王曉飛，李 輝，劉銘佩，焦海勝#(.蘭州大學第二醫(yī)院藥學部，蘭州 730030;2.蘭州大學藥學院，蘭州730000)

油橄欖葉中三萜類成分的提取、分離與結構鑒定Δ

王曉飛1＊，李 輝1，2，劉銘佩1，焦海勝1#(1.蘭州大學第二醫(yī)院藥學部，蘭州 730030;2.蘭州大學藥學院，蘭州730000)

目的:提取、分離油橄欖葉中的三萜類成分并進行結構鑒定，為油橄欖葉的開發(fā)利用提供參考。方法:采用硅膠柱色譜等方法對油橄欖葉乙醇提取物的乙酸乙酯部位進行洗脫、柱層析、重結晶，并通過核磁共振等技術對分離出的化合物進行結構鑒定。結果:從油橄欖葉乙酸乙酯部位分離得到6個化合物，分別鑒定為β-香樹素、高根二醇、2α，3β-二羥基烏蘇烷-12-烯-28-酸(化合物3)、齊墩果酸、Camaldulenic acid(化合物5)、3α-山楂酸。其中，化合物3和化合物5首次從油橄欖葉中分離得到。結論:本研究為油橄欖葉的進一步開發(fā)和合理應用提供了試驗基礎。

油橄欖葉;三萜類成分;乙醇提取物;乙酸乙酯部位;分離;結構鑒定

油橄欖(Olea europaea L.)為木犀科木犀欖屬常綠喬木，主要分布于地中海國家，希臘、意大利、突尼斯、西班牙為其集中產地。自20世紀60年代起，油橄欖開始在我國引種，甘肅省隴南市是我國最大的油橄欖種植基地之一，而每年因修剪產生大量的廢棄油橄欖葉，造成了嚴重的資源浪費?，F代藥理研究表明，油橄欖葉具有抗高膽固醇、降血糖、降血壓、抗氧化等多種藥理活性[1]。目前油橄欖葉化學成分研究多集中于抗氧化活性成分黃酮類[2]和環(huán)烯醚萜類化合物[3]，而三萜類成分的研究報道較少。為了充分利用甘肅省豐富的油橄欖葉資源，本試驗研究了從油橄欖葉乙醇提取物中乙酸乙酯部位分離出的成分，從中分離得到6個化合物，并通過核磁共振技術(NMR)鑒定了其結構，為科學合理地利用油橄欖葉資源提供了科學依據，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器

Inova-400 FT-NMR儀(美國Varian公司);ME215S吉尼斯系列電子分析天平(德國賽多利斯儀器有限公司);HX2002T電子天平(慈溪市田東衡器廠)。

1.2 藥材、硅膠與試劑

油橄欖葉于2011年9月采自甘肅省隴南市武都區(qū)，經中國科學院蘭州化學物理研究所戚歡陽副研究員鑒定為木犀科木犀欖屬植物油橄欖的葉;柱層析硅膠(200～300目)和薄層色譜(TLC)層析硅膠(GF254)均購自青島海洋化工廠;石油醚(60～90℃)、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、甲醇、95%乙醇均為分析純，購自天津市化學試劑一廠。

2 提取與分離

取油橄欖葉2.5 kg，剪碎，加入95%乙醇25 L，加熱回流提取3次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加入適量的水混懸，用石油醚萃取6次脫脂，然后用乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液并減壓濃縮，得乙酸乙酯部位300 g。將乙酸乙酯部位加入乙酸乙酯溶解，用300 g硅膠拌樣，干法上樣，依次用體積比分別為100∶1、100∶3、100∶5的氯仿-甲醇進行梯度洗脫。每500m L收集流分1次并編號，其中氯仿-甲醇(100∶5)洗脫的流分59～95經TLC檢識后合并具有相同斑點[顏色與比移值(Rf)均相同]的組分，將流分59～66、67～73、74～82、83～95合并，分別得到4個部分(A、B、C、D)。A部分以石油醚-丙酮(9∶1)為洗脫液經硅膠柱層析，每10m L收集流分1次并編號，TLC檢識后合并具有相同斑點的流分10～21、25～42，以上兩部分經重結晶后，分別得到化合物1(20 mg)和化合物2(16mg)。D部分以石油醚-丙酮(8∶2)為洗脫液經硅膠柱層析，每10m L收集流分1次并編號，TLC檢識后合并具有相同斑點(顏色與Rf均相同)的流分6～11、13～22、27～32、36～44，以上各部分經重結晶后，分別得到化合物3(25mg)、化合物4(45mg)、化合物5(13mg)和化合物6(30mg)。

3 結構鑒定

采用13C-NMR和1H-NMR對化合物1～6的結構進行表征，確定其結構。

3.1 化合物1

化合物1為無色針狀結晶(結晶用試劑為乙酸乙酯)。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中峰信號δ145.2 (C-13)、121.7(C-12)與1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜中雙鍵質子信號δ5.16(1H，s，H-12)的存在提示該化合物為Δ12-齊墩果烷型的三萜類化合物。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中峰信號δ79.0(C-3)和H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜中峰信號δ3.29(1H，m，H-3)的存在提示該化合物中含有1個羥基。此外，在1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜中可以觀察到8個角甲基單峰[δ1.23 (3H，s)，1.11(3H，s)，0.98(3H，s)，0.94(3H，s)，0.91(3H，s)，0.85(3H，s)，0.81(3H，s)，0.77(3H，s)]，表明該羥基不與角甲基相連?；衔?的13C-NMR數據見表1(注: ppm表示百萬分之一)。

表1中化合物1光譜數據與文獻[4]報道的數據基本一致，故確定化合物1為β-香樹素。

3.2 化合物2

化合物2為無色針狀結晶(結晶用試劑為乙酸乙酯)。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中峰信號δ122.4 (C-12)、144.2(C-13)與1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜中雙鍵質子信號δ5.19(1H，t，J=3.2Hz，H-12)的存在表明該化合物為Δ12-齊墩果烷型的三萜類化合物。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中信號峰δ79.0(C-3)、69.7(C-28)與1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜中峰信號δ3.22(1H，m，H-3)、3.55(1H，d，J=12.0Hz，H-28)、3.21 (1H，d，J=12.0Hz，H-28)的存在，提示該化合物中含有2個羥基。此外，在1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜的高場區(qū)還可以觀察到7個角甲基單峰[δ0.79(3H，s)，0.88 (3H，s)，0.89(3H，s)，0.93(3H，s)，0.94(3H，s)，0.99(3H，s)，1.17(3H，s)]，表明有1個角甲基與羥基相連?；衔?的13C-NMR數據見表1。表1中化合物2的光譜數據與文獻[5]報道的數據基本一致，故確定化合物2為高根二醇。

3.3 化合物3

化合物3為無色針狀結晶(結晶用試劑為乙酸乙酯)。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中峰信號δ178.3 (C-28)的存在，提示該化合物中含有羧基。13C-NMR (CDCl3，100 MHz)圖譜中峰信號δ138.3(C-13)、124.8 (C-12)與1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜中雙鍵質子信號δ5.12(1H，m，H-12)的存在表明該化合物為Δ12-烏蘇烷型三萜類化合物。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中峰信號δ67.1(C-2)、82.3(C-3)與1H-NMR(CDCl3，400 MHz)圖譜中峰信號δ3.41(1H，H-2β)、3.15(1H，m，H-3α)的存在表明該化合物中含有2個羥基。此外，在1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜的高場區(qū)還可以觀察到5個甲基單峰[δ0.69(3H，s)，0.73(3H，s)，0.86(3H，s)，0.91(3H，s)，1.08(3H，s)]和2個甲基雙峰[δ0.80(3H，d，J=5.2Hz)，1.07(3H，d，J=5.7Hz)]，進一步證實了該化合物為Δ12-烏蘇烷型三萜類化合物。化合物3的13C-NMR數據見表1。表1中化合物3的光譜數據與文獻[6]報道的數據基本一致，故確定化合物3為2α，3β-二羥基烏蘇烷-12-烯-28-酸。

表1 化合物1～6的13C-NMR(CDCl3，100MHz)數據(ppm)Tab 113C-NMR(CDCl3，100MHz)data of compounds1-6(ppm)

3.4 化合物4

化合物4為無色針狀結晶(結晶用試劑為丙酮)。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中峰信號δ182.9(C-28)的存在，提示該化合物中含有羧基。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中峰信號δ122.6(C-12)、143.6(C-13)與1H-NMR(CDCl3，400 MHz)圖譜中雙鍵質子信號δ5.27(1H，m，H-12)的存在表明該化合物為Δ12-齊墩果烷型的三萜類化合物。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中峰信號δ79.0(C-3)與1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜中峰信號δ3.20(1H，m，H-3)的存在提示該化合物中含有1個羥基。此外，該化合物的1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜在高場區(qū)還可以觀察到7個甲基單峰[δ0.73(3H，s)，0.75(3H，s)，0.88(3H，s)，0.89(3H，s)，0.90(3H，s)，0.96 (3H，s)，1.11(3H，s)]，提示該化合物28位為羧基?；衔?的13C-NMR數據見表1。表1中化合物4的光譜數據與文獻[7]報道的數據基本一致，故確定化合物4為齊墩果酸。

3.5 化合物5

化合物5為無色針狀結晶(結晶用試劑為丙酮)。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中峰信號δ176.9(C-28)的存在表明該化合物中含有羧基。13C-NMR(CDCl3，100 MHz)圖譜中峰信號δ136.0(C-13)、132.4(C-18)、126.4(C-11)、125.5(C-12)與1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜中峰信號δ6.47(1H，dd，J=10.8，4 Hz，H-11)、5.66 (1H，d，J=10.8 Hz，H-12)的存在表明該化合物為Δ11，13-齊墩果烷型三萜類化合物。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中峰信號δ83.0(C-3)、67.9(C-2)與1H-NMR(CDCl3，400 MHz)圖譜中峰信號δ2.92(1H，d，J=9.2 Hz，H-3)、3.63(1H，m，H-2)的存在表明該化合物中含有2個羥基。在1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜的高場區(qū)有7個甲基單峰[δ0.74(3H，s)，0.74(3H，s)，0.79(3H，s)，0.91(3H，s)，0.96(3H，s)，0.97(3H，s)，0.99(3H，s)]，表明該化合物28位為羧基?；衔?的13C-NMR數據見表1。表1中化合物5的光譜數據與文獻[8]報道的數據基本一致，故確定化合物5為Camaldulenic acid。

3.6 化合物6

化合物6為無色針狀結晶(結晶用試劑為丙酮)。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中峰信號δ178.2(C-28)的存在表明該化合物含有1個羰基。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中峰信號δ121.9(C-12)、143.9(C-13)與1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜中雙鍵質子信號δ5.21 (1H，m，H-12)的存在表明該化合物為Δ12-齊墩果烷型的三萜類化合物。13C-NMR(CDCl3，100MHz)圖譜中峰信號δ78.1(C-3)、65.2(C-2)與1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜中峰信號δ3.89(1H，m，H-3)、4.36(1H，m，H-2)的存在表明該化合物含有2個羥基且3位羥基的構型為α。此外，在1H-NMR(CDCl3，400MHz)圖譜高場區(qū)有7個甲基單峰[δ0.76(3H，s)，0.82(3H，s)，0.87(3H，s)，0.89(3H，s)，0.94(3H，s)，0.96(3H，s)，1.14(3H，s)]，表明該化合物28位為羧基。化合物6的13C-NMR數據見表1。表1中化合物6的光譜數據與文獻[9]報道的數據基本一致，故確定化合物6為3α-山楂酸。

4 討論

本研究中的油橄欖系木犀科木犀欖屬常綠喬木，與通常所說的橄欖屬橄欖科橄欖屬喬木有根本的區(qū)別。油橄欖原產于小亞細亞(現在中東敘利亞一帶)，經希臘擴展到地中海沿岸地區(qū)及周邊國家，其栽培已有4 000多年的歷史。而橄欖原產于我國，主要分布于兩廣、閩、臺、川南、浙等地，栽培品種主要有白欖和烏欖2種。

研究表明，油橄欖中的化學成分主要為木質素類、黃酮類、香豆精類、環(huán)烯醚萜類及咖啡酰苯乙醇苷類[1]。筆者前期已對油橄欖葉中中等極性的化合物(黃酮類和環(huán)烯醚萜類)進行了研究[2-3]，初步確定了其抗氧化活性成分。為了拓展油橄欖葉的應用范圍，筆者對其極性較低的化合物進行了進一步研究，從油橄欖葉中分離得到β-香樹素、高根二醇、2α，3β-二羥基烏蘇烷-12-烯-28-酸、齊墩果酸、Camaldulenic acid、3α-山楂酸等6個化合物。研究報道油橄欖葉中齊墩果酸和3α-山楂酸含量較高，分別為1.56%和0.73%[10-11]，以上2種成分均屬于五環(huán)三萜類化合物。大量研究表明，該類化合物具有廣泛的藥理作用和重要的生物活性，其在抗炎、護肝、抗腫瘤、抗人類免疫缺陷病毒以及機體免疫調節(jié)等方面已經顯現出令人關注的藥理特性[12-14]。其中，化合物3和化合物5首次從油橄欖葉中分離得到。本試驗分離得到的三萜類化合物的其他生物活性則有待進一步研究。

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Extraction，Isolation and Structural Identification of Triterpenes from the Leaves of Olea europaea

WANG Xiaofei1，LIHui1，2，LIU M ingpei1，JIAO Haisheng1(1.Dept.of Pharmacy，Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730030，China;2.College of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China)

OBJECTIVE:To extract，isolate the triterpenes from the leaves of Olea europaea，then conduct structural identification，and provide reference for development and application of the leaves of O.europaea.METHODS:Silica gel column and other methods were used for elution，column chromatography and recrystallization of the ethyl acetate part of ethanol extracts from the leaves of Olea europaea.The structures of separated compounds were identified by nuclearmagnetic resonance.RESULTS:6 compounds were isolated from ethyl acetate part of the leaves of O.europaea，identified asβ-amyrin，erythrodiol，2α，3β-dihydroxyl-12-ursen-28-acid(compound 3)，oleanolic acid，camaldulenic acid(compound 5)，3α-maslinic acid.Compound 3 and compound 5 were isolated from the leaves of O.europaea for the first time.CONCLUSIONS:The study has provided test basis for the further development and reasonable application of the leaves of O.europaea.

Leaves of Olea europae a;Triterpenes;Ethanol extracts;Ethyl acetate part;Isolation;Structural identification

R284.1;R284.2

A

1001-0408(2017)19-2639-03

2016-10-22

2017-01-18)

(編輯:劉 萍)

蘭州大學第二醫(yī)院博士科研基金(No.Ynbskyjj2015-1-27)

＊主管藥師，博士。研究方向:天然產物分析與分離。電話: 0931-8942491。E-mail:wxf_2511@163.com

#通信作者:教授，碩士生導師。研究方向:藥物新劑型、新技術。電話:0931-8942571。E-mail:ldeyjhs@sohu.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.13