張巧月，劉艷艷，萬昶宸，廖 曼，張 霞，劉天意，張?zhí)m桐#(.河北醫(yī)科大學藥學院藥物分析教研室，石家莊 05007;.哈爾濱醫(yī)科大學藥學院，哈爾濱5008)

斯皮諾素對人肝微粒體細胞色素P450酶的體外抑制作用

張巧月1＊，劉艷艷1，萬昶宸1，廖 曼1，張 霞1，劉天意2，張?zhí)m桐1#(1.河北醫(yī)科大學藥學院藥物分析教研室，石家莊 050017;2.哈爾濱醫(yī)科大學藥學院，哈爾濱150081)

目的:研究斯皮諾素對人肝微粒體細胞色素P450(CYP450)酶7種亞型(CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP1A1、CYP2C19和CYP3A4)的體外抑制作用。方法:以200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39μmol/L的斯皮諾素與人肝微粒體共同孵育，分別以他克寧、安非他酮、鹽酸阿莫地喹、雙氯芬酸鈉、美芬妥英、氫溴酸右美沙芬和咪達唑侖作為上述7種亞型CYP450酶的特異性探針藥物。采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質譜法測定7種探針藥物的代謝產物生成量，計算斯皮諾素對人肝微粒體中7種亞型CYP450酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)。結果:斯皮諾素對人肝微粒體7種亞型CYP450酶的IC50分別為1 714、1 158、226.1、2 288、80.59、101.1、1 119μmol/L，均大于50μmol/L。結論:斯皮諾素對人肝微粒體CYP450酶的上述7種亞型均無抑制作用，引發(fā)藥物代謝性相互作用的可能性較小。

斯皮諾素;超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質譜法;細胞色素P450酶;抑制作用

酸棗仁(Semen Zizyphi Spinosae，SZS)是鼠李科(Phamnaceae)植物酸棗[Zizyphus jujuba Mill.var spinosa (Bunge)Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟種子[1]，是治療失眠和焦慮的經典中藥之一，其化學成分包括達瑪烷型三萜皂苷、黃酮類化合物、生物堿、三萜類化合物、維生素和多糖等[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，酸棗仁黃酮能顯著延長巴比妥鈉誘導小鼠睡眠的時間[3]。斯皮諾素為酸棗仁黃酮的主要活性物質，是酸棗仁湯鎮(zhèn)靜催眠的藥效物質基礎之一[4]，能通過5-羥色胺(5-HT)系統(tǒng)延長戊巴比妥誘導大鼠睡眠的時間[5]。所以，深入研究斯皮諾素對進一步開發(fā)和利用酸棗仁具有一定意義。

代謝性相互作用主要是由于藥物對代謝酶產生誘導或抑制作用所致，起主導作用的是細胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP450)[6]。肝CYP450酶系是一類含鐵的血紅素蛋白超家族，負責大量外源性化合物的氧化代謝，同時對部分內源性化合物的代謝也起著重要作用，在人體內易被聯(lián)合應用的藥物誘導和抑制，從而導致藥物濃度發(fā)生巨大變化，產生增效或毒副作用[7-8]。人體內CYP450酶是由多種同工酶組成的大家族，其中CYP1A1、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4與藥物代謝密切相關。研究藥物對CYP450酶作用的方法主要包括體內代謝組學實驗以及體外亞細胞或細胞試驗[9]。本文采用美國FDA推薦的特異性探針藥物研究斯皮諾素對人肝微粒體中7種亞型CYP450酶的影響，通過評估斯皮諾素在體外代謝體系中對CYP450酶特異性探針底物的抑制程度，預測其在體內可能引發(fā)的藥物代謝性相互作用，為其臨床安全用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AB SCIEX Triple-TOF 5600+三重四級桿-飛行時間質譜儀，包括Duospray離子源、Analyst Software1.7數(shù)據(jù)采集分析軟件(美國AB公司);LC-30A超高效液相色譜儀，包括CTO-30A柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器和SIL-30AC自動進樣器(日本島津公司);D3024R高速冷凍離心機(美國Scilogex公司)。

1.2 藥品與試劑

斯皮諾素對照品(成都普菲德生物技術有限公司，批號:121220，純度:＞98%);磺胺甲噁哇、安非他酮、鹽酸阿莫地喹、雙氯芬酸鈉、氫溴酸右美沙芬對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:100025-3200904、100671-200301、101217-201401、100334-200302、100201-201204，純度:＞98%);他克寧對照品(加拿大Trc公司，批號: A629700，純度:＞98%);美芬妥英對照品(北京百靈威科技有限公司，批號:303768，純度:＞98%);咪達哇侖注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號:20150208，規(guī)格:2m L∶10mg);還原型輔酶Ⅱ(NADPH，北京索萊寶科技有限公司，批號:524F016，純度:＞98%);50人合1混合人源肝微粒體、氯化鎂(美國BD Bioscience公司，批號:H0610、20140730);水為純凈水，甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 斯皮諾素對照品溶液 精密稱取斯皮諾素對照品適量，用甲醇溶解制成40mmol/L的貯備液;精密量取貯備液適量，用甲醇依次稀釋成系列濃度對照品溶液。

2.1.2 內標溶液 精密稱取磺胺甲噁哇對照品適量，用甲醇溶解并稀釋成170 ng/m L的溶液。

2.1.3 探針藥物溶液 分別精密稱取安非他酮(CYP2B6探針)、鹽酸阿莫地喹(CYP2C8探針)、雙氯芬酸鈉(CYP2C9探針)、氫溴酸右美沙芬(CYP2D6探針)、他克寧(CYP1A1探針)、美芬妥英(CYP2C19探針)和咪達哇侖(CYP3A4探針)對照品適量[10]，分別用甲醇溶解制成5、1、1、1、5、30、1mmol/L的溶液。

2.1.4 氯化鎂溶液 精密稱取氯化鎂適量，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解制成16mmol/L的溶液。

2.2 人肝微粒體溫孵反應

試驗分為人肝微粒體溫孵體系組[含人肝微粒體、探針藥物和系列濃度的斯皮諾素對照品溶液的PBS (pH 7.2～7.4)]和空白組(等量甲醇)。各組先37℃預熱孵化振蕩10 m in，再加入預熱的NADPH啟動反應[11-12]。NADPH、氯化鎂的終濃度分別為2、4mmol/L;系列濃度的斯皮諾素對照品溶液在孵育體系中的終濃度分別為200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39μmol/L，溫孵體系的體積為200μL，有機溶劑體積低于總溫孵體系體積的1%，每個溫孵體系平行制備3份。溫孵體系于37℃恒溫振蕩反應一段時間后取出，立即加入含內標的冰甲醇200μL終止反應。7種亞型CYP450酶對應的探針藥物的濃度、人肝微粒體質量濃度和溫孵時間見表1。

表1 7種亞型CYP450酶對應的探針藥物的濃度、人肝微粒體質量濃度和溫孵時間Tab 1 Probe substrate concentration，mass concentration of human liverm icrosomes and incubation timeof7 subtypesof CYP450enzymes

2.3 樣品處理

將終止反應的樣品渦旋2m in，14 000×g離心10 m in，取上清液用0.22μm微孔濾膜過濾。取續(xù)濾液進樣分析，測定7種探針藥物的代謝產物生成量。

2.4 代謝產物的含量測定

2.4.1 色譜條件色譜柱:Poroshell120 ECC18(50mm× 2.1mm，2.7μm);流動相:0.05%甲酸水溶液(A)-0.05%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫(0～3m in，15%B～50%B; 3～5 min，50%B～95%B;5～5.5 min，95%B;5.5～6 m in，95%B～15%B;6～7.5 m in，15%B);流速:400 μL/min;柱溫:40℃;進樣量:5μL。

2.4.2 質譜條件 電噴霧離子源(ESI源)，TurboV離子源，正離子模式，源噴射電壓:5 500 V;霧化溫度: 550℃，霧化氣(GS1，N2)壓力:55 psi，輔助氣(GS2，N2)壓力:55 psi，氣簾氣(N2)壓力:30 psi。

2.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理軟件為MultiQuant3.0。溫孵體系中探針藥物代謝產物的生成量代表酶的活性。以(峰面積樣品組代謝產物/峰面積內標)/(峰面積空白組代謝產物/峰面積內標)計算酶的相對活性(%)。以相對活性為縱坐標、抑制劑(斯皮諾素)濃度的對數(shù)值(lg c)為橫坐標，應用GraphPad Prism 5.0軟件進行非線性擬合，計算斯皮諾素對7種亞型CYP450酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)。斯皮諾素對7種亞型CYP450酶的抑制曲線見圖1。

結果顯示，斯皮諾素對CYP1A1、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的IC50分別為1 714、1 158、226.1、2 288、80.59、101.1、1 119 μmol/L，遠大于50μmol/L。這說明斯皮諾素對這7種亞型CYP450酶沒有抑制作用，其由于代謝性相互作用而引發(fā)不良反應的可能性很小;在臨床應用時，不易引發(fā)代謝性藥物相互作用。

圖1 斯皮諾素對CYP450酶7種亞型的抑制曲線Fig 1 Inhibition curves of spinosin on 7 subtypes of CYP450enzymes

3 討論

內標物的選擇應符合化學性質穩(wěn)定、與被測物質性質相近、不與樣品中的物質發(fā)生反應且保留時間與被測物質相近的要求。預試驗中筆者比較了磺胺甲噁哇和鹽酸苯海拉明，發(fā)現(xiàn)磺胺甲噁哇在正離子模式下峰形較好，故選定磺胺甲噁哇為本試驗內標物。

參與肝臟藥物代謝的CYP450酶有CYP1、CYP2、CYP3及CYP4四個家族。酶抑制作用所致的藥物相互作用的臨床意義遠大于酶誘導作用，酶抑制作用約占代謝性相互作用的70%[6]。根據(jù)美國FDA推薦，本試驗選擇了7種特異性探針藥物安非他酮、鹽酸阿莫地喹、雙氯芬酸鈉、氫溴酸右美沙芬、他克寧、美芬妥英和咪達哇侖來評價斯皮諾素對7種亞型CYP450酶的抑制作用，其生成的代謝產物分別為羥基安非他酮、N-脫乙基阿莫地喹、4′-羥基雙氯芬酸、O-脫甲基右美沙芬、1-羥基他克寧、4′-羥基美芬妥英和1-羥基咪達哇侖。

IC50表示藥物在產生50%抑制作用時的藥物濃度。該值越小，代表藥物的抑制作用越強[6]?；衔飳YP450酶的抑制程度可按IC50分為如下等級:強抑制劑(IC50≤1μmol/L)，中等抑制劑(1μmol/L＜IC50≤10μmol/L)，弱抑制劑(10μmol/L＜IC50≤50μmol/L);當IC50大于50 μmol/L時，化合物則被認為沒有抑制作用[13]。

本試驗結果表明，斯皮諾素對人肝微粒體CYP450酶的7種亞型CYP1A1、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4均無抑制作用，引發(fā)藥物代謝性相互作用的可能性較小。該結果為斯皮諾素的進一步臨床研究和聯(lián)合用藥提供了實驗基礎。

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(編輯:鄒麗娟)

Inhibition Effect of Spinosin on Cytochrome P450Enzymes from Human Liver M icrosomes in vitro

ZHANG Qiaoyue1，LIU Yanyan1，WAN Changchen1，LIAO Man1，ZHANG Xia1，LIU Tianyi2，ZHANG Lantong1(1.Teaching and Research Section of Pharmaceutical Analysis，School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China;2.School of Pharmacy，Harbin Medical University，Harbin 150081，China)

OBJECTIVE:To study the inhibition effect of spinosin on 7 subtypes(CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2D6，CYP1A1，CYP2C19 and CYP3A4)of cytochrome P450(CYP450)enzymes from human liverm icrosomes in vitro.METHODS:Taking 200.00，100.00，50.00，25.00，12.50，6.25，3.13，1.56，0.78，0.39μmol/L spinosin and human livermicrosomes for incubation，using daktarin，bupropion，amodiaquine hydrochloride，diclofenac sodium，mephenytoin，dextromethorphan hydrobrom ide and m idazolam as the specific probe drugs for above-mentioned 7 subtypes of CYP450enzymes.UPLC-Q-TOF-MSwas conducted to detect generation amount of 7 probe drug metabolites，and the half inhibitory concentration(IC50)of spinosin on 7 subtypes of CYP450enzymes from human liverm icrosomes was calculated.RESULTS:IC50of spinosin on 7 subtypes of CYP450enzymes from human livermicrosomeswere 1 714，1 158，226.1，2 288，80.59，101.1，1 119μmol/L，respectively，which were higher than 50 μmol/L.CONCLUSIONS:Spinosin has no inhibition effect on above-mentioned 7 subtypes of CYP450enzymes from human liver m icrosomes，w ith very low probability of inducingmetabolic drug interactions.

Spinosin;UPLC-Q-TOF-MS;Cytochrome P450enzymes;Inhibition effect

R361+.3

A

1001-0408(2017)19-2645-03

2016-10-26

2016-12-15)

＊碩士研究生。研究方向:藥物分析與質量控制。電話:0311-86266419。E-mail:694910334@qq.com

#通信作者:教授，博士生導師，博士。研究方向:藥物質量控制、藥動學。電話:0311-86266419。E-mail:zhanglantong@263.net

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.15