霍仕霞，高 莉，彭曉明，溫季軒，閆 明(1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049;2.新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830049)

高良姜素的體外透皮吸收特性研究Δ

霍仕霞＊，高 莉，彭曉明，溫季軒，閆 明#(1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049;2.新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830049)

目的:考察高良姜素的體外透皮吸收特性及不同促透劑對(duì)其透皮行為的影響，為開發(fā)以高良姜素為原料藥的治療白癜風(fēng)的皮膚給藥制劑提供參考。方法:采用高效液相色譜法測(cè)定高良姜素的含量。以高良姜素的累積透過量(Q)和透皮速率(J)為指標(biāo)，考察接收液[20%、40%聚乙二醇400(PEG400)溶液和30%乙醇溶液]、轉(zhuǎn)速(200、300、400 r/min)對(duì)高良姜素在小鼠完整皮膚中吸收的影響，考察氮酮(1%、3%、5%)、丙二醇(10%、20%、40%)單用或者聯(lián)用對(duì)其促透作用。同時(shí)，考察高良姜素在大鼠和小鼠的完整皮膚、去角質(zhì)層皮膚、真皮層皮膚的透過特性。結(jié)果:以接收液為40%PEG400溶液、轉(zhuǎn)速為300 r/m in、5%氮酮單用時(shí)，高良姜素在小鼠完整皮膚中的透過性最好，J為3.257 0μg/(cm2·h)。小鼠完整皮膚、去角質(zhì)層皮膚、真皮層皮膚的J分別為2.719 9、34.016、33.874μg/(cm2·h)，大鼠3種皮膚的J分別為0.499 6、9.512 4、17.406μg/(cm2·h)。結(jié)論:高良姜素可以透過小鼠和大鼠的完整皮膚，但是透過量遠(yuǎn)低于去角質(zhì)層皮膚和真皮層皮膚。

高良姜素;透皮吸收;促透劑;完整皮膚;去角質(zhì)層皮膚;真皮層皮膚

高良姜素(化學(xué)名為3，5，7-三羥基黃酮)是一種天然的黃酮醇類化合物，是姜科植物高良姜(Alpiniaofficinarum Hance.)的干燥根莖中的主要有效成分。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高良姜有效部位具有治療白癜風(fēng)的功效[1];并進(jìn)一步通過分離、純化及合成等方法得到了高良姜素單體成分，并證實(shí)了其可促進(jìn)人黑色素瘤細(xì)胞增殖、提高酪氨酸酶活性[2-3]、對(duì)實(shí)驗(yàn)性C57BL/6白癜風(fēng)小鼠具有改善作用[4-5]，提示該化合物有望進(jìn)一步開發(fā)成為治療白癜風(fēng)的新藥。而目前關(guān)于白癜風(fēng)的治療藥物大多是口服藥，在臨床用藥過程中由于存在首關(guān)效應(yīng)強(qiáng)、半衰期短等因素，大大影響了藥物的療效。經(jīng)皮給藥系統(tǒng)相對(duì)于口服制劑在患者用藥依從性上有明顯的優(yōu)勢(shì)。因此，筆者考察了高良姜素在離體大鼠和小鼠皮膚中的透皮吸收特性，為后期開發(fā)以高良姜素為原料藥的治療白癜風(fēng)的皮膚給藥制劑提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

TP-3A智能藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海興創(chuàng)科學(xué)儀器設(shè)備有限公司);BS244S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司];高效液相色譜(HPLC)儀(包括LC-20AB泵、SPD-M 20A二極管陣列檢測(cè)器、CBM-20A系統(tǒng)控制器、CT0-20A柱溫箱、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、DGU-20A3在線脫氣裝置和VP-ODS色譜柱)購(gòu)自日本島津公司。

1.2 試劑

高良姜素原料藥(上海永恒生物有限公司，批號(hào): 20110921，純度:≥99.9%);高良姜素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):121263-200502，純度:99.9%);甲醇(色譜純，德國(guó)默克集團(tuán));磷酸(分析純，天津市登科化學(xué)試劑有限公司);甲醇、乙醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司);聚乙二醇400(PEG400，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司);1，2-丙二醇(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司);氮酮(天津市福晨化學(xué)試劑廠)。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠(♂，體質(zhì)量180～220 g)和KM小鼠(♂，體質(zhì)量18～22 g)均由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(新)2011-0004。

2 方法與結(jié)果

2.1 離體動(dòng)物皮膚的制備

2.1.1 完整動(dòng)物皮膚的制備 將SD大鼠、KM小鼠拉頸處死，俯臥置于手術(shù)板上，固定四肢，用眼科剪緊貼毛根剪除背部鼠毛，剝?nèi)∑つw，小心剔除皮下組織和脂肪，生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，置于鋁箔紙內(nèi)，即得。將皮膚置于-40℃低溫冰箱中保存，備用。試驗(yàn)時(shí)取出，室溫下自然解凍后使用，保存時(shí)間不超過2周[6]。

2.1.2 去角質(zhì)層皮膚的制備 將Wing TaiTape膠帶完全黏附于去毛動(dòng)物皮膚表面后撕下，如此反復(fù)操作50～60次，直至皮膚表面光潔[7]，即得。將皮膚置于-40℃低溫冰箱中保存，備用。

2.1.3 真皮層皮膚的制備 將完整的動(dòng)物皮膚浸于60℃水中，30 s后取出，用手術(shù)刀刮去表皮層[7]，即得。將皮膚置于-40℃低溫冰箱中保存，備用。

2.2 色譜條件及方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件色譜柱:VP-ODS(250mm×4.6mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸水溶液(62∶38，V/V);檢測(cè)波長(zhǎng):266 nm;流速:1.0m L/m in;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取高良姜素對(duì)照品2.01mg至10m L量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，然后取1m L溶液于10m L量瓶中制成201μg/m L的對(duì)照品貯備液。分別精密吸取上述貯備液0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8m L至10m L量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制備成質(zhì)量濃度為0.251 2、0.502 5、1.005、2.010、4.020、8.040、16.08μg/m L的系列對(duì)照品溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以高良姜素對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，μg/m L)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=50 041x-11 548(r=0.999 6)，表明高良姜素在0.251 2～16.08μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 專屬性 分別將空白溶液(甲醇溶液)、高良姜素對(duì)照品溶液(2.010μg/m L)及高良姜素原料藥溶液(精密稱取高良姜素原料藥20.2mg至20m L量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度;再精密吸取上述溶液0.1m L至10m L量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制得2.020μg/m L的高良姜素原料藥溶液)進(jìn)樣分析。結(jié)果高良姜素對(duì)照品和高良姜素原料藥在相同位置(保留時(shí)間為27.68m in)出現(xiàn)色譜峰，而空白溶液在相同位置無色譜峰，表明試驗(yàn)專屬性較好。

2.2.4 精密度 取“2.2.2”項(xiàng)下0.251 2、4.020、16.08 μg/m L的對(duì)照品溶液，于同日內(nèi)分別連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，得高良姜素峰面積的RSD分別為1.73%、1.21%、0.66% (n=6)，表明試驗(yàn)精密度良好。

2.2.5 檢測(cè)限和定量限 取“2.2.2”項(xiàng)下0.251 2μg/m L的對(duì)照品溶液為母液，逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣測(cè)定。當(dāng)信噪比為3時(shí)，對(duì)應(yīng)的高良姜素質(zhì)量濃度為0.105 ng/m L，即為檢測(cè)限;當(dāng)信噪比為10時(shí)，對(duì)應(yīng)的高良姜素質(zhì)量濃度為0.502 5 ng/m L，即為定量限。

2.2.6 準(zhǔn)確度 精密吸取已知濃度的高良姜素透皮接收液0.1m L，平行操作6份，分別加入質(zhì)量濃度為16.08 μg/m L的高良姜素對(duì)照品溶液1m L，甲醇稀釋定容至10m L量瓶中，進(jìn)樣分析，計(jì)算方法回收率。結(jié)果平均方法回收率為99.53%，RSD為0.91%(n=6)，表明方法準(zhǔn)確度較好。

2.3 體外透皮試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)方法 將動(dòng)物完整皮膚、去角質(zhì)層皮膚和真皮層皮膚置于預(yù)先放有攪拌子的水平擴(kuò)散池的結(jié)合部，角質(zhì)層皮膚面向供給池，真皮層皮膚面向接收池，夾緊密封。供給池內(nèi)定量加入已知質(zhì)量濃度的高良姜素原料藥溶液及透皮促進(jìn)劑水溶液，接收池內(nèi)裝入接收液，兩池連接水浴裝置以維持整個(gè)系統(tǒng)溫度在37℃。分別在設(shè)定時(shí)間從接收池內(nèi)取樣1m L，并同時(shí)補(bǔ)入1m L的蒸餾水或其他接收液，將樣品液以0.45μm濾膜過濾后進(jìn)樣分析，計(jì)算高良姜素的累積透過量(Q，μg/cm2)和透皮速率[J，μg/(cm2·h)]，公式如下[7-8]:

V為接收池體積，A為皮膚有效擴(kuò)散面積，ci為第i (i≤n-1)個(gè)取樣點(diǎn)藥物濃度的測(cè)定值。以Q對(duì)t進(jìn)行回歸，得到回歸方程:Q=Jt+b。式中，J為滲透速率，t為取樣時(shí)間，b為回歸直線截距。

2.3.2 接收液的選擇 精密稱取高良姜素原料藥9份，每份0.02 g，分別溶于30%乙醇溶液中(預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示高良姜素在10%的乙醇中不易溶解，故直接采用30%乙醇溶液)，作為供給液，每3份為一組。透過皮膚選擇KM小鼠的完整皮膚，按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，接收液分別為20%、40%PEG400溶液和30%乙醇溶液，設(shè)置轉(zhuǎn)速均為200 r/min，維持體系溫度在37℃。24 h后取接收液進(jìn)樣分析，測(cè)定高良姜素含量。結(jié)果表明，當(dāng)接收液為40%PEG400水溶液時(shí)接收液中高良姜素含量最高，故以40%PEG400水溶液作為本研究接收液。

2.3.3 轉(zhuǎn)速的選擇 精密稱取高良姜素原料藥9份，每份0.02 g，分別溶于30%的乙醇溶液中，每份5m L，作為供給液，每3份為一組。接收液為40%PEG400溶液，透過皮膚選用KM小鼠完整皮膚，安裝擴(kuò)散裝置，設(shè)定系統(tǒng)溫度為37℃，3組樣品溶液分別設(shè)定轉(zhuǎn)速為200、300、400 r/m in，均于第2、4、6、8 h時(shí)取樣1m L，按“2.3.1”項(xiàng)下方法操作并計(jì)算高良姜素的Q和J。結(jié)果表明，Q和J的值并不隨轉(zhuǎn)速的加快而升高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為300 r/min時(shí)Q、J值均最大，故以300 r/m in作為本研究的轉(zhuǎn)速，結(jié)果詳見表1。

2.4 促透劑對(duì)高良姜素透皮特性的影響

表1 轉(zhuǎn)速對(duì)高良姜素在小鼠完整皮膚中透皮行為的影響Tab 1 Effect of rotating speed on transdermal behaviorsofgalangin in com p lete skin ofm ice

2.4.1 氮酮 精密稱取高良姜素原料藥0.02 g分別溶于含1%、3%、5%氮酮的30%乙醇溶液中，均平行制備3份，每份5m L，作為供給液。以40%PEG400溶液為接收液，透過皮膚選用KM小鼠完整皮膚，安裝擴(kuò)散裝置，設(shè)置系統(tǒng)溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為300 r/m in。分別于2、4、6、8 h時(shí)取樣1m L，并補(bǔ)充1m L接收液，樣品液過0.45 μm濾膜后進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算高良姜素的Q、J值;同時(shí)不加高良姜素原料藥，按照以上操作進(jìn)行空白試驗(yàn)。結(jié)果顯示，以含5%氮酮的30%乙醇溶液制備供給液時(shí)高良姜素Q、J值均最高，結(jié)果見表2。

表2 不同比例的氮酮對(duì)高良姜素在小鼠完整皮膚中透皮行為的影響Tab 2 Effect of different proportions of azone on transdermalbehaviors of galangin in com p lete skin ofm ice

2.4.2 丙二醇 精密稱取高良姜素原料藥0.02 g，分別溶于含10%、20%、40%丙二醇的30%乙醇溶液中，均平行制備3份，每份5m L，作為供給液。按“2.4.1”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算高良姜素的Q、J值。結(jié)果顯示，以含10%丙二醇的30%乙醇溶液制備供給液時(shí)高良姜素的Q、J值均最高，結(jié)果見表3。

表3 不同比例的丙二醇對(duì)高良姜素在小鼠完整皮膚中透皮行為的影響Tab 3 Effect of different proportionsof propylene glycols on transderm al behaviors of galangin in com p lete skin ofm ice

2.4.3 5%氮酮與10%丙二醇聯(lián)合使用 精密稱取高良姜素原料藥0.02 g，溶于含5%氮酮和10%丙二醇的30%乙醇溶液中，作為供給液，平行制備9份，每份5m L。按“2.4.1”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算高良姜素的Q、J值。結(jié)果第2、4、6、8 h的Q值分別為1.492、5.287、6.593、8.552μg/cm2，Q-t方程為Q=2.248 4t-0.14，J為2.248 4 μg/(cm2·h)，可見5%氮酮與10%丙二醇聯(lián)合使用的促透皮效果不如兩者單用好。

2.5 高良姜素在動(dòng)物不同皮膚層的透過特性

2.5.1 在小鼠不同皮膚層的透過特性 精密稱取高良姜素原料藥0.02 g，溶于30%乙醇溶液中，平行制備9份，每份5m L，作為供給液。接收液為40%PEG400溶液，透過皮膚選用KM小鼠完整皮膚、去角質(zhì)層皮膚和真皮層皮膚，均平行3份。安裝擴(kuò)散裝置，設(shè)定溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為300 r/m in。于第2、4、6、8 h時(shí)取樣1m L，并補(bǔ)充1m L接收液，樣品液過0.45μm濾膜，進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算Q、J值。結(jié)果顯示，小鼠去角質(zhì)層皮膚和真皮層皮膚的Q8h、J值基本無差異，且均比完整皮膚的透過性好，結(jié)果見表4。

表4 高良姜素在小鼠不同皮膚層的透過特性測(cè)定結(jié)果Tab 4 Determ ination results of transderm al p ropertiesofgalangin in different skin layersofm ice

2.5.2 在大鼠不同皮膚層的透過特性 精密稱取高良姜素原料藥0.02 g，溶于30%乙醇溶液中，平行制備9份，每份5m L，作為供給液。接收液為40%PEG400溶液，透過皮膚選用SD大鼠完整皮膚、去角質(zhì)層皮膚和真皮層皮膚，均平行3份。安裝擴(kuò)散裝置，按“2.5.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，高良姜素在大鼠的各層皮膚的透過速率從大到小為真皮層＞去角質(zhì)層＞完整皮膚，且在去角質(zhì)層皮膚和真皮層皮膚的J遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于完整皮膚，結(jié)果見表5。

表5 高良姜素在大鼠不同皮膚層的透過特性測(cè)定結(jié)果Tab 5 Determ ination results of transderm al p ropertiesofgalangin in different skin layersof rats

3 討論

本研究的對(duì)象高良姜素為脂溶性化合物，微溶于水，易溶于乙醇溶液中，筆者根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選擇30%乙醇溶液制備供給液，進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的考察及透皮特性研究。在進(jìn)行接收液選擇時(shí)考察了20%、40%PEG400溶液以及30%乙醇溶液，結(jié)果以40%PEG400溶液為接收液時(shí)高良姜素含量最高，以30%乙醇溶液為接收液時(shí)含量最少。這可能是在透皮滲透過程中部分乙醇揮發(fā)而造成高良姜素溶解性降低、接收量小。而PEG400作為一種增溶劑，能夠大大提高高良姜素的溶解性，20% PEG400溶液沒有40%PEG400溶液增溶效果好，故選擇40%PEG400溶液作為接收液。轉(zhuǎn)速考察結(jié)果表明，并不是轉(zhuǎn)速越高高良姜素J值越高，轉(zhuǎn)速為300 r/min時(shí)，J值最高。

氮酮和丙二醇是常用的透皮促進(jìn)劑。氮酮具有促吸收作用，氮酮分子滲入皮膚角質(zhì)層，通過與角質(zhì)層脂質(zhì)相互作用，破壞了角質(zhì)層的有序結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)松散、流動(dòng)性增加，使藥物易于轉(zhuǎn)運(yùn)。而丙二醇具有促溶解作用，是一種通過增強(qiáng)藥物在角質(zhì)層中分配的透皮促進(jìn)劑[9]。本研究結(jié)果顯示，在高良姜素供給液中加入適量氮酮和丙二醇后，高良姜素的Q、J值均顯著增加，且隨著氮酮濃度的增加Q、J值增加;然而，隨著丙二醇的濃度增加Q、J反而降低。其中，5%氮酮、10%丙二醇促吸收作用較好，然而將二者聯(lián)合使用時(shí)，促透皮效果均沒有單獨(dú)使用時(shí)好。

小鼠不同皮膚層的透過試驗(yàn)顯示，去角質(zhì)層皮膚的J為34.016μg/(cm2·h)，真皮層皮膚的J為33.874μg/(cm2·h)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于完整皮膚;大鼠不同皮膚層的透過試驗(yàn)顯示，去角質(zhì)層皮膚的J為9.512 4μg/(cm2·h)，真皮層皮膚的J為17.406μg/(cm2·h)，高良姜素在大鼠真皮層的透過性要優(yōu)于去角質(zhì)層。可見，角質(zhì)層是阻礙高良姜素透過皮膚的主要屏障，該結(jié)果為今后開發(fā)以高良姜素為原料藥的透皮給藥制劑提供了參考依據(jù)。

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Study on the in vitro Transdermal Absorption Properties of Galangin

HUO Shixia，GAO Li，PENG Xiaom ing，WEN Jixuan，YAN M ing(1.Xinjiang Institute of Traditional Uygur Medicine，Urmuqi830049，China;2.Xinjiang Laboratory of Uygur Medical Prescription，Urmuqi830049，China)

OBJECTIVE:To investigate the in vitro transdermal absorption properties of galangin and effects of different penetration enhancers on its transdermal behaviors，and provide reference for developing skin preparations using galangin as APIs in the treatment of vitiligo.METHODS:HPLC was used to determine the galangin content.Using cumulative permeation rate(Q)and the transdermal rate(J)of galangin as indexes，the effect of absorption of receiving solution[20%，40%polyethylene glycol 400 (PEG400)solution and 30%ethanol solution]and rotating rate(200，300，400 r/m in)on galangin in complete skin ofmice were investigated，aswell as the azone(1%，3%，5%)and propylene glycol(10%，20%，40%)alone or combination on its penetration promotion.And the transdermal properties of galangin in complete skin，exfoliating skin，dermis skin of rats and micewere detected.RESULTS:The best permeability of complete skin of m ice showed in 40%PEG400 solution at rotating speed of 300 r/m in

with 5%azone alone，J was 3.257 0μg/(cm2·h).J s of complete skin，exfoliating skin，dermis skin ofmice were 2.719 9，34.016，33.874μg/(cm2·h)，respectively;and those of rats were 0.499 6，9.512 4，17.406μg/(cm2·h).CONCLUSIONS:Galangin can penetrate the complete skin ofmice and rats，however，the penetration quantity is far lower than exfoliating skin and dermis skin.

Galangin;Transdermal absorption;Transdermal enhancer;Complete skin;Exfoliating skin;Derm is skin

R285

A

1001-0408(2017)19-2631-04

2016-11-13

2017-02-08)

(編輯:林 靜)

新疆地產(chǎn)中藥民族藥新藥研發(fā)培育項(xiàng)目(No. Q2015-02-3);新疆維吾爾自治區(qū)科技人才培養(yǎng)項(xiàng)目(No.qn2015yx042)

＊副研究員，碩士。研究方向:藥物分析、中藥藥動(dòng)學(xué)。電話: 0991-6642410。E-mail:huoshixia1983@163.com

#通信作者:研究員，碩士。研究方向:藥物分析、新藥研發(fā)。電話:0991-2574309。E-mail:yanming21cn@sohu.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.11