（菏澤市中心血站,山東菏澤274000）

冰凍紅細胞甘油化與去甘油化的改進

張成松

（菏澤市中心血站,山東菏澤274000）

目的探討在冰凍紅細胞去甘油化時添加適量的蔗糖溶液，提高紅細胞回收率的可行性。方法選擇6天內(nèi)制備的400 ml去白懸浮紅細胞60袋，制備成冰凍紅細胞，置于-80℃～-65℃的冰箱內(nèi)保存，在保存4個月后取出解凍去甘油化，并隨機分成實驗組和對照組，每組各30袋。實驗組在去甘油化過程中的第1次洗滌液改用10%的蔗糖溶液，第2次洗滌液改用10%的蔗糖溶液，對照組仍用0.9%的氯化鈉溶液進行洗滌，然后分別比較兩組的紅細胞回收率，甘油殘留量和去甘油化過程中的各個洗滌階段的游離血紅蛋白含量。應(yīng)用SPSS13.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用方差分析、t檢驗。結(jié)果兩組紅細胞回收率比較，P＜0.0005；，甘油殘留量比較，P＞0.05。兩組去甘油化第1次洗滌比較，P＜0.0005；第2次洗滌、第3次洗滌、第4次洗滌比較，P＞0.05。結(jié)論冰凍紅細胞去甘油化過程中第一階段的洗滌過程非常重要，對紅細胞進行保護，可以顯著提高紅細胞回收率。

冰凍紅細胞；甘油化；去甘油化；室溫平衡；蔗糖溶液

紅細胞深低溫冰凍保存技術(shù)是長期保存紅細胞的有效方法，可以保存10年。紅細胞能夠長期保存，對于稀有血型患者輸血，調(diào)節(jié)血液供需平衡，自體輸血技術(shù)的開展都具有十分重要的意義。紅細胞冰凍保存技術(shù)分為快速冷凍法和慢速冷凍法[1]，現(xiàn)多采用慢速冷凍法。慢速冷凍法紅細胞冰凍保存需要添加一定的保護劑，甘油是紅細胞冰凍保存最常用的添加保護劑[2]?，F(xiàn)階段紅細胞冰凍保存的方法是對紅細胞進行甘油化。當甘油濃度達到20%時置于-120℃保存，達到40%時置于-65℃以下保存。紅細胞臨床輸注前，一定要洗滌去甘油化，冰凍解凍紅細胞內(nèi)甘油殘留量過高容易引起溶血[3]。冰凍紅細胞解凍去甘油化的質(zhì)量控制目標主要是提高紅細胞的回收率，降低甘油殘留量和降低血漿游離血紅蛋白含量。為了提高產(chǎn)品質(zhì)量，在整個制備過程中一定要嚴格控制關(guān)鍵點?，F(xiàn)階段冰凍紅細胞去甘油化時普遍采用不同濃度梯度氯化鈉溶液分次洗滌，其臨床輸血效果是良好的，但還有改進空間。通過實驗發(fā)現(xiàn)，在冰凍紅細胞去甘油化過程中的第1階段和第2階段中，洗滌液改用10%的蔗糖溶液[4]，可顯著提高紅細胞回收率?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料選擇6天內(nèi)制備的400 ml去白懸浮紅細胞60袋，將懸浮紅細胞和甘油一起放入37℃的水浴箱中水浴，水浴20 min后取出懸浮紅細胞和甘油。懸浮紅細胞用無菌接駁機無菌連接于適宜于冰凍保存的800 ml專用血袋，將紅細胞轉(zhuǎn)移到800 ml新袋內(nèi)，并正確轉(zhuǎn)移對應(yīng)的獻血碼標識。按紅細胞離心程序離心后去除上清液。全自動血細胞處理儀ACP215預(yù)先開機，選擇甘油化程序，正確安裝一次性使用血液甘油化管路后緩慢滴加57%的復(fù)方甘油溶液至紅細胞袋內(nèi)（1個單位紅細胞加甘油160 ml，2個單位紅細胞加甘油320 ml），邊加邊振蕩，振蕩頻率為150次/min。甘油化程序結(jié)束后室溫平衡30 min，再放入-80℃～-65℃的冰箱內(nèi)保存。

1.2 方法60袋冰凍紅細胞從冰箱取出后，立即放入37℃的水浴箱中融化，并輕緩搖動，加速其融化。去甘油化時，把紅細胞隨機分為對照組和實驗組，每組各30袋。實驗組在去甘油化的第一階段洗滌液改用10%的蔗糖溶液500 ml，第2階段洗滌液改用濃度為10%的蔗糖溶液500 ml。分別于每次離心結(jié)束后去除上清液，充分混勻紅細胞后留取標本5 ml進行紅細胞回收率和甘油殘留量的測定，實驗組紅細胞回收率兩次測定結(jié)果的均值為（83.99±1.58），甘油殘留量兩次測定結(jié)果的均值為（0.36±0.03）。對照組在去甘油化的第一階段的洗滌液選用0.9%的氯化鈉溶液500 ml，第二階段的洗滌液選用0.9%的氯化鈉溶液500 ml，同樣是分別于每次離心結(jié)束后去除上清液，充分混勻紅細胞后留取標本5 ml進行紅細胞回收率和甘油殘留量的測定，對照組紅細胞回收率兩次測定結(jié)果的均值為（81.79±2.07），甘油殘留量兩次測定結(jié)果的均值為（0.35±0.09）。然后對比兩組的紅細胞回收率和甘油殘留量。冰凍紅細胞去甘油化時需要洗滌四次，實驗組在第一次和第二次的洗滌過程中洗滌液均選用10%的蔗糖溶液500 ml，實驗組在第三次和第四次洗滌的過程中洗滌液均選用0.9%的氯化鈉溶液500 ml。對照組四次洗滌過程中每次均選用0.9%的氯化鈉溶液500 ml。每次洗滌過程結(jié)束后都留取上清液標本5 ml進行血漿游離血紅蛋白含量的測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用方差分析、t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組紅細胞回收率和甘油殘留量比較見表1。

2.2 冰凍紅細胞去甘油化時不同洗滌次數(shù)后血漿游離血紅蛋白含量比較見表2。

表1 紅細胞回收率及甘油殘留量()

表1 紅細胞回收率及甘油殘留量()

兩組紅細胞回收率比較，t=4.6272，P＜0.0005；甘油殘留量比較，t=0.57735，P＞0.05。

組別n紅細胞回收率（%）甘油殘留量（g/L）實驗組30 83.99±1.58 0.36±0.03對照組30 81.79±2.07 0.35±0.09

表2 去甘油化不同洗滌次數(shù)后血漿游離血紅蛋白含量比較（mg/l,）

表2 去甘油化不同洗滌次數(shù)后血漿游離血紅蛋白含量比較（mg/l,）

兩組去甘油化第1次洗滌，t=11.160，P＜0.0005；第2次、第3次、第4次洗滌，t=0.96604、0.62487、0.12487，P＞0.05

組別n第1次洗滌第2次洗滌第3次洗滌第4次洗滌實驗組30 239.19±33.48 182.07±21.78 121.03±10.39 33.37±2.62對照組30 350.57±43.21 187.63±22.79 123.27±16.66 33.47±3.51

3 討論

冰凍紅細胞的優(yōu)點是可以長期的保存紅細胞，可以保存10年。通常用于自身儲存式輸血和稀有血型紅細胞的保存。可以非常有效的解決稀有血型患者的搶救性輸血問題。

紅細胞冰凍保存的方法分為快速和慢速冷凍法，但是快速冷凍法要頻繁更換液氮，還需要復(fù)雜的控溫儀器，在我國難以推廣。甘油化紅細胞深低溫(-80℃)冰凍保存，是目前能夠長期保存紅細胞的最好方法。但冰凍紅細胞在甘油化時的整個過程都有可能導(dǎo)致溶血的發(fā)生，影響到了紅細胞的收集。所以，在紅細胞甘油化的過程中，加入甘油的速度一定不要太快，控制在15～20 min內(nèi)加完。

在冰凍紅細胞甘油化過程中，一定要將紅細胞和甘油溶液在37℃水浴箱中水浴15 min后，再緩慢滴加甘油于紅細胞袋內(nèi)，這樣可以保證紅細胞和甘油溶液溫度一致，二者相遇時可以充分融合，降低冰點損害[5]。

在甘油化的過程中，一定要邊加邊振蕩，但是振蕩設(shè)定的速率不要過大，以避免紅細胞發(fā)生破裂，產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，影響實驗室檢查結(jié)果，振蕩速率以150次/min為宜。甘油化程序結(jié)束后，要在室溫中靜止平衡30 min后再冰凍，以保證甘油均勻分布于紅細胞袋內(nèi)。要排凈血袋內(nèi)的空氣，如果血袋內(nèi)的空氣太多，大的氣泡形成過程中，小氣泡不斷破裂，這樣對紅細胞是一個損害。血袋內(nèi)如有較多的氣體，在冰凍保存的過程中，氣體較多部位容易破裂，造成血液的報廢。

紅細胞在冰凍保存時，生物代謝隨著保存溫度的降低而變慢。血液在零度以下保存時，細胞損傷主要來自細胞脫水引起的化學(xué)損傷和細胞內(nèi)冰晶形成和增長導(dǎo)致的機械性損傷。因此，在冰凍紅細胞去甘油化的第一個階段，采取措施對紅細胞膜進行保護，就可以相應(yīng)減少紅細胞的破裂，是提高紅細胞回收率的關(guān)鍵階段。

冰凍紅細胞脫離低溫環(huán)境后，要快速放入37℃水浴箱中，水量要能夠完全覆蓋紅細胞袋，打開振蕩開關(guān)，輕緩振搖，使結(jié)晶的紅細胞快速融化[6]，但不要用力擠壓血袋，以減少紅細胞在融化過程中的機械性損傷，減少溶血的發(fā)生。

現(xiàn)階段，冰凍紅細胞去甘油化時，采用了鹽溶液滲透壓梯度遞減的方法進行。通常是先加入9%的氯化鈉溶液（1個單位的紅細胞加入80 ml，2個單位加入160 ml）。充分混勻后，用0.9%的氯化鈉溶液分次洗滌，最后再用生理鹽水混懸，即成冰凍解凍去甘油紅細胞。但是在紅細胞的去甘油化過程中，鹽溶液滲透壓梯度的變化，可以對紅細胞造成損害，部分紅細胞破裂造成溶血。如果在去甘油化時，加入適宜濃度非電解質(zhì)的蔗糖溶液，就會使紅細胞袋內(nèi)的電解質(zhì)濃度相應(yīng)降低，離子間的引力相對減少，與脂蛋白結(jié)合的球蛋白之間又可以相互結(jié)合起來，這樣可以使紅細胞聚集。紅細胞聚集后，就可以減少洗滌過程對紅細胞膜的沖擊力，從而降低紅細胞溶血的發(fā)生，就可以提高紅細胞的回收率。最后一次洗滌完畢，加入電解質(zhì)生理鹽水后，離子間引力增加，紅細胞又會呈現(xiàn)出懸浮狀態(tài)，且蔗糖溶液本身是一種營養(yǎng)物質(zhì)，后續(xù)的洗滌過程也會有效的清除蔗糖溶液的殘留，因此，不會增加臨床輸血反應(yīng)的發(fā)生。

為了選擇出合適的蔗糖溶液濃度，選用8%、10%、12%、14%的蔗糖進行一系列的預(yù)實驗，對每次實驗結(jié)果都要測定紅細胞回收率，甘油殘留量，血漿游離血紅蛋白含量。通過實驗分析，發(fā)現(xiàn)在去甘油化的第一階段選用10%的蔗糖溶液，可以明顯提高紅細胞的回收率。相同的方法，確定第二階段的洗滌液中同樣選用10%的蔗糖溶液。在后續(xù)的洗滌過程中，因為鹽水梯度變化已經(jīng)很小了，不再添加蔗糖溶液[7]。

冰凍紅細胞在甘油化和去甘油化過程中的關(guān)鍵，是要降低對紅細胞的損害，提高紅細胞的回收率。在制備過程中，要對關(guān)鍵點進行嚴格質(zhì)量控制。去甘油化時采用改進后的方法，顯著提高了紅細胞的回收率（P＜0.05）。而且，采用此方法制備的冰凍解凍去甘油紅細胞，完全符合全血和成分血質(zhì)量標準[8]。

[1]安乃新,于衛(wèi)建.輸血技術(shù)學(xué)[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻出版社, 2010：165-167.

[2]姜慶紅,楊景春.細胞洗滌機去甘油化技術(shù)應(yīng)用[J].中國保健營養(yǎng),2016,26(5)：319.

[3]趙高偉.甘油殘留量測定方法改進性能確認[J].中國輸血雜志, 2016,29（3）：308-310.

[4]紀宏革,王麗,胡喬,等.甘油對冰凍解凍紅細胞質(zhì)量的影響探討[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2016,37(4)：564-565.

[5]王惟.冰凍紅細胞甘油化時適宜溫度的研究[J].臨床輸血與檢驗, 2016,18（5）：505-506.

[6]王凱,陳新,張網(wǎng)蘭,等.應(yīng)用MAP在4℃條件下保存冰凍解凍去甘油紅細胞的質(zhì)量變化[J].臨床輸血與檢驗,2015,17（1）：74-75.

[7]于來水,康煒,宮本蘭,等.冰凍紅細胞解凍洗滌液的改良性研究[J].臨床輸血與檢驗,2016,18（2）：149-151.

[8]王凱.冰凍解凍去甘油紅細胞使用MAP懸浮液對紅細胞保存期的影響[D].蘇州：蘇州大學(xué)：2015.

The Glycerin and to Glycerol of Frozen Red Blood Cells

Zhang Chengsong
(The Blood Stations of Heze City,Heze 274000,Shandong)

Objective To explore the frozen red blood cells when to glycerol to add just the right amount of sucrose solution,increasing the recovery ratio of red blood cells.Methods Choose 400 ml of the preparation of 6 days to 60 bag white suspended red blood cells,preparation of frozen red blood cells,under-80℃～-65℃refrigerator save,save 4 months later to take out the thaw to glycerol,and randomly divided into experimental group and control group,each group 30 bags. Experimental group in the first washing liquid in the process of use to glycerin 10%sucrose solution,second washing liquid to switch to 10%sucrose solution,the control group still washing with 0.9%sodium chloride solution,and then respectively to compare two groups of red blood cells,recovery of glycerin residues and to glycerol in the process of free hemoglobin content in all stages of washing.Using SPSS13.0 software,the data obtained using analysis of variance andttest. Results Two groups of red blood cells recovery,deltaP＜0.0005;Residue,glycerin,P＞0.05.Two groups to glycerol first washing comparison,P＜0.0005.Second washing,3 times of washing,4 times of washing,P＞0.05.Conclusion Frozen red blood cells to glycerin is changed in the process of the first stage of the washing process is very important,to protect the red blood cells can significantly improve erythrocyte recovery.

Frozen red blood cells;Glycerolize;To remove glycerol;Room temperature balance;Sucrose solution

R331.141;R457

：A

：1008-4118（2017）02-0066-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2017.02.023

2017-03-24