薛迎迎(連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校中醫(yī)藥系，江蘇連云港 222007)

響應(yīng)面法優(yōu)化微生物萃取轉(zhuǎn)化制備L-苯基乙酰基甲醇的工藝

薛迎迎＊(連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校中醫(yī)藥系，江蘇連云港 222007)

目的:優(yōu)化微生物萃取轉(zhuǎn)化制備L-苯基乙?；状?L-PAC)的條件。方法:以啤酒酵母萃取制備L-PAC。采用高效液相色譜法測定L-PAC濃度。以L-PAC濃度為響應(yīng)值，通過Box-Behnken響應(yīng)面法對苯甲醛、曲拉通(Triton)X-100和葡萄糖用量這3個主要因素進行考察，同時進行驗證試驗。結(jié)果:苯甲醛和Triton X-100之間的交互作用最為顯著，最優(yōu)因素組合為苯甲醛1.1%、Triton X-100 0.14 g/m L、葡萄糖0.028 g/m L;驗證試驗中L-PAC的平均濃度為28.04mmol/L(RSD=1.35%，n=3)，與預(yù)測值28.01 mmol/L的相對誤差為0.11%。結(jié)論:利用響應(yīng)面法對微生物萃取轉(zhuǎn)化制備L-PAC的條件進行了優(yōu)化，得到了各因素的最優(yōu)組合，可為大批量轉(zhuǎn)化制備L-PAC提供有利參考。

響應(yīng)面法;微生物萃取轉(zhuǎn)化;L-苯基乙酰基甲醇

麻黃是我國重要的中藥資源之一，用于治療風(fēng)寒感冒、胸悶喘咳、風(fēng)水浮腫、支氣管哮喘等病癥[1]。麻黃的主要有效成分是麻黃堿和偽麻黃堿。麻黃堿具有興奮中樞神經(jīng)、收縮毛細血管、增強心肌收縮力等功能。近年來，因濫采濫挖導(dǎo)致野生麻黃資源匿乏，使得麻黃堿產(chǎn)量不足，因此開發(fā)化學(xué)、生物等途徑合成麻黃堿及偽麻黃堿的關(guān)鍵中間體L-苯基乙?；状?L-phenylacetylcarbinol，L-PAC)具有重要意義。

啤酒酵母在非離子表面活性劑曲拉通X-100(Triton X-100)溶液中具有較好的生物相容性[2]，可用于在膠束溶液中經(jīng)微生物萃取轉(zhuǎn)化制備L-PAC。本文采用Box-Behnken響應(yīng)面法，分析底物苯甲醛、表面活性劑Triton X-100和輔底物葡萄糖用量3個主要因素對L-PAC生成濃度的影響，以獲取最優(yōu)的轉(zhuǎn)化條件，為大批量轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-PAC提供有利參考。

1 材料

1.1 儀器

HZQ-Q全溫振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);Waters600高效液相色譜儀(HPLC)，包括Waters 600泵、Waters 486紫外檢測器和Waters PC 800工作站(美國Waters公司)。

1.2 菌種與試劑

啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)購于中國科學(xué)院微生物研究所;Triton X-100、L-PAC標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司，批號:BFBD20152V、K37218-719，純度:＞98%);葡萄糖、苯甲醛(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號: 20160108、151201，均為分析純);乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 濕酵母細胞的培養(yǎng)

每100m L去離子水中加入葡萄糖3 g、蛋白胨2 g、酵母膏1 g，混勻后用移液管吸取50m L分別裝入250 m L三角瓶中，紗布密封，置于30℃、200 r/m in振蕩器中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液經(jīng)2 500 r/min離心(離心半徑:10 cm)5min，收集濕酵母細胞作為后續(xù)微生物萃取轉(zhuǎn)化的催化劑。

2.2 微生物萃取轉(zhuǎn)化

每100m L去離子水中加入蛋白胨2 g、酵母膏1 g、七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.1 g、二水氯化鈣(CaCl2· 2H2O)0.005 g、乙醛0.6m L、濕酵母細胞8 g和苯甲醛、Triton X-100、葡萄糖(苯甲醛、Triton X-100和葡萄糖的用量參考“2.4”項下)，用磷酸氫二鈉和檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH至4.8，混勻后用移液管取10m L分別裝入50m L三角瓶中，紗布密封，置于30℃、200 r/m in振蕩器中微生物萃取轉(zhuǎn)化8 h。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液經(jīng)4 000 r/m in離心(離心半徑:10 cm)5min，取上清液，進樣測定。

2.3 L-PAC濃度測定

2.3.1 L-PAC標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 稱取L-PAC標(biāo)準(zhǔn)品1 g，溶解于200m L無水乙醇中，充分?jǐn)嚢杈鶆?，制得濃度?3mmol/L的L-PAC標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 取“2.2”項下上清液0.5m L，無水乙醇稀釋至1.5m L，即得[3]。

2.3.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱:Hypersil C18(250 mm×4.6mm，5μm);流動相:乙腈-水(30∶70，V/ V);柱溫:30℃;流速:1.0m L/min;檢測波長:283 nm;進樣量:20μL。在此色譜條件下，分別取空白溶液(不加濕酵母細胞，其余處理同“2.2”項下)、“2.3.1”“2.3.2”項下溶液進樣測定。結(jié)果，L-PAC保留時間為9.3m in，分離度＞1.5，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram s

2.3.4 回歸方程與線性范圍 分別精密量取L-PAC標(biāo)準(zhǔn)溶液4、6、8、10、12、14、16μL，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以L-PAC濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進行線性回歸，得回歸方程為y=70 048x(r=0.999 6)，表明L-PAC在1.298 6～30.793 3mmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 方法學(xué)考察 按照相關(guān)要求進行操作。結(jié)果，在重復(fù)性試驗、穩(wěn)定性試驗和精密度試驗中，L-PAC峰面積的RSD分別為1.2%(n=6)、0.11%(n=7)、0.09% (n=6)，表明重復(fù)性、穩(wěn)定性和精密度均良好;加樣回收率為98.17%～101.62%(RSD=1.04，n=6)，表明準(zhǔn)確度較好。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化L-PAC轉(zhuǎn)化生成條件

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選擇顯著影響L-PAC濃度的3個因素，即底物苯甲醛(X1)、表面活性劑Triton X-100(X2)和輔底物葡萄糖(X3)用量為考察變量，產(chǎn)物L(fēng)-PAC的濃度(Y)為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計試驗方案，其他操作條件同“2.2”項下，共設(shè)計15組試驗。因素與水平見表1，Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factorsand levels

表2 Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果Tab 2 Box-Behnken design and results

利用Design Expert7.0.1軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到Y(jié)對X1、X2、X3之間的二次多項回歸方程為Y=26.78-3.43X1+2.92X2-2.64X3+7.21X1X2-2.57X1X3+2.02X2X3-6.94X12-3.54X22-3.96X32。對上述回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Resultsof varianceanalysis

由表3可以看出，模型方程的P=0.000 4＜0.01，說明模型方程極顯著，該試驗方法可靠。模型方程失擬項的P=0.156 8＞0.05，為不顯著，表明未知因素對試驗結(jié)果干擾很小。試驗值與模型方程預(yù)測值的校正決定系數(shù)為0.961 7，表明該模型能解釋96.17%響應(yīng)值隨響應(yīng)因素的變化，模型擬合程度較好。對方程中各項進行顯著性分析，一次項、平方項和交互作用項的P均小于0.05，說明這3個因素以及因素之間的相互作用對響應(yīng)值的影響都是顯著的，其中Triton X-100和苯甲醛的相互作用非常顯著(P=0.000 2)。因此，所得模型方程能夠很好地預(yù)測產(chǎn)物L(fēng)-PAC濃度隨各響應(yīng)因素的變化。

通過Design Expert7.0.1軟件繪制出能夠反映影響產(chǎn)物L(fēng)-PAC濃度的3個因素交互作用的三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖，結(jié)果見圖2。

圖2 三維響應(yīng)面圖和的等高線圖Fig 2 Corresponding surfaceand contourmap

由圖2可知，若等高線圖呈橢圓形則表明兩個因素交互作用顯著，若呈圓形則表明交互作用不顯著[4-5]。3個橢圓形的等高線圖表明X1、X2、X3這3個因素中任意2個因素的交互作用顯著，尤其底物X1和表面活性劑X2的相互作用非常顯著。

2.5 最佳條件的確定及驗證試驗

利用Design Expert7.0.1軟件中的優(yōu)化模塊得到最優(yōu)組合，即:苯甲醛用量為1.1%，Triton X-100用量為0.14 g/m L，葡萄糖用量為0.028 g/m L，相應(yīng)L-PAC濃度的模型預(yù)測值為28.01mmol/L。在最優(yōu)條件下進行微生物轉(zhuǎn)化驗證試驗，操作同“2.2”項下，在轉(zhuǎn)化8 h后，測得L-PAC濃度為28.04mmol/L(RSD=1.35%，n=3)，與模型預(yù)測值28.01mmol/L的相對誤差為0.11%，表明響應(yīng)面設(shè)計得到的工藝條件是有效、可行的。

3 討論

通過圖2A、2B可以看出，苯甲醛單純作用時，其用量較高對L-PAC的生成有強烈的抑制作用。

圖2B、2C顯示，隨著輔底物葡萄糖用量逐漸升高，產(chǎn)物L(fēng)-PAC濃度先增加后降低，這與文獻[6]報道一致。這是因為酵母在葡萄糖用量高時的代謝以發(fā)酵代謝為主，主要產(chǎn)物是乙醇，導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)物L(fēng)-PAC的活性減弱。因此為了得到高濃度的L-PAC，葡萄糖用量必須適當(dāng)。

如圖2B所示，隨著Triton X-100用量的增加，在低苯甲醛濃度時L-PAC濃度逐漸降低，在高苯甲醛濃度時L-PAC濃度逐漸增加。這是由于Triton X-100膠束對底物苯甲醛的萃取增溶作用所致。當(dāng)苯甲醛用量少時，少量的苯甲醛被增溶到Triton X-100膠束中，降低了底物的利用度，導(dǎo)致產(chǎn)物L(fēng)-PAC濃度降低。模型或毒性測定表明增溶到膠束中的底物利用度只有20%[7-9]。當(dāng)苯甲醛用量多時，大量的毒性底物對微生物有強烈的抑制作用，導(dǎo)致L-PAC濃度很低。隨著Triton X-100用量增加，苯甲醛可以被萃取增溶到膠束中，降低了對微生物的毒性作用，使產(chǎn)物L(fēng)-PAC濃度升高。膠束對底物苯甲醛的增溶一方面可以降低底物對微生物細胞的抑制作用，有利于反應(yīng)進行;另一方面卻使底物的利用度降低，不利于轉(zhuǎn)化反應(yīng)。所以在膠束溶液中對于一定量的底物存在一個最優(yōu)的表面活性劑濃度。響應(yīng)面方法可以使表面活性劑和底物的相互作用很直觀地表現(xiàn)出來，能夠有效地優(yōu)化膠束系統(tǒng)中的萃取微生物轉(zhuǎn)化。

非水介質(zhì)用于全細胞轉(zhuǎn)化的前提就是具有良好的生物相容性，但是只有某些非離子表面活性劑對某些特定的微生物才具有生物相容性。非離子表面活性劑溶液的生物相容性是由表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)和微生物種類決定的[10]。Laouar L等[2]報道啤酒酵母在Triton X-100膠束溶液中保持了穩(wěn)定的生物活性，從而使得在Triton X-100膠束溶液中萃取微生物轉(zhuǎn)化制備L-PAC成為可能。

綜上，本研究填補了國內(nèi)外相關(guān)研究的空白，而且利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型方程是有效的，具有較好的預(yù)測性，這將對以后大批量轉(zhuǎn)化制備L-PAC提供有利的參考。

[1]曹道平.保護魯西北平原上重要的中藥資源[J].山東中醫(yī)雜志，1991，10(2):45.

[2]Laouar L，Lowe KC，Mulligan BJ，etal.Yeast responses to nonionic surfactants[J].Enzyme Microb Technol，1996，18 (6):433-438.

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[4]陳凱，李收，金凱，等.Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化吲哚美辛固體脂質(zhì)納米粒處方[J].中國藥房，2016，27(22): 3118-3121.

[5]雷艷萍，石曉峰，劉東彥，等.響應(yīng)面法優(yōu)化雪松松針中總木脂素的提取工藝[J].中國藥房，2016，27(7):939-942.

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[10]薛迎迎.非離子表面活性劑膠束溶液萃取微生物轉(zhuǎn)化的參數(shù)優(yōu)化[D].廣州:華南理工大學(xué)，2010.

(編輯:劉明偉)

Optim ization of Extractive M icrobial Transformation for Producing L-phenylacetylcarbinol by Response Surface M ethod

XUE Yingying(Dept.of TCM，Lianyungang Higher Vocational and Technical College of TCM，Jiangsu Lianyungang 222007，China)

OBJECTIVE:To optimize the conditions of extractive microbial transformation for producing L-phenylacetylcarbinol(L-PAC).METHODS:HPLC was used to determ ine the concentration of L-PAC，which was extracted by saccharmyces cerevisiae.Using L-PAC concentration as response value，Box-Behnken response surface design was adopted to investigate the 3main factors of benzaldehyde，Triton X-100 and glucose dose，and verification test was conducted.RESULTS:The interaction between benzaldehyde and Triton X-100 was themost significant.The optim ized combination was as follows as benzaldehyde of 1.1%，Triton X-100 of 0.14 g/m L，glucose of 0.028 g/m L.The average concentration in verification test of L-PAC was 28.04 mmol/L (RSD=1.35%，n=3)，show ing 0.11%relative error w ith the predicted value of 28.01 mmol/L.CONCLUSIONS:Response surface method has optimized the conditions of extractive microbial transformation for producing L-PAC，obtained optimal combination of each factor，and provided favorable reference for volume-producing L-PAC.

Response surfacemethod;Extractivem icrobial transformation;L-phenylacetylcarbinol

R284.3

A

1001-0408(2017)19-2692-04

2016-12-02

2017-05-03)

＊講師，碩士。研究方向:生物制藥。E-mail:314302095@qq. com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.28