郭 茂，王文明(瀘州市人民醫(yī)院麻醉科，四川瀘州 646000)

右美托咪定對膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制研究

郭 茂＊，王文明(瀘州市人民醫(yī)院麻醉科，四川瀘州 646000)

目的:研究右美托咪定(Dex)對膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制。方法:將小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、微小RNA-146a(m iR-146a)抑制劑(50mg/kg)+Dex(50μg/kg)組和Dex低、中、高劑量組(10、30、50μg/kg)，每組10只。除正常對照組外，其余各組小鼠ip脂多糖建立膿毒癥模型，0.5 h后ip相應(yīng)藥物。藥物干預(yù)6 h后，實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測各組小鼠外周血單核細(xì)胞中m iR-146a表達(dá)及其靶基因白細(xì)胞介素1(IL-1)受體相關(guān)激酶(IRAK1)、腫瘤壞死因子(TNF)受體相關(guān)因子6 (TRAF6)mRNA表達(dá)，Western blot法檢測外周血單核細(xì)胞中IRAK1、TRAF6蛋白的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中TNF-α、IL-6的水平。結(jié)果:與正常對照組比較，模型組小鼠的m iR-146a表達(dá)增強(qiáng)，TNF-α、IL-6水平升高，IRAK1、TRAF6mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)。與模型組比較，Dex中、高劑量組小鼠外周血單核細(xì)胞中m iR-146a表達(dá)增強(qiáng)，TNF-α、IL-6水平下降，IRAK1、TRAF6蛋白表達(dá)減弱(P＜0.05或P＜0.01)，但I(xiàn)RAK1、TRAF6 mRNA表達(dá)變化不明顯(P＞0.05)。與Dex高劑量組比較，m iR-146a抑制劑+Dex組小鼠外周血單核細(xì)胞中m iR-146a表達(dá)減弱，TNF-α、IL-6水平升高，IRAK1、TRAF6蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05或P＜0.01)，但I(xiàn)RAK1、TRAF6mRNA表達(dá)變化不明顯(P＞0.05)。結(jié)論:Dex可抑制膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)m iR-146a表達(dá)、抑制Toll樣受體4/核因子κB通路中的兩個重要接頭蛋白IRAKI和TRAF6的表達(dá)有關(guān)。

膿毒癥;右美托咪定;m iR-146a;炎癥反應(yīng);小鼠;Toll樣受體4/核因子κB

膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，病死率高，常發(fā)生于嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、外科手術(shù)后。機(jī)體受感染因素刺激后激活體內(nèi)炎癥反應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生并釋放大量炎性介質(zhì)，其相互作用并級聯(lián)放大，引起炎癥反應(yīng)失控導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生。目前關(guān)于膿毒癥的治療策略有待深入研究，而闡明與膿毒癥密切相關(guān)的抗炎因子及其調(diào)控機(jī)制，無疑有助于膿毒癥的有效防治。微小RNA(m icroRNA，miR)是一系列單鏈非編碼RNA，通過使mRNA降解或抑制其翻譯調(diào)控基因表達(dá)，密切參與機(jī)體諸多生理、病理過程。研究顯示，m iR-146a與膿毒癥密切相關(guān)，可通過調(diào)控重要的炎癥Toll樣受體4/核因子κB(TLR-4/NF-κB)信號通路發(fā)揮抗炎作用[1-2]。右美托咪定(Dexmedetom idine，Dex)系一種高效的α2腎上腺素受體激動藥，是臨床上應(yīng)用廣泛的麻醉輔助藥，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗焦慮等作用[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，Dex有良好的抗炎、抗氧化效應(yīng)，可發(fā)揮潛在的器官保護(hù)作用[5-6]，那么，Dex的抗炎作用是否與調(diào)節(jié)m iR-146a相關(guān)？本文通過脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥模型，研究Dex對膿毒癥小鼠外周血單核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)及其靶基因白細(xì)胞介素1(IL-1)受體相關(guān)激酶(IRAK1)、腫瘤壞死因子(TNF)受體相關(guān)因子6(TRAF6)mRNA和蛋白表達(dá)，以及血清中炎癥因子TNF-α、IL-6水平的影響，進(jìn)一步探討Dex對膿毒癥小鼠炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

TJ-6低溫離心機(jī)(美國Beckman公司);7500實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)儀(美國ABI公司); H1MF酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司);ChemiDoc Touch Western blot檢測分析儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 藥品與試劑

鹽酸Dex注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號:09081232，規(guī)格:200μg∶2m L);LPS(美國Sigma公司，批號:MFCD00164401，來源于大腸埃希菌O55∶B5，純度:90%);m iR-146a抑制劑(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，批號:B03001，純度:99%);Trizol總RNA提取試劑(美國Invitrogen公司);RIPA細(xì)胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);兔抗IRAK1、TRAF6多克隆抗體(英國Abcam公司);兔抗β-肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體(美國CST公司);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司); m iRNA qRT-PCR試劑盒(美國GeneCopoeia公司);Ficoll-Paque PREM IUM細(xì)胞分離液(瑞典GE公司);熒光定量試劑盒Universal SYBR Green Master(德國Roche公司);TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(美國R&D Systems公司)。

1.3 動物

SPF級BALB/c小鼠60只，♂，體質(zhì)量18～22 g，均購自原瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心，使用許可證號:SYXK (川)2013-065。

2 方法

2.1 模型的建立

[7]方法，采用ip LPS建立小鼠膿毒癥模型，LPS注射劑量為20mg/kg。小鼠注射LPS后出現(xiàn)寒戰(zhàn)、呼吸頻率加快、活動力降低、毛發(fā)聳立、解稀水樣糞便等癥狀即為膿毒癥模型建立成功。

2.2 分組與給藥

將60只小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、m iR-146a抑制劑(50mg/kg)+Dex(50μg/kg)組[8]和Dex低、中、高劑量組(10、30、50μg/kg)[9]，每組10只。除正常對照組小鼠ip生理鹽水0.2m L外，其余各組小鼠ip LPS建立膿毒癥模型;0.5 h后ip相應(yīng)藥物，其中m iR-146a抑制劑ip給藥2 h后ip Dex。

2.3 qRT-PCR法檢測m iR-146a的表達(dá)

給藥6 h后，摘除各組小鼠眼球取血，分離外周血單核細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，以小核RNA U6(snRNA U6)為內(nèi)參，qRT-PCR法檢測m iR-146a的表達(dá)。m iR-146a上游引物為5′-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3′，下游通用引物由miRNA qRT-PCR試劑盒提供，擴(kuò)增長度為100 bp;snRNA U6上游引物為5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′，下游引物為5′-TATGGAACGCTTCACGAATTTGC-3′，擴(kuò)增長度為120 bp。擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性5min;95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。以循環(huán)閾值(ct值)為統(tǒng)計參數(shù)，采用2-ΔΔct法計算相對表達(dá)量。

2.4 Western blot法檢測IRAK 1、TRAF6蛋白的表達(dá)

將小鼠外周血單核細(xì)胞經(jīng)含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液裂解，4℃下12 000×g離心5m in，取上清，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)后，轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。將膜分別置于兔抗IRAK1、TRAF6、β-actin多克隆抗體稀釋液(稀釋比例均為1∶1 000)中，4℃孵育過夜，用PBST(含聚山梨酯20的磷酸鹽緩沖液)洗膜3次，每次10m in;再將膜置于HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG稀釋液中(稀釋比例為1∶10 000)，室溫孵育2 h，PBST洗膜3次，每次10m in。將增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)底物滴加至PVDF膜上，通過Western blot檢測分析儀收集熒光信號，應(yīng)用Quantity One軟件分析蛋白的灰度值，計算相對表達(dá)量。

2.5 qRT-PCR法檢測IRAK 1、TRAF6m RNA的表達(dá)

根據(jù)Trizol總DNA提取試劑說明書提取小鼠外周血單核細(xì)胞總RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit將所得RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行RTPCR檢測IRAK1、TRAF6 mRNA的表達(dá)。引物序列: β-actin上游引物為5′-GATCAAGATCATTGCTCCTCCTGA-3′，下游引物為5′-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3′，擴(kuò)增長度為125 bp;IRAK1上游引物為5′-CCAACATTCCTTGCTTGCCC-3′，下游引物為5′-TCTCTTGTATACCTGTTCCTGGG-3′，擴(kuò)增長度為108 bp;TRAF6上游引物為5′-TGAAGGAGAGAATCAGAGCAAG-3′，下游引物為5′-GCCACACAGCAGTCACTTTC-3′，擴(kuò)增長度為121 bp。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5m in;95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。以循環(huán)閾值(ct值)為統(tǒng)計參數(shù)，采用2-ΔΔct法計算相對表達(dá)量。

2.6 ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6水平

采用ELISA法檢測各組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求操作。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠外周血單核細(xì)胞中m iR-146a表達(dá)情況

正常對照組、模型組、m iR-146a抑制劑+Dex組和Dex低、中、高劑量組小鼠外周血單核細(xì)胞中m iR-146a相對表達(dá)量分別為1.06±0.11、3.36±0.25、4.43±0.45、3.60±0.21、5.46±0.39、8.67±0.46(n=10)。與正常對照組比較，模型組小鼠外周血單核細(xì)胞中m iR-146a表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)。與模型組比較，Dex中、高劑量組小鼠外周血單核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05或P＜0.01)。與miR-146a抑制劑+Dex組比較，Dex高劑量組小鼠外周血單核細(xì)胞中m iR-146a表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)。

3.2 小鼠外周血單核細(xì)胞中IRAK 1、TRAF6m RNA及蛋白表達(dá)情況

與正常對照組比較，模型組小鼠外周血單核細(xì)胞中IRAK1、TRAF6mRNA及蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)。與模型組比較，Dex中、高劑量組小鼠外周血單核細(xì)胞中IRAK1、TRAF6蛋白表達(dá)減弱(P＜0.05或P＜0.01)。與miR-146a抑制劑+Dex組比較，Dex高劑量組小鼠外周血單核細(xì)胞中IRAK1、TRAF6蛋白表達(dá)減弱(P＜0.01)。與模型組比較，m iR-146a抑制劑+Dex組和Dex各劑量組小鼠外周血單核細(xì)胞中IRAK1、TRAF6mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。各組小鼠外周血單核細(xì)胞中IRAK1、TRAF6mRNA及蛋白表達(dá)的測定結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠外周血單核細(xì)胞中IRAK 1、TRAF6 m RNA及蛋白表達(dá)的測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of IRAK 1，TRAF6m RNA and protein exp ressions in them ice peripheral blood mononuclear cells of each group(±s，n=10)

表1 各組小鼠外周血單核細(xì)胞中IRAK 1、TRAF6 m RNA及蛋白表達(dá)的測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of IRAK 1，TRAF6m RNA and protein exp ressions in them ice peripheral blood mononuclear cells of each group(±s，n=10)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與miR-146a抑制劑+Dex組比較，ΔΔP＜0.01Note:vs.normal control group，＊＊P＜0.01;vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01;vs.m iR-146a inhibitor+Dex group，ΔΔP＜0.01

TRAF6組別mRNA相對表達(dá)量IRAK1TRAF6蛋白相對表達(dá)量IRAK1 1.29±0.30 3.40±0.66＊＊3.26±0.56 3.22±0.67 2.79±0.56#2.08±0.58##△△正常對照組模型組miR-146a抑制劑+Dex組Dex低劑量組Dex中劑量組Dex高劑量組1.07±0.13 3.75±0.42＊＊3.97±0.38 3.66±0.45 3.55±0.41 3.54±0.43 1.08±0.15 4.24±0.46＊＊4.41±0.51 4.01±0.42 3.96±0.67 3.88±0.48 1.81±0.68 3.93±0.55＊＊3.50±0.47 3.79±0.21 3.29±0.49#2.30±0.46##△△

3.3 小鼠血清中TNF-α、IL-6水平變化

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平升高(P＜0.01)。與模型組比較，Dex中、高劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平降低(P＜0.05或P＜0.01)。與miR-146a抑制劑+Dex組比較，Dex高劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平降低(P＜0.05)。各組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的測定結(jié)果見表2。

4 討論

炎癥因子的適度釋放是機(jī)體對抗外界刺激、發(fā)揮自身免疫功能所必需的，但是過度的炎癥反應(yīng)會形成炎癥“瀑布”反應(yīng)，則易導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生。重要的促炎因子TNF-α主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是炎癥反應(yīng)中釋放最早的重要內(nèi)源性炎癥因子之一，可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，并刺激IL-6等炎癥因子產(chǎn)生。IL-6也是重要的促炎因子，是反映組織損傷程度的早期敏感性指標(biāo)。有效抑制炎癥因子的釋放是膿毒癥治療的重要策略。目前的研究發(fā)現(xiàn)，Dex可通過抗交感、抑制細(xì)胞炎癥和凋亡、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、激活細(xì)胞保護(hù)信號通路等多種途徑對機(jī)體多臟器如腦、心、肺和腎發(fā)揮潛在的器官保護(hù)效應(yīng)[10]，但Dex的抗炎機(jī)制仍需要深入研究。本研究結(jié)果表明，Dex可降低膿毒癥小鼠血清中TNF-α和IL-6的水平，減弱其炎癥反應(yīng)。

表2 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 2 Determ ination results of TNF-α，IL-6 levels in them ice serum ofeach grou(p±s，n=10)

表2 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 2 Determ ination results of TNF-α，IL-6 levels in them ice serum ofeach grou(p±s，n=10)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;與m iR-146a抑制劑+Dex組比較，ΔP＜0.05Note:vs.normal control group，＊＊P＜0.01;vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01;vs.miR-146a inhibitor+dexmedetomidine group，ΔP＜0.05

組別正常對照組模型組miR-146a抑制劑+Dex組Dex低劑量組Dex中劑量組Dex高劑量組IL-6，pg/mL 20.06±3.59 141.15±17.49＊＊105.55±11.93 129.55±22.89 83.97±14.44#40.42±6.10##△TNF-α，pg/mL 35.33±4.04 580.86±35.13＊＊327.06±16.82 562.24±33.44 480.17±40.97#199.97±20.90##△

TLR4/NF-κB信號通路可促使大量炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生釋放，是誘導(dǎo)膿毒癥發(fā)生的重要信號通路。LPS與TLR4結(jié)合并活化TLR4，與髓樣分化蛋白88結(jié)合，進(jìn)一步活化IRAK1、TRAF6，最后活化NF-κB抑制蛋白IκB激酶并降解IκB，使NF-κB激活，發(fā)生核轉(zhuǎn)位，啟動炎癥基因轉(zhuǎn)錄及翻譯。

研究顯示，m iR-146a的表達(dá)在膿毒癥患者中顯著增強(qiáng)，可作為潛在的判斷膿毒癥預(yù)后的指標(biāo)[11]。miR-146a的靶基因是TLR4/NF-κB通路中的兩個重要接頭蛋白IRAK1和TRAF6，m iR-146a通過抑制IRAK1和TRAF6蛋白的表達(dá)，負(fù)性調(diào)控TLR4/NF-κB通路，抑制炎癥反應(yīng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，Dex可增強(qiáng)膿毒癥小鼠外周血單核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)，并相應(yīng)地抑制m iR-146a靶基因——炎癥信號TLR4/NF-κB通路中重要的接頭蛋白IRAK1和TRAF6的表達(dá);同時，抑制miR-146a活性后，Dex的抗炎效應(yīng)顯著減弱，提示Dex的抗炎活性部分由誘導(dǎo)抗炎分子m iR-146a介導(dǎo)。

綜上所述，Dex可通過誘導(dǎo)m iR-146a表達(dá)，下調(diào)IRAK1和TRAF6的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)性調(diào)控TLR4/NF-κB通路，并抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放，從而在膿毒癥小鼠中發(fā)揮重要的抗炎效應(yīng)，揭示了Dex抗炎作用的新機(jī)制。

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(編輯:鄒麗娟)

Study on the Effect and Its M echanism of Dexmedetom idine on the Inflammatory Response in Septic M ice

GUO Mao，WANG Wenm ing(Dept.of Anesthesiology，Luzhou People’s Hospital，Sichuan Luzhou 646000，China)

OBJECTIVE:To study the effect and itsmechanism of dexmedetomidine(Dex)on inflammatory response in septic m ice.METHODS:M ice were random ly divided into normal control group，model group，m iR-146a inhibitor(50 mg/kg)+Dex (50μg/kg)group，Dex low-dose，medium-dose，high-dose groups(10，30，50μg/kg)，10 in each group.Except for normal control group，other groups were intraperitoneally injected lipopolysaccharide to induce septic models，intraperitoneally injected relevantmedicines after 0.5 h.A fter drug intervention for 6 h，m iR-146a expression，IRAK1 and TRAF6 mRNA expressions in peripheral blood mononuclear cells in each group were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction method. IRAK1，TRAF6 protein expressions in peripheral blood mononuclear cells in each group were detected by Western blot method. TNF-α，IL-6 levels in serum were detected by enzyme-linked immunosorbentmethod.RESULTS:Compared w ith normal control group，m iR-146a expression，TNF-αand IL-6 levels，IRAK1，TRAF6 mRNA and protein expressions in peripheral blood mononuclear cells inmodel group were increased(P＜0.01).Compared w ithmodel group，miR-146a expression in peripheral blood mono-nuclear cells in Dex medium-dose，high-dose groups were increased;TNF-αand IL-6 levels，IRAK1，TRAF6 protein expressions were decreased(P＜0.05 or P＜0.01);while IRAK1，TRAF6 mRNA expressions changed less obviously(P＞0.05).Compared w ith Dex high-dose group，miR-146a expression，in peripheral blood mononuclear cells in miR-146a inhibitor+Dex group was decreased;TNF-αand IL-6 levels，IRAK1，TRAF6 protein expressions were increased(P＜0.05 or P＜0.01);while IRAK1，TRAF6 mRNA expressions changed less obviously(P＞0.05).CONCLUSIONS:Dex can inhibit the inflammatory response in septic m ice.Themechanism may associate w ith inducing m iR-146a expression and inhibiting the 2 important adaptor proteins IRAK1，TRAF6 expressions in Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB pathway.

Sepsis;Dexmedetomidine;miR-146a;Inflammatory response;M ice;Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB

R971+.2

A

1001-0408(2017)19-2651-04

2016-12-22

2017-03-10)

＊主治醫(yī)師。研究方向:臨床麻醉。電話:0830-2361931。E-mail:guomaolzyxy@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.17