王耀焓 張培彤 楊棟 韓海英 郭秀偉 祁鑫 張蕓

摘要：目的 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量蘇木、川芎對(duì)腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2的影響。方法 將無血清培養(yǎng)獲得的球細(xì)胞接種于裸鼠腋下，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、蘇木高劑量組、蘇木低劑量組、川芎高劑量組和川芎低劑量組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，21 d后檢測(cè)抑瘤率，激光共聚焦、Western blot和RT-PCR分別檢測(cè)瘤體ABCG2蛋白和mRNA表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)無血清培養(yǎng)獲得的球細(xì)胞具有無限增殖、抗凋亡、高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物等干細(xì)胞性能，川芎高、低劑量組可明顯抑制瘤體生長(zhǎng)（P<0.05），其中川芎低劑量組抑瘤率明顯高于川芎高劑量組，蘇木高、低劑量組雖對(duì)瘤體有一定的抑制作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與對(duì)照組比較，川芎低劑量組可明顯抑制ABCG2蛋白的表達(dá)，蘇木高、低劑量組對(duì)ABCG2蛋白表達(dá)均無抑制作用，除川芎低劑量組外，各給藥組對(duì)ABCG2 mRNA表達(dá)均有上調(diào)作用。結(jié)論 低劑量川芎可能通過抑制腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2蛋白的表達(dá)，靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：蘇木；川芎；腫瘤干細(xì)胞；ABCG2蛋白

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.014

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）08-0060-06

Effects of Sappan Lignum and Chuanxiong Rhizoma on Expression of ABCG2 Protein of PG-BE1 Stem Like Cells in Vivo WANG Yao-han， ZHANG Pei-tong， YANG Dong， HAN Hai-ying， GUO Xiu-wei， QI Xin， ZHANG Yun （Department of Oncology， Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）

Abstract： Objective To observe the effects of different doses of Sappan Lignum and Chuanxiong Rhizoma on tumor stem cells marker ABCG2 in vivo. Methods Sphere cells obtained from serum culture were inoculated in nude mouse armpit， which were randomly divided into 5 groups： control group， Sappan Lignum high- and low-dose groups， and Chuanxiong Rhizoma high- and low-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage. 21 days later， inhibition tumor rate and ABCG2 protein and mRNA expression were detected with confocal microscope， Western blot， and RT-PCR. Results The sphere cells obtained from serum free culture had the abilities of cancer stem cells， such as proliferation， anti-aptosis and high expression of cancer stem cells markers. Chuanxiong Rhizoma high- and low-dose groups could inhibit tumor growth （P<0.05）， and the inhibitory rate of Chuanxiong Rhizoma low-dose group was higher than the Chuanxiong Rhizoma high-dose group. Sappan Lignum high- and low-dose groups inhibited tumor growth without statistical significiance （P>0.05）. Compared with the control group， Chuanxiong Rhizoma low-dose group could significantly inhibit the expression of resistant protein of ABCG2. Sappan Lignum high- and low-dose groups could not inhibit the protein expression of ABCG2. Each medication group up-regulated the mRNA expression of ABCG2 except for Chuanxiong Rhizoma low-dose group. Conclusion Low dose of Chuanxiong Rhizoma can inhibit the expression of ABCG2 protein levels， which can be the targeting killer for cancer stem cells.

Key words： Sappan Lignum； Chuanxiong Rhizoma； cancer stem cells； ABCG2 protein

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81173450）

通訊作者：張培彤，E-mail：zhangpeitong@sohu.com

化療在改善腫瘤患者生存質(zhì)量、提高患者生存率方面起到重要作用。然而，化療耐藥的存在一直制約著臨床療效的發(fā)揮。有研究顯示，經(jīng)化療后再?gòu)?fù)發(fā)或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，大約40%是由于化療耐藥引起的[1]。因此，尋找可以增強(qiáng)化療敏感性的藥物是目前面臨的挑戰(zhàn)。近幾年來，腫瘤干細(xì)胞理論的提出對(duì)化療耐藥的治療提出了新的理念。該理論認(rèn)為，腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、多向分化、化療耐藥等性能，是腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的主要原因。課題組前期研究表明，蘇木、川芎嗪對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用[2-3]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，蘇木、雞血藤及二者聯(lián)合順鉑可以將腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并可抑制與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）表達(dá)，另外對(duì)P16-Cyclin D1- CDK4-RB途徑也具有調(diào)節(jié)作用，三者相互作用共同阻滯腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，我們選用川芎、蘇木作為活血的代表藥，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量蘇木、川芎對(duì)肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的干預(yù)作用。ABCG2蛋白是目前比較公認(rèn)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物之一。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究在體內(nèi)環(huán)境中不同劑量川芎、蘇木對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞標(biāo)志蛋白ABCG2的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

BALB/c-nu裸鼠，4～6周齡，體質(zhì)量（16±2）g，雌雄各半，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（京）2013-0032，飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 細(xì)胞系

高轉(zhuǎn)移性人巨細(xì)胞肺癌細(xì)胞PG-BE1，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤研究室。

1.3 藥物

蘇木、川芎，康美藥業(yè)股份有限公司；順鉑注射液，齊魯制藥（海南）有限公司，批號(hào)20120724。

1.4 主要試劑與儀器

Human FGF-basic（美國(guó)Pero Tech），Human EGF（美國(guó)Pero Tech），B27 Supplement（50×，美國(guó)Gibco），Tripsin inhibition from Glycine max（soybea，美國(guó)Sigma），Anti-BCRP/ABCG2抗體（美國(guó)Abcam），CCK8試劑盒（日本同人），ANNEXIN V（美國(guó)BD），ABCG2 Gene、Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG（H+L）、TRIzol Reagent（美國(guó)Life Technologies）。高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma），NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific），PROGENE PCR擴(kuò)增儀（英國(guó)Techene），Applied Biosysterns 7500 RT-PCR Systems（美國(guó)ABI），DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠），ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad），ZEISS LSM710激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Zeiss），水平電泳槽（美國(guó)Bio-Rad）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備、分組及給藥

取蘇木、川芎各15 g，雙蒸水浸泡30 min，煎煮2次，將2次煎劑濃縮至60 mL，濃度0.25 g/mL，為高劑量藥液。另取蘇木、川芎各5 g，雙蒸水浸泡30 min，將2次煎劑濃縮至100 mL，濃度0.05 g/mL，為低劑量4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、川芎低劑量組、川芎高劑量組、蘇木高劑量組、蘇木低劑量組，每組5只，蘇木低、高劑量和川芎低、高劑量小鼠給藥劑量相當(dāng)于成人（體質(zhì)量60 kg）臨床給藥量10、30倍（成人每日臨床給藥量為蘇木、川芎各10 g）。小鼠給藥體積為200 μL/次，1次/d。

2.2 干細(xì)胞樣細(xì)胞分選

常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)PG-BE1細(xì)胞，待其生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，PBS清洗2次，重懸于含0.02 μg/mL EGF、0.02 μg/mL bFGF、5 μg/mL胰島素、2%B27、4%BSA的DMEM/F-12的培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度2×104/孔，接種于低黏附6孔板，待細(xì)胞成球且折光率變低時(shí)收集PG-BE1球細(xì)胞，離心、胰酶消化，1 mg/mL大豆胰蛋白酶抑制劑終止消化，重懸于上述完全培養(yǎng)基DMEM/F-12中。使用傳代至第3代的PG-BE1球細(xì)胞。

2.3 干細(xì)胞樣細(xì)胞鑒定

2.3.1 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 分別收集PG-BE1貼壁細(xì)胞及第3代PG-BE1球細(xì)胞，接種于96孔板，1000個(gè)/孔，分為3、4、5、6、7 d組，每組5個(gè)復(fù)孔。分別于第3、4、5、6、7日時(shí)加入Cell Counting Kit-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑，10 μL/100 μL培養(yǎng)基，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（OD）。

2.3.2 AV/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分別收集PG-BE1貼壁細(xì)胞及第3代PG-BE1球細(xì)胞，預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，并重懸于1×Binding Buffer，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL。取100 μL上述細(xì)胞懸液置于流式管中，加5 μL FITC Annexin V及5 μL PI。輕柔震蕩細(xì)胞，室溫（25 ℃）避光孵育15 min。每管加400 μL 1×Binding Buffer，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.3.3 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞ABCG2表達(dá) 分別收集PG-BE1貼壁細(xì)胞及第3代PG-BE1球細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL，接種于96孔板。24 h后，每孔依次加入4%多聚甲醛固定，0.1%Triton-X透膜，免疫熒光封閉液室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，熒光二抗避光孵育1 h，滴加DAPI避光孵育5 min，最后加入適量抗熒光淬滅封片液。

2.3.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞ABCG2、SOX-2、Nanog、OCT-4表達(dá) 分別收集PG-BE1貼壁細(xì)胞及第3代PG-BE1球細(xì)胞，提取蛋白。BCA法測(cè)定各組總蛋白濃度，分別制備濃縮膠與分離膠，加樣后分別行蛋白電泳、電轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉封閉后，一抗（稀釋倍數(shù)1∶1000）、二抗（稀釋倍數(shù)2∶1000）孵育各1 h，暗室中滴加超敏發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2.4 川芎、蘇木對(duì)裸鼠模型抑瘤率的影響

將1×107/mL濃度PG-BE1球細(xì)胞接種于裸鼠腋下，0.2 mL/只，24 h后，連續(xù)給藥21 d，小鼠脫頸處死，稱量瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）=（實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量-對(duì)照組平均瘤質(zhì)量）÷對(duì)照組平均瘤質(zhì)量×100%。

2.5 激光共聚焦檢測(cè)瘤體內(nèi)ABCG2蛋白表達(dá)

將腫瘤組織從液氮中取出，冷凍切片包埋劑包埋，置于-20 ℃冰凍切片機(jī)中待其凝固；將已凝固腫瘤組織進(jìn)行粗切片，直至露出腫瘤組織為止，切取8 μm厚度、完整的組織切片，平鋪在防脫磨砂載玻片上，室溫放置10 min；然后將玻片浸泡于4 ℃丙酮中，固定10 min；PBS沖洗3次×10 min；再將玻片浸泡于免疫封閉液中，封閉1 h；PBS沖洗3次，滴加一抗Anti-BCRP/ABCG2（按1∶100比例稀釋），4 ℃過夜；PBS沖洗3次，滴加Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG（H+L）二抗（稀釋濃度1∶200），室溫避光孵育1 h；PBS沖洗，滴加DAPI，室溫避光孵育5 min；PBS沖洗，滴加抗熒光淬滅封片液，蓋玻片封片，激光共聚焦顯微鏡拍照。

2.6 Western blot檢測(cè)腫瘤組織ABCG2蛋白表達(dá)

分別收集各組腫瘤組織，提取蛋白。用BCA法測(cè)定各組總蛋白濃度，分別制備濃縮膠與分離膠，加樣后分別行蛋白電泳、電轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉封閉后，一抗（稀釋倍數(shù)1∶1000）、二抗（稀釋倍數(shù)2∶1000）孵育各1 h后于暗室中滴加超敏發(fā)光液，于ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用Image J軟件分析各組蛋白表達(dá)量。

2.7 RT-PCR檢測(cè)腫瘤組織ABCG2基因表達(dá)

分別提取各組腫瘤組織RNA，應(yīng)用Nanodrop測(cè)定RNA濃度與純度，并驗(yàn)證RNA完整性。將提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量，檢測(cè)各組基因表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，符合正態(tài)分布用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布用秩和檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 干細(xì)胞樣細(xì)胞分選結(jié)果

接種后第3日可見細(xì)胞球形成，隨時(shí)間延長(zhǎng)，球體積變大，折光率變低，傳代至第3代的PG-BE1球細(xì)胞，見圖1。

4.2 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果

PG-BE1球細(xì)胞組第3、4、5、6、7日OD值明顯高于PG-BE1貼壁細(xì)胞（P<0.01）；以PG-BE1貼壁細(xì)胞OD值為基線，其PG-BE1球細(xì)胞第3、4、5、6、7日相對(duì)OD值分別為0.10、0.17、0.21、0.24、0.32，見圖2。

4.3 AV/PI檢測(cè)結(jié)果

PG-BE1球細(xì)胞和貼壁細(xì)胞早期凋亡率分別為0.638%、1.273%（P<0.05）；中晚期凋亡率分別為2.53%、2.78%，PG-BE1球細(xì)胞中晚期凋亡率低于PG-BE1貼壁細(xì)胞（P>0.05），見圖3。

4.4 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

PG-BE1球細(xì)胞ABCG2高表達(dá)，而PG-BE1貼壁細(xì)胞ABCG2低表達(dá)甚至不表達(dá)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4、圖5。

4.5 Western blot檢測(cè)結(jié)果

ABCG2蛋白在PG-BE1球細(xì)胞中表達(dá)量明顯高于PG-BE1貼壁細(xì)胞（P<0.05）。OCT-4、Nanog在PG-BE1貼壁細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，而在PG-BE1球細(xì)胞中可見明顯表達(dá)（P<0.05）；SOX-2在PG-BE1球細(xì)胞及貼壁細(xì)胞中表達(dá)也有明顯差異（P<0.01）。見圖6。

4.6 不同劑量川芎、蘇木對(duì)抑瘤率的影響

川芎高、低劑量組和蘇木高、低劑量組抑瘤率分別為36.26%、42.63%、24.60%、26.32%。與對(duì)照組比較，川芎高、低劑量組可明顯抑制瘤體生長(zhǎng)（P<0.05），其中川芎低劑量抑瘤率明顯高于川芎高劑量組（P<0.05）；蘇木各劑量組雖對(duì)瘤體有一定的抑制作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖7。

4.7 激光共聚焦檢測(cè)不同劑量川芎、蘇木對(duì)瘤組織ABCG2蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，蘇木各劑量組ABCG2蛋白表達(dá)無明顯差異，川芎各劑量組可明顯抑制ABCG2蛋白的表達(dá)，見圖8。

4.8 Western blot檢測(cè)不同劑量川芎、蘇木對(duì)ABCG2蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，川芎低劑量組可抑制ABCG2蛋白的表達(dá)（P<0.05），川芎高劑量組對(duì)ABCG2蛋白的表達(dá)無明顯的抑制作用；蘇木各劑量組對(duì)ABCG2蛋白表達(dá)均無抑制作用。見圖9。

4.9 RT-PCR檢測(cè)不同劑量川芎、蘇木對(duì)ABCG2 mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，除川芎低劑量組外，各給藥組對(duì)ABCG2 mRNA表達(dá)均有上調(diào)作用，見圖10。

5 討論

側(cè)群（side population，SP）細(xì)胞可以特異性地將Hoechst33342染料快速泵出細(xì)胞外。研究發(fā)現(xiàn)，SP細(xì)胞具有某些干細(xì)胞特性，如具有極強(qiáng)的自我更新及增殖能力[6]。目前，在許多組織胚胎及腫瘤細(xì)胞中，都發(fā)現(xiàn)了SP細(xì)胞的存在[7-11]。他們具有與干細(xì)胞相似的干性，如同源性、自我更新能力、多向分化潛能?；诖?，很多學(xué)者認(rèn)為SP細(xì)胞中富含干細(xì)胞，是干細(xì)胞研究的重要資源，可以作為干細(xì)胞分離、鑒定的一種方法[12]。

而SP細(xì)胞之所以可以將Hoechst33342染料泵出細(xì)胞外，是因?yàn)锳BCG2蛋白的存在。三磷酸腺苷結(jié)合盒（ATP binding cassette，ABC）超家族是一種由多種轉(zhuǎn)運(yùn)體組成的、在機(jī)體內(nèi)廣泛表達(dá)的大家族。ABCG2蛋白作為ABC家族成員之一，與SP細(xì)胞表型的表達(dá)存在密切關(guān)系，如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性可被ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑或者鈣離子通路阻滯劑所抑制，從而減少SP表型[13]。Zhou S等[14]研究發(fā)現(xiàn)，雖然不同SP細(xì)胞來源于不同的組織，但均表達(dá)ABC家族中的ABCG2/BCRP1耐藥基因，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，ABCG2/BCRP1的表達(dá)與SP細(xì)胞表型呈強(qiáng)相關(guān)，即ABCG2/BCRP1是SP細(xì)胞表型特征的決定因素。因此，認(rèn)為ABCG2蛋白可以作為另一種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物用于腫瘤干細(xì)胞的鑒定。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用無血清培養(yǎng)法獲得PG-BE1球細(xì)胞，經(jīng)抗凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)球細(xì)胞凋亡能力、CCK-8法檢測(cè)球細(xì)胞增殖能力、Western blot檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力、抗凋亡能力，高表達(dá)ABCG2、Nanog、OCT-4、SOX2等蛋白。而Nanog、OCT4、SOX2基因是干細(xì)胞中代表性標(biāo)志物，與干細(xì)胞多潛能性和自我更新能力有密切關(guān)系，是目前腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物之一。本實(shí)驗(yàn)中獲得的PG-BE1球細(xì)胞在高表達(dá)SOX2、OCT-4、Nanog蛋白的同時(shí)高表達(dá)ABCG2蛋白，表明ABCG2蛋白作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的可靠性。以上體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無血清球培養(yǎng)獲得的PG-BE1球細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞干性。

目前大量實(shí)驗(yàn)研究顯示，中藥提取物或中醫(yī)復(fù)方在殺傷腫瘤干細(xì)胞方面存在較好療效。研究發(fā)現(xiàn)異甘草素可以通過抑制腫瘤干細(xì)胞的自我更新及多向分化而明顯降低乳腺癌細(xì)胞中SP及CSC的比率[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GRP78作為異甘草素的直接作用靶點(diǎn)，異甘草素可以剪短ATP表達(dá)域中GRP78的表達(dá)，進(jìn)而抑制ATP酶的活性、促進(jìn)β-catenin降解，導(dǎo)致β-catenin/ABCG2信號(hào)通路失活；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，異甘草素可通過GRP78/β-catenin/ABCG2信號(hào)通路增強(qiáng)乳腺癌干細(xì)胞的化療敏感性，且對(duì)周圍組織及乳腺干細(xì)胞無毒副作用。姜黃素通過誘導(dǎo)ABCG2耐藥蛋白的低表達(dá)，提高乳腺癌干細(xì)胞對(duì)絲裂霉素的敏感性，達(dá)到殺傷乳腺癌干細(xì)胞、減少球細(xì)胞形成、低表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44+CD24-的目的。經(jīng)姜黃素干預(yù)的乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇、順鉑、阿霉素等化療藥的敏感性明顯提高[16]。片仔癀對(duì)SP細(xì)胞分選出的結(jié)腸癌干細(xì)胞有顯著的殺傷作用，且呈劑量依賴性。其可以抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞活性及成球能力，深入研究發(fā)現(xiàn)片仔癀對(duì)腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用與其可以抑制ABCG2 mRNA的表達(dá)有關(guān)[17]。

本研究以ABCG2蛋白作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，觀察蘇木、川芎體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的作用，經(jīng)激光共聚焦及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，低、高劑量蘇木及高劑量川芎對(duì)ABCG2蛋白并無抑制作用，而低劑量川芎可明顯抑制ABCG2蛋白的表達(dá)。故而認(rèn)為低劑量川芎對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。進(jìn)一步經(jīng)RT-PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，低劑量川芎組可明顯抑制ABCG2 mRNA的表達(dá)，其余各組對(duì)ABCG2 mRNA表達(dá)均為上調(diào)作用，Western blot與RT-PCR的結(jié)果基本一致。因此，考慮低劑量川芎對(duì)ABCG2蛋白的抑制作用可能與其抑制ABCG2 mRNA的表達(dá)相關(guān)，低劑量川芎對(duì)PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞殺傷作用可能是通過抑制ABCG2蛋白在mRNA水平的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2016-11-06）

（修回日期：2017-02-26；編輯：華強(qiáng)）