡寧寧，郭慧琴，李西良，孔令琪，武自念，張繼澤，常 春，萬東莉，臧 輝，任衛(wèi)波(.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所,內(nèi)蒙古 呼和浩特 0000； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,北京 0008；.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 0008)

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植物生產(chǎn)層

羊草不同組織實時定量PCR內(nèi)參基因的篩選

胡寧寧1,2，郭慧琴3，李西良1，孔令琪1，武自念1，張繼澤1，常 春1，萬東莉1，臧 輝1,2，任衛(wèi)波1
(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院,北京 100081；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

為篩選羊草(Leymuschinensis)不同組織實時定量PCR(qRT-PCR)試驗體系中的最佳內(nèi)參基因，以羊草葉、莖、根、穗為研究材料，利用qRT-PCR技術(shù)分析TUA、TUB、18SrRNA、EF-1α、APRT、CYP、Actin和CBP20共8個常用候選管家基因的表達情況，并使用geNorm和NormFinder軟件進行綜合評價，以期篩選出羊草不同組織中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。結(jié)果表明，8個候選內(nèi)參基因在羊草不同組織表達穩(wěn)定性不同，其中，葉片中穩(wěn)定性較高的內(nèi)參基因是Actin；莖中穩(wěn)定性較高的內(nèi)參基因是EF-1a；根中穩(wěn)定性較高的內(nèi)參基因是APRT和18SrRNA；穗中穩(wěn)定性較高的內(nèi)參基因是TUB。本研究結(jié)果將為開展羊草功能基因的表達分析提供重要參考。

羊草；qRT-PCR；內(nèi)參基因；組織

實時定量PCR(real-time quantitative PCR)是一種PCR技術(shù)，常用于基因表達檢測，具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好以及高通量等優(yōu)點[1]，已成為當(dāng)今植物分子生物學(xué)領(lǐng)域檢測基因表達與轉(zhuǎn)錄組分析等研究的重要方法之一[2]。qRT-PCR包括絕對定量和相對定量兩種方式，常用到的是相對定量。在相對定量檢測中，通常會選擇內(nèi)參基因來校正數(shù)據(jù)，用來消除試驗過程中如RNA提取質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄cDNA效率及PCR反應(yīng)條件可能帶來的差異，使目的基因在試驗樣品中表達數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。

在qRT-PCR中，使用穩(wěn)定的內(nèi)參基因是精準(zhǔn)試驗數(shù)據(jù)的前提[3]。理想的內(nèi)參基因，應(yīng)該是在所有的生理狀態(tài)下都能穩(wěn)定地表達。然而，有大量研究證實，在同一物種的不同生長時期、不同組織部位以及不同培養(yǎng)條件下，始終穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因是不存在的[4]。因此，實時熒光定量PCR中內(nèi)參基因的篩選和穩(wěn)定性評價至關(guān)重要。目前，已有不少關(guān)于植物內(nèi)參基因篩選評價的研究報道。如小麥(Triticumaestivum)[5]、水稻(Oryzasativa)[6]、玉米(Zeamays)[7]、大豆(Glycinemax)[8]、茶樹(Camelliasinensis)[9-10]、刺槐(Robiniapseudoacacia)[11]、蘋果(Malusdomestica)[12]、松葉豬毛菜(Salsolalaricifolia)[13]、大針茅(Stipagrandis)[14-15]等。

羊草(Leymuschinensis)又名堿草，為禾本科多年生C3草本植物，是生長在歐亞大陸草原的一種優(yōu)質(zhì)牧草，具有抗寒、抗旱、耐鹽堿等特性。目前，有關(guān)羊草的研究報道有很多，但主要集中在放牧利用[16]、功能性狀[17]以及生理生化處理[18]等方面，還沒有任何關(guān)于羊草實時熒光定量PCR內(nèi)參基因篩選的報道。本研究選取8個候選內(nèi)參基因，包括α-微管蛋白基因TUA、β-微管蛋白基因TUB、核糖體18SrRNA、轉(zhuǎn)錄延伸因子EF-1α、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶基因APRT、親環(huán)蛋白基因CYP、肌動蛋白基因Actin、類胡蘿卜素結(jié)合蛋白基因CBP20；采用qRT-PCR技術(shù)，結(jié)合geNorm 和NormFinder軟件對候選的8個內(nèi)參基因在羊草不同組織間的表達穩(wěn)定性進行評價，以期篩選出在羊草各組織相對穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，為羊草研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料處理

本試驗選用“吉生4號”羊草種子，先用5%次氯酸鈉對種子進行消毒處理，后用無菌水沖洗干凈，種植在20 cm (高)×16 cm(內(nèi)徑)花盆中，在恒溫培養(yǎng)箱(Percival、美國)中進行25 ℃，16 h光照、8 h黑暗培養(yǎng)，正常澆水管理。待生長至抽穗期，選取生長良好的羊草，取不同生長器官(根、莖、葉、穗)，用蒸餾水清洗并擦干，錫紙包裹，液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。每組樣品設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 羊草總RNA的提取及cDNA的合成 取100 mg羊草不同組織樣品，置于研缽中，液氮條件下充分研磨，使用Trizol法提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸質(zhì)量。取1 μg總RNA，使用Prime ScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄羊草cDNA第一鏈，并將合成的cDNA置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 內(nèi)參基因的定量PCR引物設(shè)計 本研究選取了8個常見內(nèi)參(TUA、TUB、18SrRNA、EF-1α、APRT、CYP、Actin和CBP20)作為羊草的候選內(nèi)參基因，其中，Actin序列來源于GenBank(HM623326.1)，其它7個基因均為農(nóng)業(yè)部牧草資源與利用重點實驗室自行擴增,由華大生物技術(shù)有限公司測序所得，尚未登錄信息。利用PerlPrimer v.1.1.21軟件，結(jié)合qRT-PCR引物設(shè)計原則設(shè)計各內(nèi)參基因的qPCR引物。所有引物由華大生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

1.2.3 內(nèi)參基因的普通PCR擴增 PCR擴增反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL 2×Taq Master Mix(康為世紀(jì))，10 μmol·L-1的上、下游引物各1 μL，0.5 μL cDNA和7.5 μL RNase-Free Water。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。最后用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.2.4 內(nèi)參基因的熒光定量PCR分析 qRT-PCR反應(yīng)體系為20.0 μL：SYBR?Select Master Mix(2×) 10.0 μL，上、下游引物(10 mol·L-1)各0.4 μL， cDNA模板1 μL，8.2μL ddH2O，每個樣品技術(shù)重復(fù)3次。反應(yīng)在Applied Biosystems StepOnePlusTM實時定量PCR儀(USA)上進行，qRT-PCR反應(yīng)程序參照試劑盒說明書，95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40個循環(huán)；擴增結(jié)束后，在95 ℃獲取熔解曲線，通過分析熔解曲線來確定擴增產(chǎn)物特異性。

表1 8個內(nèi)參基因的定量PCR引物Table 1 Primers used for 8 reference genes in qRT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用geNorm和NormFinder軟件，對8個常用內(nèi)參基因在羊草不同組織器官的表達穩(wěn)定性進行統(tǒng)計學(xué)分析。geNorm軟件是通過分析內(nèi)參基因在不同試驗樣品中的表達穩(wěn)定性值(expression stability value，M)來確定內(nèi)參基因穩(wěn)定性的，其中，M值越小,表示基因表達越穩(wěn)定；反之，M值越大,則基因表達越不穩(wěn)定[19]。NormFinder軟件通過計算不同試驗樣品各內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值(stability value，SV)來確定最優(yōu)的內(nèi)參基因，SV值越小表示該基因表達越穩(wěn)定[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總RNA提取與質(zhì)量檢測

羊草各組織樣品總RNA的提取采用Trizol法，將提取得各組織總RNA進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所提取的樣品總RNA譜帶清晰，較為完整(圖1)。用NanoDrop2000c檢測總RNA，其A260/A280均在1.8～2.1，A230/A260在2.0左右。以上檢測結(jié)果證實所提取羊草樣品總RNA完整性好，純度高，可進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

2.2 內(nèi)參基因引物特異性分析

使用羊草葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進行PCR擴增，得到的擴增產(chǎn)物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的擴增基因片段特異性良好，片段大小也和預(yù)測的結(jié)果一致(圖2)。再分別以羊草葉、莖、根和穗4種組織樣品的cDNA為模板進行qRT-PCR檢測，所有基因均得到明顯的單峰熔解曲線，擴增曲線重復(fù)性較好，說明各內(nèi)參基因產(chǎn)物特異性好，不存在引物二聚體，因此證實qRT-PCR的檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

圖1 羊草不同組織樣品總RNA電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis of total RNA from different tissues of Leymus chinensis

圖2 8個內(nèi)參基因的PCR產(chǎn)物Fig. 2 PCR produces of 8 reference genes

2.3 內(nèi)參基因的Ct值分析

在qRT-PCR中，基因Ct值(Cycle threshold，循環(huán)閾值)的大小反映其表達量，即Ct值越大，基因表達量越低；Ct值越小，基因表達量越高。本研究中8個內(nèi)參基因Ct值都處于10(18SrRNA)至28(TUB)之間，其中TUB的Ct值最大，在24～30；18SrRNA的Ct值最小，在10～13；TUA、CYP和Actin的Ct值均在20～25；APRT、EF-1α和CBP20的Ct值均處于23～27(圖3)。該結(jié)果表明，8個內(nèi)參基因的表達量存在差異。

圖3 8個內(nèi)參基因Ct值分布圖Fig. 3 Ct values of 8 reference genes

2.4 內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性分析

2.4.1 geNorm軟件分析 經(jīng)geNorm軟件分析，比較各基因在不同樣品所得表達穩(wěn)定性(M)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以羊草各組織為試驗材料，其內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性存在明顯差異。其中，8個內(nèi)參基因表達在羊草葉、莖、根和穗中穩(wěn)定性由高到底排序分別為(圖4)CYP=TUA>Actin>18SrRNA>APRT>EF-1α>TUB>CBP20；EF-1α=APRT>18SrRNA>TUB>TUA>Actin>CBP20>CYP；CYP=APRT>18SrRNA>TUB>TUA>EF-1α>Actin>CBP20；APRT=Actin>TUB>CYP>CBP20>EF-1α>18SrRNA>TUA。即在羊草葉片表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CYP和TUA、最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CBP20；在莖中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是EF-1a和APRT，最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CYP；在根部表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CYP和APRT，最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CBP20；在穗中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是APRT和Actin，最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是TUA。

2.4.2 NormFinder軟件分析 利用NormFinder軟件將所有處理的樣品進行內(nèi)參基因表達分析，通過比較各內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值，得到的結(jié)果如表2所示：在羊草葉、莖、根和穗4種組織中，8個內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性由高到底排序分別為APRT=18SrRNA>Actin>EF-1α>CYP>TUA>TUB>CBP20；EF-1α=APRT>18SrRNA>TUB>TUA>CBP20>Actin>CYP；TUB>18SrRNA>APRT>CYP=EF-1α>TUA>Actin>CBP20；CYP>TUB>CBP20>Actin>APRT>EF-1α>18SrRNA>TUA。即在羊草葉片表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是APRT和18SrRNA；在羊草莖中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是EF-1a和APRT；在羊草根部表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是TUB，其次是18SrRNA和APRT；在羊草穗中表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CYP，其次是TUB、CBP20。

圖4 geNorm軟件評價內(nèi)參基因表達穩(wěn)定值Fig. 4 Expression stability values of the reference genes evaluated by geNorm

表2 羊草不同組織器官中8個內(nèi)參基因穩(wěn)定性的NormFinder分析Table 2 Analysis of the stabilities of 8 reference genes in different tissues value of Leymus chinensis by NormFinder

2.5 羊草各組織中最佳內(nèi)參基因的選擇

綜合比較geNorm和NormFinder兩種軟件對羊草葉片、莖、根和穗中8個候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性評估結(jié)果(表3)，發(fā)現(xiàn)geNorm和NormFinder的評價結(jié)果存在差異，導(dǎo)致內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序不一致。但表達穩(wěn)定性排名前三的基因存在部分重疊，故選擇重疊基因作為每個組織的最佳管家基因。在葉片中選擇Actin作為內(nèi)參基因；在莖中選擇EF-1a作為內(nèi)參基因；在根中選擇APRT和18SrRNA作為內(nèi)參基因；在穗中選擇TUB作為內(nèi)參基因。

3 討論與結(jié)論

近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參基因穩(wěn)定性根據(jù)環(huán)境和品種不同而變化，穩(wěn)定內(nèi)參基因的選擇是基因表達定量分析的關(guān)鍵因素。目前，國內(nèi)外關(guān)于內(nèi)參基因篩選的報道有很多[20-24]。最初，Actin被認(rèn)為是在植物各個生長時期及各組織部位均穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因[25]。在茶樹[9]和刺槐[11]的不同組織定量PCR穩(wěn)定內(nèi)參篩選中，Actin基因表達最穩(wěn)定。在楊樹(Populus)葉片與根系中Actin也是表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[26]。Actin基因在鹽生草(Halogetonglomeratus)材料中高度保守且表達量恒定，可作為內(nèi)參[27]。

表3 8個內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性geNorm和NormFinder比較Table 3 Comparison of expression stability of 8 reference genes generated by geNorm and NormFinder

有研究證明，常用的傳統(tǒng)內(nèi)參基因也會出現(xiàn)表達不穩(wěn)定的情況。如在矮牽牛(Petuniahybrida)葉與花組織研究中，Actin基因表達不夠穩(wěn)定，EF-1a和CYP被確定為最佳內(nèi)參基因組合[24]。在白菜(Brassicarapassp.pekinensis)[28]、黃瓜(Cucumissativus)[29]內(nèi)參篩選中，EF-1a基因也被證實表達最穩(wěn)定。該基因在小麥不同組織[3]以及在茶樹不同成熟葉片[9]中均表現(xiàn)出較高的表達穩(wěn)定性。這說明EF-1a基因在某些組織研究中比Actin基因更適合選作內(nèi)參基因。由此可見，在實際研究中各內(nèi)參基因均在特定的生長時期、組織或條件下相對表達穩(wěn)定。從本研究對羊草不同組織中8個常用內(nèi)參基因的表達分析可以看出，并沒有一個基因在所有組織中都穩(wěn)定表達。EF-1a在羊草莖組織表達最穩(wěn)定；而Actin基因在羊草葉片組織中表達較穩(wěn)定，在其它組織中表達穩(wěn)定性不是最佳。同樣，18SrRNA基因在羊草根、莖組織中表達相對穩(wěn)定，但在羊草穗中表達穩(wěn)定性較差。有研究認(rèn)為，在qRT-PCR檢測中，18SrRNA的目標(biāo)mRNA轉(zhuǎn)錄豐度不精確，故18SrRNA基因不可作為內(nèi)參基因[13]。

本研究中，選用兩個不同的內(nèi)參穩(wěn)定性評價軟件分析得到的結(jié)果存在差異，導(dǎo)致內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序不一致。該現(xiàn)象在其它研究中也有存在，如在大豆[30]，柑橘(Citrusreticulata)[31]，二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)[32]等內(nèi)參基因的研究中，均出現(xiàn)類似結(jié)果，推測可能是分析軟件的統(tǒng)計學(xué)原理不同造成了這種差異[30]。綜合數(shù)據(jù)分析，雖然評價結(jié)果存在差異，但表達穩(wěn)定性較高的基因存在部分重疊，故選擇重疊基因作為每個組織的最佳管家基因。即在羊草葉片組織中，Actin基因表達相對穩(wěn)定；莖組織中，EF-1a基因表達最穩(wěn)定；根系組織中，APRT和18SrRNA基因表達相對穩(wěn)定；而在穗組織中，基因TUB表達較穩(wěn)定。本研究結(jié)果將為開展羊草功能基因的表達分析提供參考。

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(責(zé)任編輯 王芳)

Selection of reference genes for quantitative real-time PCR ofLeymuschinensisin different tissues

Hu Ning-ning1,2, Guo Hui-qin3, Li Xi-liang1, Kong Ling-qi1, Wu Zi-nian1, Zhang Ji-ze1, Chang Chun1, Wan Dong-li1, Zang Hui1,2, Ren Wei-bo1
(1. Grassland Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hohhot 010010, China; 2.Graduate School of Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100081, China; 3.College of Life Science Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

To explore the optimal reference genes in different tissues ofLeymuschinensisfor a quantitative real-time PCR experiment, eight general housekeeping genes includingTUA,TUB, 18SrRNA,EF-1α,APRT,CYP,ActinandCBP20 were selected as candidate reference genes. Using roots, stems, leaves, and spikes ofL.chinensis, we analyzed the 8 candidate reference gene expressions using qRT-PCR and evaluated their expression stability using geNorm and NormFinder software. The results showed that stability differed significantly among the eight candidate reference genes in different tissues. The most stable reference gene wasActinin leaves,EF-1ain stems,APRTand 18SrRNAin root andTUBin spikes. The present study has provided an important reference for analysis the expression of functional genes inL.chinensis.

Leymuschinensis; qRT-PCR; reference gene; tissue

Ren Wei-bo E-mail:rppcaucau@163.com

2016-10-08 接受日期：2016-12-12

國家重點基礎(chǔ)研究計劃973項目(2014CB138804)；國家自然科學(xué)基金(31502008)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費

胡寧寧(1991-)，女，陜西榆林人，在讀碩士生，主要從事羊草功能基因研究。E-mail：huningning317@163.com

任衛(wèi)波(1979-)，男，山西晉城人，副研究員，博士，主要從事牧草分子生物學(xué)研究。E-mail：rppcaucau@163.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0510

S543+.9;Q943.2

A

1001-0629(2017)07-1434-08

胡寧寧,郭慧琴,李西良,孔令琪,武自念,張繼澤,常春,萬東莉,臧輝,任衛(wèi)波.羊草不同組織實時定量PCR內(nèi)參基因的篩選.草業(yè)科學(xué),2017,34(7)：1434-1441.

Hu N N,Guo H Q,Li X L,Kong L Q,Wu Z N,Zhang J Z,Chang C,Wan D L,Zang H,Ren W B.Selection of reference genes for quantitative real-time PCR ofLeymuschinensisin different tissues.Pratacultural Science，2017,34(7)：1434-1441.